نحن ممتنون لمركز جامعة ولاية أوهايو الشامل للسرطان لتوفير التمويل اللازم لهذا العمل.

1. الخط الخلوي مع الركيزة التوحد المتكاملة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحولت ستابلي الخلايا هيلا مع PDR - GFP (7 البلازميد هدية من Jasin M. ، ميموريال سلون كيترينج للسرطان) والاحتفاظ بها في بوروميسين لاختيار transformants. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وpassaged الخلايا في DMEM / FBS ، تحتوي على 10 ٪ مصل بقري جنيني ، 2 مم GlutaMAX ، 1 البيروفات الصوديوم مم ، البنسلين / ستربتوميسين (100 U / mL/0.1 ملغ / مل) ، و 1.5 ميكروغرام بوروميسين / مليلتر. </li></ol> الركيزة إعادة التركيب في GFP - PDR البلازميد ، وtransformants مستقرة ، ويحتوي على اثنين من الأليلات نشط GFP (الشكل 1). أليل واحد غير نشطة نظرا لإدراجها في سلسلتها ترميز تقييد غليان 18 موقع لانزيم الاعتراف SCEI - I. التعبير عن I - SCEI في هذه الخلايا بإنشاء كسر الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل (DSB). هناك أليل الثاني من GFP نشط في هذا الحمض النووي ، ولكن جزء من تسلسل لها ارتباط مع موقع I - SCEI على أليل الأول هو من النوع البري. وهذا يمكن أن أليل GFP second بمثابة تسلسل المانحة لإعادة التركيب مثلي إصلاح جهاز تسوية المنازعات ، وسوف ينتج الأليل GFP النشطة ، والتي تم الكشف بسهولة عن طريق التدفق الخلوي. بدلا من ذلك ، يمكن اصلاحها جهاز تسوية المنازعات عن طريق امتماثلان نهاية الانضمام ، التي من شأنها أن تدمر موقع تقييد I - SCEI وسيؤدي في GFP سلبية الخلايا. يتم تحديد مستوى من إعادة التركيب مثلي في خلية عن طريق حساب النسبة المئوية للGFP إيجابية الخلايا. وقد تم اختيار هذا الخط الخلية ، pHeLa DR13 - 9 - ، من بين جميع الحيوانات المستنسخة لصفر خلفية إشارة GFP ونسبة عالية نسبيا من الخلايا GFP إيجابية على ترنسفكأيشن مع I - SCEI معربا عن البلازميد ، pCBASce. (تم تزويد كل من pCBASce وسيطرتها النواقل ، pCAGGS ، بواسطة M. Jasin من مركز ميموريال سلون كيترينج للسرطان). خط هيلا DR13 - 9 - الخلية هو متاح من الكتاب بناء على الطلب. 2. ترنسفكأيشن المستنفدة لBRCA1 الذاتية وإضافة عودة BRCA1 المسخ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل يوم من ترنسفكأيشن الأولى (عادة الثلاثاء) : تبدأ مع صحن 10 سم من هيلا DR13 - 9 - متموجة لا يقل عن 90 ٪ الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعرض للتريبسين في 1 مل ووقف رد الفعل بإضافة 9 مل DMEM / FBS ، ومزيج جيد من قبل pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 40 ميكرولتر من الخلايا trypsinized لكل بئر من 24 لوحة جيدا في 0.5 مل من بورصة دبي للطاقة / FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم 1 transfections (الأربعاء) : يجب أن تكون الخلايا ~ متموجة 40-50 ٪ ، وإن كانت أقل بكثير البدء من جديد. Transfect عن طريق المزج : 5 سيرنا بمول + 0.3 ميكروغرام BRCA1 - متحولة معربا عن الحمض النووي البلازميد في 12.5 ميكرولتر OPTI - MEM ؛ و 0.5 ميكرولتر Lipofectamine 2000 في 12.5 ميكرولتر OPTI - MEM. المضي قدما في ترنسفكأيشن وفقا لبروتوكول Lipofectamine (Invitrogen). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال 4-6 ساعات وسائل الاعلام في وقت لاحق. يستند سيرنا نستخدمها لاستنزاف BRCA1 على تحديد تسلسل GCUCCUCUCACUCUUCAGU BRCA1 3&#39; UTR - 80780 إلى 80798 متواليات (انضمام عدد AY273801). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم 2 : نقل الخلايا trypsinizing من لوحة البئر 24 إلى لوحة 6 جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم 3 transfections : 25 سيرنا بمول + 0.75 ميكروغرام BRCA1 ، معربا عن متحولة DNA البلازميد + 0.75 ميكروغرام pCBASce (أو pCAGGS مكافحة ناقلات) 62.5 في ميكرولتر OPTI - MEM و 2.5 ميكرولتر Lipofectamine 2000 في 62.5 ميكرولتر OPTI - MEM. استبدال 4-6 ساعات وسائل الاعلام في وقت لاحق. </li></ol> 3. تحليل Transfectants. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 6 ، يعرض للتريبسين الخلايا من كل بئر ووقف في DMEM مل 1 / FBS. يمكن تحليل الخلايا للتعبير GFP يمكن القيام به على 5 أو 7 أيام ، لكننا نجد في ذلك اليوم 6 يعمل بشكل أفضل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10000 تحليل الخلايا بشكل جيد من قبل في التدفق الخلوي. نستخدم أداة بيكتون ديكنسون FACSCalibur في جامعة ولاية أوهايو الشامل للسرطان مركز الموارد التحليلية المشتركة الخلوي. واحدة ، هي بوابات الخلايا الحية باستخدام المعلمات مبعثر إلى الأمام والجانب. تم الكشف عن GFP إيجابية الخلايا باستخدام كاشف مضان GFP (FL1) ، وتعرض النتائج على النحو الرسم البياني (الشكل 2 ، أسفل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن replated خلفها الخلايا بواسطة المجهر للتصوير الفوتوغرافي مضان إذا رغبت في ذلك. </li></ol> 4. ممثل النتائج : BRCA1 