وأيد هذا العمل من قبل الجمعية الأميركية للسرطان (PF - 07 - 103 - 01 - CSM) ، والمعاهد الوطنية للصحة (R01 GM61275 وCA042014 P30) ، وسرطان الدم والغدد اللمفاوية المجتمع ، ومؤسسة هنتسمان للسرطان.

ترنسفكأيشن سيرنا وإعداد الخلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4 إعداد جيد LabTek ساترة غرف الثاني بإضافة 0.5mL من فبرونيكتين (10μg/mL) إلى كل بئر التي سيتم استخدامها. احتضان لمدة 10-15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد سيرنا / Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) مجمعات للترنسفكأيشن العكسي وفقا لتعليمات الصانع ق. استخدام المبالغ الموصى بها لمدة جيدا طبق بشكل جيد في 24 دائرة لاستخدامها (100μL المجموع). يمكن أن تكون بديلا منتج مماثل / بروتوكول للترنسفكأيشن سيرنا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة فبرونيكتين من الآبار ساترة للغرف. إضافة 100μL من سيرنا / مجمعات RNAiMAX Lipofectamine إلى كل بئر التي سيتم استخدامها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة 20000 هيستون H2B - mCherry ، معربا عن الخلايا (في 500μL) لكل تحتوي على خليط ترنسفكأيشن جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح لاحتضان خلايا لمدة 24 ساعة قبل استبدال ~ ترنسفكأيشن مع خليط من 1mL الخلية العادية المتوسطة الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان خلايا إضافية قبل 24 ساعة من الحصول على الصور (48 ساعة بعد ترنسفكأيشن). </li></ol> الإعداد المجهر والحصول على الصور <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هناك ثلاثة أجزاء رئيسية لاكتساب صورة الإعداد : 1) خلية الحاضنة التي تناسبها على المسرح المجهر ويحافظ على البيئة الرطبة ثابت من 37 درجة مئوية ، وأول أكسيد الكربون بنسبة 5 ٪ 2 ، 2) مجهر مقلوب مجهزة مرحلة الآلي ، الآلي ومضان brightfield مصاريع ، وعجلات تصفية الآلي ، و 3) مجموعة من البرامج التي تدمج الضوابط والمسرح ، مصاريع ، وعجلات التصفية. في الإعداد والتصوير لدينا ، ونحن نستخدم زنزانة مخصصة من مختبر الحاضنة أوكو التي يمكن استخدامها مع ساترة LabTek غرف الثانية. يتم التحكم في هذه المرحلة ، ومصاريع ، وعجلات تصفية حسب البرنامج Metamorph تلميح : المختبر أوكو مرحلة قمة النظام حاضنة تضم محولات لمجموعة متنوعة من لوحة مختلفة ، صحن ، أو أحجام ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> موقف ساترة LabTek غرف الثاني في الحاضنة عن طريق فتح غطاء الحاضنة قبل تحسنت ومعايرتها ، واضعا في غرف ساترة المحول ، وعقد في مكان مع الطين النمذجة. ترك غطاء على ساترة غرف بحيث مستنبت الخلية لن تجف. إغلاق الغطاء والحاضنة الموقف كله على المسرح المجهر ، وضمان أن يتم عقد الحاضنة ثابتا في مكانه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Metamorph به ، إعداد التجربة الخاصة بك عن طريق اختيار &quot;تطبيقات / اقتناء المتعددة الأبعاد&quot; في شريط القوائم من البرنامج. وهذا سيجلب لك نافذة يمكنك من خلاله تحديد وتيرة وطول timelapse ، ومدة التعرض لكل لون (إذا فعل إعدادات متعددة) ، وعدد وموقع من مواقع المرحلة ، وعدد من المقاطع ض (إذا ) المطلوب. . حدد مكان حفظ ملفات البيانات تلميح : في حالة استخدام برامج أخرى من Metamorph ، وظائف قد تكون مختلفة قليلا ، ولكن المفهوم العام هو نفسه. Micromanager مصدر اقتناء البرمجيات مفتوحة ImageJ مقرها متوافق مع معظم الأجهزة الاجهزة ، هو بديل ممتاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> . لأغراض هذا البروتوكول ، سوف نقوم الحصول على صور على اثنين من موجات (brightfield وmCherry) كل 15 دقيقة لمدة 8 ساعات في المواقف المرحلة 15 تلميح : إذا كان المطلوب هو أفضل وقت القرار ، ثم يمكنك تقصير الفاصل الزمني بين عمليات الاستحواذ ، ولكن ويمكن استخدام عدد أقل من المناصب المرحلة ، وبالتالي أقل الخلايا الإنقسامية ستكون متاحة للتحليل. من المهم عند النظر إلى فترات زمنية تأخذ بعين الاعتبار الوقت اللازم لتصفية عجلة للتبديل بين مجموعات التصفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الوقت الأمثل لتعرض كل الطول الموجي من خلال التركيز أولا على حقل من الخلايا باستخدام brightfield الإضاءة. في البرنامج ، وضبط وظيفة ضبط تلقائي للصورة فقط للقناة brightfield (وهذا سوف يسمح البرنامج لضبط تلقائي في كل موقف قبل كل مرحلة الاستحواذ) تلميح : نحن نستخدم 40X الجافة المرحلة على النقيض من الهدف لاعطاء القرار الممتاز من دون الحاجة للنفط . ويمكن استخدام الأهداف الأخرى تبعا لقرار البصرية المطلوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل إلى الطول الموجي mCherry والمفاجئة صورة باستخدام التعرض مللي ثانية 50. ضبط الوقت التعرض إلى الحد الأدنى المطلوب لترى صورة جيدة. فمن الضروري تحديد مقدار التعرض للضوء لضمان استمرار بقاء الخلية. كقاعدة عامة ، يمكن أن يتحقق هذا أفضل باستخدام فلتر الكثافة محايدة (للحد من تدفق ضوء الإثارة) ، والتعرض الكاميرا وقتا أطول وليس من خلال زيادة قوة الاضاءة. كرر هذا الإجراء عن أي موجات إضافية لاستخدامها