ينظم الطريق لإصلاح الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل فواصل تأشب مثلي 6،11. يتم الكشف عنها بسهولة تلك الخلايا التي خضعت لإعادة التركيب من خلال إصلاح مثلي بواسطة المجهر مضان (الشكل 2 ، وأعلى). نضوب BRCA1 النتائج إلى انخفاض في GFP إيجابية الكشف عن الخلايا (الشكل 2 ، يمين). الإخراج من FACSCalibur هو الرسم البياني مع كثافة GFP لكل خلية على المحور X وعدد من الخلايا على المحور Y (الشكل 2 ، أسفل). في مجموعة نموذجية من النتائج من تجربة واحدة ، وكان 15.5 ٪ من الخلايا GFP - I - ايجابية بعد SCEI التعبير والرقابة رني استنفاد (الشكل 3). بالمقارنة ، إضافة خفض استنزاف BRCA1 وناقلات الظهر GFP تحويل إلى 0.7 ٪. إضافة الى الوراء البرية من نوع BRCA1 أو BRCA1 (I21V) تأشب استعادة مثلي تماما ، كما كشف عن طريق الحصول على 15-16 ٪ GFP إيجابية الخلايا. إضافة الى الوراء من M1 (BRCA1وكان 8T) متحولة (الشكل 3 ، لين 5) الأثر المماثل كما ظهر الإضافة من مكافحة النواقل. لأن هذا البديل وأعرب عند مستويات مماثلة لهذا البروتين الذاتية 9 ، وبالتالي لنا أن نفسر (M18T) BRCA1 البديل هو غير وظيفية في إعادة التركيب مثلي. لدينا عادة 10-20 ٪ من الخلايا لتحويل GFP إيجابية بعد transfecting التعبير I - SCEI البلازميد. نضوب BRCA1 يقلل بتكاثر تحويل GFP إيجابية الخلايا بنحو 80-10 ضعفا. على الرغم من أن النسب الفعلية لGFP إيجابية الخلايا قد تتغير من تجربة لتجربة ، فإن نسبة GFP إيجابية الخلايا التالية استنفاد BRCA1 النسبي لاستنزاف السيطرة داخل تجربة متناسقة تماما. نحن تطبيع النتائج من خلال تحديد سعر التحويل غير مأهولة إلى 100 ٪ ، وأعرب عن النتائج مع استنفاد BRCA1 وإضافة ظهورهم ، كنسب مئوية. بهذه الطريقة ، يمكننا الجمع بين التجارب المتعددة ، والاختلاف التجريبية ليست عالية. إضافة الخلفي من المسوخ BRCA1 حتى الآن أسفرت عن نتائج قوية : كل متغير BRCA1 إما استعادة النشاط الكامل مثلي إعادة التركيب أو لم يكن لها أي تأثير. وهو عامل مهم في الحصول على هذه النتائج هو أن الظروف ترنسفكأيشن لدينا انتاج مستويات البروتين BRCA1 التي متساوية تقريبا تركيز هذا البروتين في الخلايا غير المعالجة الذاتية. قد عالية جدا من overexpression من متحولة ولو عيب من BRCA1 نتيجة ايجابية في بعض النشاط تأشب مثلي. وهناك مشكلة أننا بحاجة للتغلب على سمية ترنسفكأيشن. يمكن استنفاد BRCA1 بطء نمو الخلايا نفسها ، ويجب أن يعقد على توازن الحمض النووي Lipofectamine - 2000 والبلازميد النسبي لعدد من الخلايا في الطبق عند مستوى ثابت. والحمض النووي للغاية Lipofectamine البلازميد كثيرا أو خفض عدد الخلايا ، وعدد من الخلايا لن تكون كافية للحصول على نتائج موثوقة التدفق الخلوي. رصيد الكواشف البلازميد وLipofectamine مقابل عدد الخلايا transfected مهم جدا للحفاظ على سلامة الخلايا. <img src="/files/ftp_upload/2468/2468fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. الركيزة إعادة التركيب. وصفت الاستراتيجية التي تم وضعها من قبل مجموعة من Jasin 7،12 م. وPDR - GFP البلازميد يحتوي على اثنين من GFP الأليلات المعيبة ، واحد منها يحتوي على نوكلياز داخلية تقييد I - SCEI الموقع. خط هيلا الخلية المستمدة الحمض النووي يحتوي على هذه الركيزة متكاملة في موقع واحد في الجينوم 9 ، ونشط في إصلاح الحمض النووي كسر المزدوج تقطعت بهم السبل في موقع I - SCEI إعادة التركيب من خلال النتائج متماثلة في تحويل واحد أليل لGFP إيجابية. <img src="/files/ftp_upload/2468/2468fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. الكشف عن GFP إيجابية الخلايا بواسطة المجهر مضان. تم اختبار الخلايا كما في هذا البروتوكول ، وضبط خلايا المنضب كانت نشطة في إعادة التركيب مثلي ، على النحو الذي كشف على نسبة عالية من الخلايا مع التعبير GFP (يسار). نضوب BRCA1 بواسطة رني النتائج إلى انخفاض حاد في عدد GFP إيجابية الخلايا (يمين). <img src="/files/ftp_upload/2468/2468fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. النتائج من الظهير إضافة مغلطة BRCA1 من المسوخ. وتظهر النتائج من تجربة واحدة في هذا الرسم البياني. في غياب transfected I - SCEI معربا عن البلازميد (حارة 1) عدم وجود خلايا GFP إيجابية الكشف عنها. وقد اتخذت جميع النتائج في الممرات 2-6 من الخلايا التي تم transfected في I - SCEI معربا عن البلازميد في اليوم 3. في الخلايا التي تم استنفاد عن جين ذي صلة (luciferase) وناقلات مع إضافة الى الوراء ، و 15.5 ٪ من الخلايا كانت إيجابية GFP (حارة 2). نضوب BRCA1 وناقلات إضافة الظهير يكشف عن تأثير فقدان BRCA1 على إعادة التركيب مثلي (حارة 3). وتظهر آثار استنفاد BRCA1 وإضافة الى الوراء البرية من نوع BRCA1 (حارة 4) ، BRCA1 (M18T) (حارة 5) ، وBRCA1 (I21V) (حارة 6). هذه النتائج هي من تجربة واحدة ، وسيكون جنبا إلى جنب مع اثنين على الاقل من التجارب أكثر تكرار من أجل الحصول على قدر من إعادة التركيب مثلي مدعومة البروتين الطافر BRCA1 معين.

<ol>
	<li>Carvalho, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+cancer+risk+associated+with+germ+line+BRCA1+missense+variants+by+functional+analysis.">Determination of cancer risk associated with germ line BRCA1 missense variants by functional analysis.</a> Cancer Res. 67, 1494-1501 (2007).</li><li>Couch, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+epidemiology+of+BRCA1.">Genetic epidemiology of BRCA1.</a> Cancer Biol Ther. 3, 509-514 (2004).</li><li>Couch, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+functional+effects+of+unclassified+genetic+variants.">Assessment of functional effects of unclassified genetic variants.</a> Hum Mutat. 29, 1314-1326 (2008).</li><li>Tomlinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+breast+cancer+cell+line+derived+from+a+germ-line+BRCA1+mutation+carrier.">Characterization of a breast cancer cell line derived from a germ-line BRCA1 mutation carrier.</a> Cancer Res. 58, 3237-3242 (1998).</li><li>Ruffner, H., Joazeiro, C. A., Hemmati, D., Hunter, T., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-predisposing+mutations+within+the+RING+domain+of+BRCA1:+loss+of+ubiquitin+protein+ligase+activity+and+protection+from+radiation+hypersensitivity.">Cancer-predisposing mutations within the RING domain of BRCA1: loss of ubiquitin protein ligase activity and protection from radiation hypersensitivity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 5134-5139 (2001).</li><li>Moynahan, M. E., Chiu, J. W., Koller, B. H., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brca1+controls+homology-directed+DNA+repair.">Brca1 controls homology-directed DNA repair.</a> Mol Cell. 4, 511-518 (1999).</li><li>Nakanishi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Fanconi+anemia+monoubiquitination+pathway+promotes+homologous+DNA+repair.">Human Fanconi anemia monoubiquitination pathway promotes homologous DNA repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1110-1115 (2005).</li><li>Pierce, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-strand+breaks+and+tumorigenesis.">Double-strand breaks and tumorigenesis.</a> Trends Cell Biol. 11, 52-59 (2001).</li><li>Ransburgh, D. J., Chiba, N., Ishioka, C., Toland, A. E., Parvin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+breast+tumor+mutations+in+BRCA1+that+abolish+its+function+in+homologous+DNA+recombination.">Identification of breast tumor mutations in BRCA1 that abolish its function in homologous DNA recombination.</a> Cancer Res. 70, 988-995 (2010).</li><li>Easton, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+genetic+assessment+of+1,433+sequence+variants+of+unknown+clinical+significance+in+the+BRCA1+and+BRCA2+breast+cancer-predisposition+genes.">A systematic genetic assessment of 1,433 sequence variants of unknown clinical significance in the BRCA1 and BRCA2 breast cancer-predisposition genes.</a> Am J Hum Genet. 81, 873-883 (2007).</li><li>Snouwaert, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA1+deficient+embryonic+stem+cells+display+a+decreased+homologous+recombination+frequency+and+an+increased+frequency+of+non-homologous+recombination+that+is+corrected+by+expression+of+a+brca1+transgene.">BRCA1 deficient embryonic stem cells display a decreased homologous recombination frequency and an increased frequency of non-homologous recombination that is corrected by expression of a brca1 transgene.</a> Oncogene. 18, 7900-7907 (1999).</li><li>Pierce, A. J., Hu, P., Han, M., Ellis, N., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ku+DNA+end-binding+protein+modulates+homologous+repair+of+double-strand+breaks+in+mammalian+cells.">Ku DNA end-binding protein modulates homologous repair of double-strand breaks in mammalian cells.</a> Genes Dev. 15, 3237-3242 (2001).</li><li>Spearman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinically+applicable+models+to+characterize+BRCA1+and+BRCA2+variants+of+uncertain+significance.">Clinically applicable models to characterize BRCA1 and BRCA2 variants of uncertain significance.</a> J Clin Oncol. 26, 5393-5400 (2008).</li><li>Sweet, K., Senter, L., Pilarski, R., Wei, L., Toland, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+BRCA1+ring+finger+variants+of+uncertain+significance.">Characterization of BRCA1 ring finger variants of uncertain significance.</a> Breast Cancer Res Treat. 119, 737-743 (2009).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