تلميح : لتحديد بقاء على الأجل الطويل في التعرض الخلية نظرا لتجربتك ، يمكنك معاينة عدد من الصور خلية يمكن البقاء على قيد الحياة على مدى timelapse المرجوة من خلال تعديل مؤقتا التباعد timepoint من دقيقة إلى ثانية (أي 10 دقيقة. تصبح 10 ثانية). إذا خلاياك البقاء التعرض 100-200 (أوالعدد المناسب) ، ثم تعرض على ما يرام. إن لم يكن ، والحد من نورك الإثارة ، ووقت التعرض ، أو العدد الكلي من الصور لمحاكاة التجربة كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل ، وحدد علامة عدد مناسب من مواقف مرحلة بحيث يمكنك تحقيق عينات كافية من السكان الخلية. سوف Metamorph تسجيل المواقف وسوف يعود هناك لاقتناء كل تلميح : عموما أنا أحاول العثور على المواقع التي يوجد الكثير من الخلايا إلى صورة ، ولكن ليست كثيرة بحيث تكون كثيفة جدا. أيضا ، فمن المهم لتحديد المواقف بما فيه الكفاية بحيث سيكون لديك فرصة جيدة لمراقبة عدد كبير من الخلايا تتقدم من خلال الانقسام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن تم تسجيل جميع timelapse ، والطول الموجي وقت التعرض ، ومرحلة معلومات الموقع ، حدد &quot;معاينة&quot; زر على الشاشة لتحديد ما إذا كان البرنامج هو السيطرة على المعدات بشكل مناسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذات مرة كنت راضيا ، حدد &quot;الحصول على&quot; زر على الشاشة لبدء الشراء. ثم نسترخي والسماح للكمبيوتر ومجهر للقيام بهذا العمل تلميح : لاحظ من خلال الأتمتة واحد على الأقل جولة كاملة من اقتناء لضمان أن كل شيء يعمل بشكل صحيح. </li></ol> معالجة الصور وتحليلها <ol start="16" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد انتهاء عملية الاستحواذ ، فإن الخطوة التالية هي لنقل بيانات الصورة إلى شكل يمكن أن يكون أسهل في التعامل معها. لأغراض هذا البروتوكول ، وسوف يثبت أولا كيفية إنشاء الأفلام باستخدام Metamorph ، ثم كيفية توليد صورة مركبة باستخدام برنامج ImageJ. فإما أن يكون مفيدا تنسيق لأغراض القياس الكمي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخطوة الأولى هي مراجعة البيانات. للقيام بذلك ، حدد &quot;تطبيقات / مراجعة بيانات متعددة الأبعاد&quot; في شريط القائمة. حدد موقع الملفات الخاصة بك ، ثم اختر &quot;عرض&quot;. هذا سيسمح لك لاستعراض كومة من الصور من كل مرحلة على حدة الموقف. حدد موقف المرحلة المطلوب ، ثم &quot;تحميل الصور&quot;. سوف تكون قادرة على النهوض من خلال بيانات الإطار حسب الإطار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتلك المناصب المرحلة التي تمر خلايا الانقسام (على النحو الذي يحدده كل من الحمض النووي والتشكل الخلوي) ، يمكنك صنع أفلام والمونتاج باستخدام Metamorph ، أو مع برامج أخرى مثل ImageJ (متوفرة مجانا من خلال المعاهد الوطنية للصحة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجعل الفيلم في Metamorph ، حدد &quot;عملية / حفظ الفيلم&quot; في شريط القائمة. هل سيكون قادرا على تحديد الأطر التي الاستخدام ، والسرعة ، ونوع ملف الفيلم. ثم حدد &quot;حفظ الفيلم&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإجراء المونتاج ، وأنا كومة حفظ الصور كملف STK. ، والتي يمكن استخدامها في برامج أخرى مثل ImageJ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح الملف في ImageJ وتطوير الأطر حتى تجد خلية يمر الانقسام. . محصول محيط الخلية وحدد &quot;صورة / مكرر&quot; تلميح : تأكد لجميع الأطر مكررة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإجراء المونتاج ، حدد &quot;صورة / الأكوام / اصنع مونتاج&quot; في شريط القائمة. هنا يمكنك تحديد الأطر التي تريد تضمينها ، وحجم وشكل المونتاج ، وإذا كنت تريد الحدود بين الإطارات. حدد هذه وضرب &quot;حسنا&quot;. . المونتاج حفظ كملف TIF والقيام بأي مزيد من المعالجة إما في ImageJ أو أدوبي فوتوشوب تلميح : تغيير الملفات المونتاج من تنسيق 16 بت المستخدمة من قبل Metamorph إلى 8 بت صيغة لمعالجة الصور أسهل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحساب الوقت في مراحل مختلفة من الانقسام ، وتحديد ر = 0 (أول بادرة من التكثيف الحمض النووي أو التقريب الخلية) ، حساب عدد من الإطارات حتى تتماشى الكروموسومات عند خط الاستواء (التوقيت في الطور الأول / طليعة الطور) ، إطارات حتى تبدأ لفصل الصبغيات (الكروموسومات) (التوقيت في الطورية) ، والإطارات حتى تبدأ الخلايا لتتسطح (طور الصعود / الطور النهائي / الحرائك الخلوية). الوقت محسوب في كل مرحلة الإنقسامية يعتمد على الفاصل الزمني بين كل إطار. </li></ol> ممثل النتائج <img src="/files/ftp_upload/1878/1878fig1tmb.jpg" border="0" /> الشكل 1 يوضح النتائج من تجربة نموذجية تحكم ترنسفكأيشن باستخدام خط سيرنا الخلية هيلا معربا عن هيستون H2B - mCherry. وقد استخدمت هذه الطريقة في تحديد توقيت بفعالية الإنقسامية ، وكشف عن دور غير متوقعة للNup153 nucleoporin في توقيت متأخر الانقسام 1. الرجاء <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/1878/1878fig1.jpg">انقر هنا</a> لرؤية نسخة أكبر من الرقم 1.