ميزة هذه الطريقة هو أن نتمكن من دراسة وظيفة البروتين BRCA1 في تنظيم إصلاح الحمض النووي من قبل إعادة التركيب مثلي باستخدام الخلايا التي تحتوي على التطور الطبيعي من النوع البري BRCA1 التي أعرب عنها. اعتمدنا منفصلين الوسائل المتبعة في دراسة عملية إعادة التركيب مثلي والاستفادة من رني بوساطة استنزاف للحصول على طريقة جديدة لاختبار المتغيرات BRCA1 لوظيفة في إصلاح الحمض النووي. وكان المفتاح لنجاح هذا الأسلوب لإنشاء خط خلية transfectable بسهولة ، مثل هيلا ، مع الركيزة إعادة التركيب في الجينوم بحيث نحصل على مستويات عالية جدا من تحويل GFP. كان لدينا فحص الحيوانات المستنسخة متعددة من التحول الأصلي من أجل الحصول على احد ان لم يكن GFP خلفية اكتشاف الإشارات ، ولكن عند ترنسفكأيشن للتعبير I - SCEI البلازميد كان على مستوى عال جدا من تحويل GFP. مع هذا الأسلوب ، نحن نحقق الآن محددة أخرى BRCA1 مخلفات الأحماض الأمينية وظيفة في إعادة التركيب مثلي. جنبا إلى جنب مع رؤى البيولوجية من هذا العمل ، يمكن تطبيق هذه النتائج إلى علم الوراثة السرطان السريرية. وهناك نسبة عالية من الطفرات BRCA1 مغلطة لها أهمية سريرية غير معروف لأن هناك متغيرات كثيرة ونادرة لا توجد معلومات كافية عن العديد من هذه الجمعيات لتحديد سرطان بواسطة التحليل الجيني 3،10،13،14 العزل. باستخدام هذا الأسلوب ، يمكن أن تستخدم نتائج متغير معين على الوظيفة البيولوجية في تنظيم BRCA1 من إعادة التركيب مماثل لإعلام النساء الذين يحملون واحدة من هذه المتغيرات في الجينوم الخاصة بهم.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11960</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USA Scientific</td>
<td>9871-5200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>siRNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>N/A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipofectamine-2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11668</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TrypLE</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>12604</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Puromycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Enzo Life Sciences</td>
<td>BML-GR312</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Opti-MEM I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>31985</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Pyruvate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11360</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GlutaMAX I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>35050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

identifying the effects of brca1 mutations on homologous recombination using cells that express endogenous wild-type brca1