<ol>
	<li>Mackay, D. R., Elgort, S. W., Ullman, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleoporin+Nup153+has+separable+roles+in+both+early+mitotic+progression+and+the+resolution+of+mitosis.">The nucleoporin Nup153 has separable roles in both early mitotic progression and the resolution of mitosis.</a> Mol Biol Cell. 20, 1652-1660 (2009).</li><li>Khodjakov, A., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+division+process+in+living+tissue+culture+cells.">Imaging the division process in living tissue culture cells.</a> Methods. 38, 2-16 (2006).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2, 905-909 (2005).</li><li>Meraldi, P., Draviam, V. M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+and+checkpoints+in+the+regulation+of+mitotic+progression.">Timing and checkpoints in the regulation of mitotic progression.</a> Dev Cell. 7, 45-60 (2004).</li><li>Mora-Bermudez, F., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+structural+dynamics+of+chromosomes+in+living+cells+by+fluorescence+microscopy.">Measuring structural dynamics of chromosomes in living cells by fluorescence microscopy.</a> Methods. 41, 158-167 (2007).</li><li>Prosser, S. L., Fry, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+imaging+of+the+centrosome+cycle+in+mammalian+cells.">Fluorescence imaging of the centrosome cycle in mammalian cells.</a> Methods Mol Biol. 545, 165-183 (2009).</li><li>Malureanu, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BubR1+N+terminus+acts+as+a+soluble+inhibitor+of+cyclin+B+degradation+by+APC/C(Cdc20)+in+interphase.">BubR1 N terminus acts as a soluble inhibitor of cyclin B degradation by APC/C(Cdc20) in interphase.</a> Dev Cell. 16, 118-131 (2009).</li><li>Anderson, D. J., Hetzer, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reshaping+of+the+endoplasmic+reticulum+limits+the+rate+for+nuclear+envelope+formation.">Reshaping of the endoplasmic reticulum limits the rate for nuclear envelope formation.</a> J Cell Biol. 182, 911-924 (2008).</li><li>Beaudouin, J., Gerlich, D., Daigle, N., Eils, R., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+envelope+breakdown+proceeds+by+microtubule-induced+tearing+of+the+lamina.">Nuclear envelope breakdown proceeds by microtubule-induced tearing of the lamina.</a> Cell. 108, 83-96 (2002).</li><li>Marcus, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+spindle+behavior+using+confocal+microscopy.">Visualization of spindle behavior using confocal microscopy.</a> Methods Mol Med. 137, 125-137 (2007).</li><li>Steigemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aurora+B-mediated+abscission+checkpoint+protects+against+tetraploidization.">Aurora B-mediated abscission checkpoint protects against tetraploidization.</a> Cell. 136, 473-484 (2009).</li><li>Draviam, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+genomic+screen+identifies+a+role+for+TAO1+kinase+in+spindle-checkpoint+signalling.">A functional genomic screen identifies a role for TAO1 kinase in spindle-checkpoint signalling.</a> Nat Cell Biol. 9, 556-564 (2007).</li><li>Neumann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+RNAi+screening+by+time-lapse+imaging+of+live+human+cells.">High-throughput RNAi screening by time-lapse imaging of live human cells.</a> Nat Methods. 3, 385-390 (2006).</li><li>Stegmeier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaphase+initiation+is+regulated+by+antagonistic+ubiquitination+and+deubiquitination+activities.">Anaphase initiation is regulated by antagonistic ubiquitination and deubiquitination activities.</a> Nature. 446, 876-881 (2007).</li></ol>