يمكن أن يكون معقدا في التحليل الوظيفي من الطفرات مغلطة من وجودها في الخلية من البروتين الذاتية. وتعقدت البنية الدالة تحليلات لBRCA1 من عدم وجود تجربة قوية للبروتين الكامل وطول BRCA1 الصعوبات الكامنة في العمل مع خطوط الخلايا التي تعبر عن البروتين hypomorphic BRCA1 1،2،3،4،5. وضعنا نظاما كان المنضب حاد البروتين BRCA1 الذاتية في خلية بواسطة رني استهداف 3&#39; - UTR من BRCA1 مرنا وحلت محلها التعاون transfecting البلازميد معربا عن متغير BRCA1. ميزة واحدة من هذا الإجراء هو أن إسكات الحادة والمتزامنة استبدال BRCA1 تسمح للخلايا أن تنمو من دون طفرات الثانوية أو التعديلات التي قد تنشأ مع مرور الوقت للتعويض عن فقدان وظيفة BRCA1. وقد تم هذا النزف الداخلي وإضافة الى الوراء في خط الخلايا المشتقة من هيلا أن يعاير بسهولة لنشاط إعادة التركيب مثلي. يستند مقايسة تأشب مثلي على طريقة نشرها مسبقا حيث يتم إعادة التركيب المتكامل ركيزة في جينوم (الشكل 1) 6،7،8،9. هذه الركيزة إعادة التركيب يحتوي على انزيم القطع النادرة تقييد I - SCEI موقع داخل أليل GFP نشط ، والمصب الثاني أليل GFP نشط. ترنسفكأيشن من البلازميد التي تعبر عن I - SCEI النتائج في كسر مزدوج الجديلة ، والتي يمكن اصلاحها من خلال إعادة التركيب مثلي ، وإذا كان مثلي لا تأشب إصلاح كسر يخلق أليل GFP النشط الذي سجل بسهولة التدفق الخلوي للتعبير البروتين GFP . أدى استنزاف BRCA1 المحلية في الحد من 8-10 أضعاف في نشاط إعادة التركيب مثلي ، وإضافة الى الوراء البرية من نوع البلازميد الدالة تأشب استعادة كامل مثلي. عندما أعرب عن المسوخ نقطة محددة من BRCA1 طول الكامل من شارك في transfected البلازميدات ، يمكن سجل تأثير متحولة مغلطة محددة. كمثال على ذلك ، أعرب عن التعبير عن بروتين (M18T) BRCA1 ، وهو البديل من الأهمية السريرية غير معروفة 10 ، في هذه الخلايا ، إلا أنها أخفقت في استعادة BRCA1 التي تعتمد على إعادة التركيب مثلي. بواسطة التعبير ، وعلى النقيض من متغير آخر ، وهو أيضا من أهمية مجهولة ، BRCA1 (I21V) استعادة تامة BRCA1 التي تعتمد على وظيفة إعادة التركيب مثلي. وقد تم تطبيق هذه الاستراتيجية لاختبار وظيفة الطفرات BRCA1 مغلطة إلى نظام آخر للمعايرة وظيفة بيولوجية الجسيم المركزي (قيس وآخرون ، والملاحظات غير منشورة). عموما ، فإن هذا النهج هو مناسبة لتحليل المسوخ مغلطة في أي الجينات التي يجب تحليلها مقهور.

Watch this Scientific Journal Video about Identifying the Effects of BRCA1 Mutations on Homologous Recombination using Cells that Express Endogenous Wild-type BRCA1 at JoVE.com

Identifying the Effects of BRCA1 Mutations on Homologous Recombination using Cells that Express Endogenous Wild-type BRCA1

نحن نقدم طريقة لاختبار المتغيرات BRCA1 في نسيج ثقافة تستند مقايسة لإصلاح تأشب مثلي الحمض النووي من التلف من خلال استنفاد الذاتية البروتين BRCA1 من خلية باستخدام رني واستبدالها متحولة نقطة BRCA1 الذي يحتوي على تغيير الترميز.

تحديد آثار الطفرات BRCA1 على التوحد باستخدام خلايا متماثلة التي تعبر عن الذاتية وحشية من نوع BRCA1

The functional analysis of missense mutations can be complicated by the presence in the cell of the endogenous protein. Structure-function analyses of the ...

identifying-effects-brca1-mutations-on-homologous-recombination-using

Research

JoVE Journal

Biology

14.5K Views.  The Ohio State University. نحن نقدم طريقة لاختبار المتغيرات BRCA1 في نسيج ثقافة تستند مقايسة لإصلاح تأشب مثلي الحمض النووي من التلف من خلال استنفاد الذاتية البروتين BRCA1 من خلية باستخدام رني واستبدالها متحولة نقطة BRCA1 الذي يحتوي على تغيير الترميز.

Video: Identifying the Effects of BRCA1 Mutations on Homologous Recombination using Cells that Express Endogenous Wild-type BRCA1

Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and cardiovascular disease1-11. Traditional cell biological approaches to studying cellular function involve culturing cells on a rigid substratum (plastic dishes or glass coverslips) which cannot account for the effect of an elastic ECM or the variations in ECM stiffness between tissues. To model in vivo tissue compliance conditions in vitro, we and others use ECM-coated hydrogels. In our laboratory, the hydrogels are based on polyacrylamide which can mimic the range of tissue compliances seen biologically12. "Reactive" cover slips are generated by incubation with NaOH followed by addition of 3-APTMS. Glutaraldehyde is used to cross-link the 3-APTMS and the polyacrylamide gel. A solution of acrylamide (AC), bis-acrylamide (Bis-AC) and ammonium persulfate is used for the polymerization of the hydrogel. N-hydroxysuccinimide (NHS) is incorporated into the AC solution to crosslink ECM protein to the hydrogel. Following polymerization of the hydrogel, the gel surface is coated with an ECM protein of choice such as fibronectin, vitronectin, collagen, etc.
The stiffness of a hydrogel can be determined by rheology or atomic force microscopy (AFM) and adjusted by varying the percentage of AC and/or bis-AC in the solution12. In this manner, substratum stiffness can be matched to the stiffness of biological tissues which can also be quantified using rheology or AFM. Cells can then be seeded on these hydrogels and cultured based upon the experimental conditions required. Imaging of the cells and their recovery for molecular analysis is straightforward. For this article, we define soft substrata as those having elastic moduli (E) &lt;3000 Pascal and stiff substrata/tissues as those with E &gt;20,000 Pascal.

The effect of substrata stiffness on cellular function can be modeled in vitro using polyacrylamide hydrogels of varying compliances.

دراسة آثار تصلب مصفوفة على وظيفة الخلوية باستخدام الأكريلاميد المستندة الهلاميات المائية

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces the 'free' surfaces and the basolateral membrane is in contact with the substrate and neighboring cells. Both membrane domains are separated by tight junctions, which form a diffusion barrier. Apical-basolateral polarization can be recapitulated successfully in culture when epithelial cells such as Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells are seeded at high density on polycarbonate filters and cultured for several days 1 2. Establishment and maintenance of cell polarity is regulated by an array of small GTPases of the Ras superfamily such as RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 and Rab13 3 4 5 6 7. Like all GTPases these proteins cycle between an inactive GDP-bound state and an active GTP-bound state. Specific mutations in the nucleotide binding regions interfere with this cycling 8. For example, Rab13T22N is permanently locked in the GDP-form and thus dubbed 'dominant negative', whereas Rab13Q67L can no longer hydrolyze GTP and is thus locked in a 'dominant active' state 7. To analyze their function in cells both dominant negative and dominant active alleles of GTPases are typically expressed at high levels to interfere with the function of the endogenous proteins 9. An elegant way to achieve high levels of overexpression in a short amount of time is to introduce the plasmids encoding the relevant proteins directly into the nuclei of polarized cells grown on filter supports using microinjection technique. This is often combined with the co-injection of reporter plasmids that encode plasma membrane receptors that are specifically sorted to the apical or basolateral domain. A cargo frequently used to analyze cargo sorting to the basolateral domain is a temperature sensitive allele of the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVGts045) 10. This protein cannot fold properly at 39&deg;C and will thus be retained in the endoplasmic reticulum (ER) while the regulatory protein of interest is assembled in the cytosol. A shift to 31&deg;C will then allow VSVGts045 to fold properly, leave the ER and travel to the plasma membrane 11. This chase is typically performed in the presence of cycloheximide to prevent further protein synthesis leading to cleaner results. Here we describe in detail the procedure of microinjecting plasmids into polarized cells and subsequent incubations including temperature shifts that allow a comprehensive analysis of regulatory proteins involved in basolateral sorting.

This article details the procedures involved in overexpression and analysis of small GTPases in polarized epithelial cells using microinjection technique.