مع التطورات الحديثة في مجال التصوير والتكنولوجيا بروتين فلوري ، أصبح التصوير يعيش الجانب الروتيني للتحليل الخلوي 2. مجموعة متنوعة من GFP (ومتغيرات الألوان الأخرى 3) الموسومة البروتينات متوفرة على نطاق واسع أو سهلة نسبيا لبناء ويمكن استخدامها لتعقب عدد من بصمات انقسام الخلايا بما في ذلك الحمض النووي / ديناميات كروموسوم 4 و 5 و 6 ازدواجية الجسيم المركزي ، cyclin B ديناميات 7 ، وانهيار المغلف النووية وإعادة التجميع 8 ، 9 ، 10 الإنقسامية تشكيل المغزل ، ومراحل مختلفة من الحرائك الخلوية 11. ويمكن استخدام البروتينات الموسومة بمفرده أو بالاشتراك عند الأطياف الإثارة / انبعاث به نيون متوافقة ، مما يسمح بتقييم التنسيق بين أحداث معينة. إذا كان قرار زيادة المكانية و / أو الزمان هو / هي المطلوبة ، سواء المجهري متحد البؤر المسح الضوئي ويمكن استخدام الليزر ، وقرص الغزل ، أو بالرنين المسح الضوئي ، وقائمة من الخيارات المجهري متطورة مع التزايد المستمر القرار ما زال ينمو. كما تم تصوير حي لالانقسام في الخلايا الثديية تكييفها للاستخدام في الإنتاجية العالية ورني شاشات جزيء صغير 12-14. وهكذا ، بينما التجارب الأولية ليالي one باستخدام هذه التقنية قد تكون بسيطة نسبيا ، وإمكانيات بناء على هذه الاستراتيجية هي واسعة النطاق.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Lipofectamine RNAiMAX</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>13778-075</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lab Tek II Chambered Coverglass (4-well)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>12-565-337</td>
<td>Additional chamber sizes are available</td>
</tr>
<tr>
<td>Fibronectin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>F1141</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stage-top cell incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>OKO Lab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Can use any appropriate chamber</td>
</tr>
<tr>
<td>Automated inverted fluorescence microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Can use any appropriate microscope</td>
</tr>
<tr>
<td>Software package</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Metamorph</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Can use any appropriate software</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