تحليل وظيفة GTPases الصغيرة التي Microinjection من البلازميدات إلى الخلايا الظهارية المستقطب

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in 73 different countries throughout Africa, Asia, Europe, New Zealand, Oceania and the Americas1-2. Cogongrass forms rapidly-spreading, monodominant stands that displace a large variety of native plant species and in turn threaten the native animals that depend on the displaced native plant species for forage and shelter. To add to the problem, an ornamental variety [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] is widely marketed under the names of Imperata cylindrica 'Rubra', Red Baron, and Japanese blood grass (JBG). This variety is putatively sterile and noninvasive and is considered a desirable ornamental for its red-colored leaves. However, under the correct conditions, JBG can produce viable seed (Carol Holko, 2009 personal communication) and can revert to a green invasive form that is often indistinguishable from cogongrass as it takes on the distinguishing characteristics of the wild-type invasive variety4 (Figure 1). This makes identification using morphology a difficult task even for well-trained plant taxonomists. Reversion of JBG to an aggressive green phenotype is also not a rare occurrence. Using sequence comparisons of coding and variable regions in both nuclear and chloroplast DNA, we have confirmed that JBG has reverted to the green invasive within the states of Maryland, South Carolina, and Missouri. JBG has been sold and planted in just about every state in the continental U.S. where there is not an active cogongrass infestation. The extent of the revert problem in not well understood because reverted plants are undocumented and often destroyed.
Application of this molecular protocol provides a method to identify JBG reverts and can help keep these varieties from co-occurring and possibly hybridizing. Cogongrass is an obligate outcrosser and, when crossed with a different genotype, can produce viable wind-dispersed seeds that spread cogongrass over wide distances5-7. JBG has a slightly different genotype than cogongrass and may be able to form viable hybrids with cogongrass. To add to the problem, JBG is more cold and shade tolerant than cogongrass8-10, and gene flow between these two varieties is likely to generate hybrids that are more aggressive, shade tolerant, and cold hardy than wild-type cogongrass. While wild-type cogongrass currently infests over 490 million hectares worldwide, in the Southeast U.S. it infests over 500,000 hectares and is capable of occupying most of the U.S. as it rapidly spreads northward due to its broad niche and geographic potential3,7,11. The potential of a genetic crossing is a serious concern for the USDA-APHIS Federal Noxious Week Program. Currently, the USDA-APHIS prohibits JBG in states where there are major cogongrass infestations (e.g., Florida, Alabama, Mississippi). However, preventing the two varieties from combining can prove more difficult as cogongrass and JBG expand their distributions. Furthermore, the distribution of the JBG revert is currently unknown and without the ability to identify these varieties through morphology, some cogongrass infestations may be the result of JBG reverts. Unfortunately, current molecular methods of identification typically rely on AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) and DNA sequencing, both of which are time consuming and costly. Here, we present the first cost-effective and reliable PCR-based molecular genotyping method to accurately distinguish between cogongrass and JBG revert.

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

We provide a cost-effective and rapid molecular genotyping protocol that employs variety-specific PCR primers that target DNA sequence differences within the chloroplast trnL-F spacer region to differentiate between varieties of Imperata cylindrica (cogongrass) that cannot be distinguished by morphology alone. These varieties include the federally listed noxious weed, cogongrass and closely-related, wide-spread ornamental variety, I. cylindrica var. koenigii (Japanese blood grass).

والطريقة انماط PCR القائم على التمييز بين الأنواع البرية من نوع والزينة لل Imperata cylindrica</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in ...

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a genetic model organism for human-disease related research. Recent years have seen technical advancements like homologous recombination and recombineering. However, generating unequivocal null mutations or tagging endogenous proteins remains a substantial effort for most genes. Here, we describe and demonstrate techniques for using recombineering-based cloning methods to generate vectors that can be used to target and manipulate endogenous loci in vivo. Specifically, we have established a combination of three technologies: (1) BAC transgenesis/recombineering, (2) ends-out homologous recombination and (3) Gateway technology to provide a robust, efficient and flexible method for manipulating endogenous genomic loci. In this protocol, we provide step-by-step details about how to (1) design individual vectors, (2) how to clone large fragments of genomic DNA into the homologous recombination vector using gap repair, and (3) how to replace or tag genes of interest within these vectors using a second round of recombineering. Finally, we will also provide a protocol for how to mobilize these cassettes in vivo to generate a knockout, or a tagged gene via knock-in. These methods can easily be adopted for multiple targets in parallel and provide a means for manipulating the Drosophila genome in a timely and efficient manner.

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

Homologous recombination techniques greatly advance Drosophila genetics by enabling the creation of molecularly precise mutations. The recent adoption of recombineering allows one to manipulate large pieces of DNA and transform them into Drosophila6. The methods presented here combine these techniques to rapidly generate large homologous recombination vectors.