time-lapse imaging of mitosis after sirna transfection

ويجري تنسيق محكم التغييرات في التنظيم الخلوي الصبغي والديناميات التي تحدث أثناء الانقسام الميراث لضمان دقة المحتوى الجيني والخليوي. يمكن أن تكون السمة المميزة للأحداث الانقسام ، مثل الحركة كروموسوم ، تعقبها بسهولة على أساس الخلايا الفردية باستخدام الوقت الفاصل بين المجهري مضان من خطوط الخلايا الثديية محددة معربا عن GFP الموسومة البروتينات. بالاشتراك مع رني المستندة إلى نضوب ، وهذا يمكن أن يكون وسيلة قوية للوقوف على المرحلة (ق) من حيث الانقسام العيوب تحدث بعد أن تم خفض مستويات بروتين معين. في هذا البروتوكول ، فإننا نقدم وسيلة أساسية لتقييم تأثير المواد المستنفدة بروتين الإنقسامية التنظيمية المحتملة على توقيت الانقسام. وtransfected الخلايا مع سيرنا ، وضعت في غرفة الحضانة مرحلة أعلى ، والتقط باستخدام المجهر مضان الآلي. نحن تصف كيفية استخدام البرمجيات لإقامة تجربة مرور الزمن ، وكيفية عملية تسلسل الصور لجعل إما لا تزال صورة المونتاج أو الأفلام ، وكيفية قياس وتحليل توقيت مراحل الإنقسامية باستخدام خلية خط معربا عن mCherry - الموسومة H2B هيستون. أخيرا ، نحن مناقشة اعتبارات هامة لتصميم تجربة مرور الزمن. هذه الاستراتيجية هي مكملة لنهج أخرى ، ويقدم مزايا 1) حساسية للتغيرات في الحركية التي قد لا تكون لوحظ عند النظر إلى الخلايا كما يبلغ عدد سكانها والتحليل 2) من الانقسام من دون الحاجة إلى مزامنة دورة الخلية باستخدام علاجات دوائية. المعلومات البصرية من تجارب التصوير هذه ، ليس فقط يسمح بتقييم مراحل فرعية من الانقسام ، ولكن يمكن أيضا أن توفر نظرة غير المتوقعة التي لن يكون واضحا من تحليل دورة الخلية عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية.

Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection at JoVE.com

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

نحن هنا وصف بروتوكول الأساسية للصورة وتحديد توقيت الإنقسامية من الخلايا الحية الثدييات زراعة الأنسجة بعد ترنسفكأيشن سيرنا.

الوقت الفاصل بين التصوير من الانقسام الميتوزي بعد ترنسفكأيشن سيرنا

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

time-lapse-imaging-of-mitosis-after-sirna-transfection

Research

JoVE Journal

Biology

16.9K Views.  University of Utah. نحن هنا وصف بروتوكول الأساسية للصورة وتحديد توقيت الإنقسامية من الخلايا الحية الثدييات زراعة الأنسجة بعد ترنسفكأيشن سيرنا.

Video: Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

رصد أكتين التفكيك مع مرور الزمن الميكروسكوب

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

ثنائي الفوتون axotomy والوقت الفاصل بين التصوير مبائر يعيش في الأجنة الزرد

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound transgenic fish which express different fluorescent reporters in neighboring cell types provide a means of following cellular interactions 2 and/or tissue-level responses to experimental manipulations over time. In this video, we demonstrate methods that can be used for imaging multiple transgenically labeled cell types serially in individual fish over time courses that can span from minutes to several days. The techniques described are applicable to any study seeking to correlate the "behavior" of neighboring cells types over time, including: 1) serial 'catch and release' methods for imaging a large number of fish over successive days, 2) simplified approaches for separating fluorophores with overlapping excitation/emission profiles (e.g., GFP and YFP), 3) use of hypopigmented mutant lines to extend the time window available for high-resolution imaging into late larval stages of development, 4) use of membrane targeted fluorescent reporters to reveal fine morphological detail of individual cells as well as cellular details in larger populations of cells, and 5) a previously described method for chemically-induced ablation of transgenically targeted cell types; i.e., nitroreductase (NTR) mediated conversion of prodrug substrates, such as metronidazole (MTZ), to cytotoxic derivatives 3,5.
As an example of these approaches, we will visualize the ablation and regeneration of a subtype of retinal bipolar neuron within individual fish over several days. Simultaneously we will monitor several other retinal cell types, including neighboring non-targeted bipolar cells and potential degeneration-stimulated retinal stem cells (i.e., M&#971;ller glia). This strategy is being applied in our lab to characterize cell- and tissue-level (e.g., stem cell niche) responses to the selective loss and regeneration of targeted neuronal cell types.

In this video, techniques for multicolor confocal time-lapse imaging and targeted cell ablation are provided. Time-lapse imaging is used to monitor the behavior of multiple cell types of interest in vivo. Targeted cell ablation facilitates the study neural circuit function and cell-specific neuronal regeneration paradigms.

متعدد الألوان الوقت الفاصل بين التصوير من اسماك الزرد المعدلة وراثيا : تصور الخلايا الجذعية الشبكية تفعيلها من خلال الخلية المستهدفة تذرية متعلق بالخلايا العصبية

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

الوقت الفاصل بين مرحلة التطور الجنيني المبكر من الميكروسكوب في انواع معينة ايليجانس

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

التحليل الكمي للهجرة عشوائية من الخلايا باستخدام الوقت الفاصل بين الميكروسكوب فيديو

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

على المدى الطويل، عالية الدقة الفاصل الزمني متحد البؤر التصوير من<em&gt; الطفلق ل arabidopsis</em&gt; البشرة خلال إنبات

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

عالية الدقة التصوير الوقت الفاصل بين وتحليل الآلي للأنيبيب حيوية في المعيشة السري الإنسان خلايا الوريد غشائي

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is regulated spatially and temporally. The use of a fluorescent gene under the control of an immunity-related promoter in combination with an automated fluorescence microscopy is a simple way to understand spatiotemporal regulation of plant immunity. In contrast to the root tissues that have been used for a number of various intravital fluorescent imaging experiments, there exist few fluorescent live-imaging examples for the leaf tissues that encounter an array of airborne microbial infections. Therefore, we developed a simple method to mount leaves of Arabidopsis thaliana plants for live-cell imaging over an extended period of time. We used transgenic Arabidopsis plants expressing the yellow fluorescent protein (YFP) genefused to the nuclear localization signal (NLS) under the control of the promoter of a defense-related marker gene, Pathogenesis-Related 1 (PR1). We infiltrated a transgenic leaf with Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (avrRpt2) strain (Pst_a2) and performed in vivo time-lapse imaging of the YFP signal for a total of 40 h using an automated fluorescence stereomicroscope. This method can be utilized not only for studies on plant immune responses but also for analyses of various developmental events and environmental responses occurring in leaf tissues.

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

We report a simple and versatile method for performing fluorescent live-imaging of Arabidopsis thaliana leaves over an extended period of time. We use a transgenic Arabidopsis plant expressing a fluorescent reporter gene under the control of an immunity-related promoter as an example for gaining spatiotemporal understanding of plant immune responses.

أسلوب متعدد الاستخدامات لتركيب نبات يترك لتصوير الوقت الفاصل بين إينترافيتال

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and several essential mitochondrial polypeptides. Mitochondrial nucleoids divide and distribute within the dynamic mitochondrial network that undergoes fission/fusion and other morphological changes. High resolution live fluorescence microscopy is a straightforward technique to characterize a nucleoid&#39;s position and motion. For this technique, nucleoids are commonly labeled through fluorescent tags of their protein components, namely transcription factor a (TFAM). However, this strategy needs overexpression of a fluorescent protein-tagged construct, which may cause artifacts (reported for TFAM), and is not feasible in many cases. Organic DNA-binding dyes do not have these disadvantages. However, they always show staining of both nuclear and mitochondrial DNAs, thus lacking specificity to mitochondrial nucleoids. By taking into account the physico-chemical properties of such dyes, we selected a nucleic acid gel stain (SYBR Gold) and achieved preferential labeling of mitochondrial nucleoids in live cells. Properties of the dye, particularly its high brightness upon binding to DNA, permit subsequent quantification of mitochondrial nucleoid motion using time series of super-resolution structured illumination images.

The protocol describes specific labeling of mitochondrial nucleoids with a commercially available DNA gel stain, acquisition of time lapse series of live labeled cells by super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM), and automatic tracking of nucleoid motion.

وضع علامات محددة من النيوكليويدات الميتوكوندريا لمرور الوقت المجهر الإضاءة منظم

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because the larval body wall and most internal organs are transparent. However, continuous live imaging of intact Drosophila larvae for longer than 30 min has been challenging because it is difficult to noninvasively immobilizeimmobilizing larvae for a long time. Here we present a larval mounting method called LarvaSPA that allows for continuous imaging of live Drosophila larvae with high temporal and spatial resolution for longer than 10 hours. This method involves partially attaching larvae to the coverslip using a UV-reactive glue and additionally restraining larval movement using a polydimethylsiloxane (PDMS) block. This method is compatible with larvae at developmental stages from second instar to wandering third instar. We demonstrate applications of this method in studying dynamic processes of Drosophila somatosensory neurons, including dendrite growth and injury-induced dendrite degeneration. This method can also be applied to study many other cellular processes that happen near the larval body wall.

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

This protocol describes a method for mounting Drosophila larvae to achieve longer than 10 h of uninterrupted time-lapse imaging in intact live animals. This method can be used to image many biological processes close to the larval body wall.

LarvaSPA، طريقة لتركيب Drosophila Larva للتصوير على المدى الطويل الفاصل الزمني

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because ...