Recombineering مثلي التركيبات التوحد في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

قياس آثار البكتيريا على<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; السلوك باستخدام مقايسة الاحتفاظ البيض

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on cancer, and especially cancer genetics. Current knowledge and future discoveries will make it necessary to study a huge number of genes that could be involved in a genetic predisposition to cancer. In this regard, we developed a Nextera design to study 11 complete genes involved in DNA damage repair. This protocol was developed to safely study 11 genes (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80, and TP53) from promoter to 3&#39;-UTR in 24 patients simultaneously. This protocol, based on transposase technology and gDNA enrichment, gives a great advantage in terms of time for the genetic diagnosis thanks to sample multiplexing. This protocol can be safely used with blood gDNA.

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair.

gDNA التخصيب من قبل القائم على تقنية Transposase لتحليل NGS من تسلسل كامل ل<em&gt; BRCA1</em&gt;،<em&gt; BRCA2</em&gt;، و 9 الجينات المسؤولة عن إصلاح الحمض النووي الأضرار

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

تحديد مواقع التفاعل البروتين البروتين عن طريق الببتيد صفائف

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Determination of Sialic Acids in Liver and Milk Samples of Wild-type and CMAH Knock-out Mice.

CMAH (cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase) is responsible for the oxidation of cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acids in mammals. However, humans cannot oxidize cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid to cytidine monophosphate-N-glycolylneuraminic acid due to a primary exon deletion of the CMAH gene. To understand the effects and implications of the lack of CMAH activity in more detail, a Cmah knock-out model in mice is of keen interest in basic and applied research. The analysis method to determine the phenotype of this mouse model is herein described in detail, and is based on the detection of both N-acetylneuraminic acid and N-glycolylenuraminic acid in the liver and milk of wild-type and Cmah knock-out mice. Endogenous sialic acids are released and derivatized with o-phenylenediamine to generate fluorogenic derivatives, which can be subsequently analyzed by HPLC. The presented protocol can be also applied for the analysis of milk and tissue samples from various other origins, and may be of use to investigate the nutritional and health effects of N-glycolylneuraminic acid.

Determination of Sialic Acids in Liver and Milk Samples of Wild-type and CMAH Knock-out Mice.

We describe a HPLC-based method for the determination of N-acetylneuraminic acid and N-glycolylenuraminic acid in mouse liver and milk.

تحديد الأحماض السياليك في الكبد وعينات الحليب من البرية من نوع و<em&gt; CMAH</em&gt; خروج المغلوب الفئران.

CMAH (cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase) is responsible for the oxidation of cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acids in ...

A Method to Assess Bacteriocin Effects on the Gut Microbiota of Mice

Very intriguing questions arise with our advancing knowledge on gut microbiota composition and the relationship with health, particularly relating to the factors that contribute to maintaining the population balance. However, there are limited available methodologies to evaluate these factors. Bacteriocins are antimicrobial peptides produced by many bacteria that may confer a competitive advantage for food acquisition and/or niche establishment. Many probiotic lactic acid bacteria (LAB) strains have great potential to promote human and animal health by preventing the growth of pathogens. They can also be used for immuno-modulation, as they produce bacteriocins. However, the antagonistic activity of bacteriocins is normally determined by laboratory bioassays under well-defined but over-simplified conditions compared to the complex gut environment in humans and animals, where bacteria face multifactorial influences from the host and hundreds of microbial species sharing the same niche. This work describes a complete and efficient procedure to assess the effect of a variety of bacteriocins with different target specificities in a murine system. Changes in the microbiota composition during the bacteriocin treatment are monitored using compositional 16S rDNA sequencing. Our approach uses both the bacteriocin producers and their isogenic non-bacteriocin-producing mutants, the latter giving the ability to distinguish bacteriocin-related from non-bacteriocin-related modifications of the microbiota. The fecal DNA extraction and 16S rDNA sequencing methods are consistent and, together with the bioinformatics, constitute a powerful procedure to find faint changes in the bacterial profiles and to establish correlations, in terms of cholesterol and triglyceride concentration, between bacterial populations and health markers. Our protocol is generic and can thus be used to study other compounds or nutrients with the potential to alter the host microbiota composition, either when studying toxicity or beneficial effects.

Bacteriocins are believed to play a key role in defining microbial diversity in different ecological niches. Here, we describe an efficient procedure to assess how bacteriocins affect gut microbiota composition in an animal model.

وهناك طريقة لتقييم بكتريوسين الآثار على الأمعاء الدقيقة من الفئران

Very intriguing questions arise with our advancing knowledge on gut microbiota composition and the relationship with health, particularly relating to the ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure plasma (LPP) discharges contain a broad spectrum of active species, which lead to rapid microbial inactivation. To study the efficiency and mechanisms of sterilization by LPP, we use spores of the test organism Bacillus subtilis because of their extraordinary resistance against conventional sterilization procedures. We describe the production of B. subtilis spore monolayers, the sterilization process by low pressure plasma in a double inductively coupled plasma reactor, the characterization of spore morphology using scanning electron microscopy (SEM), and the analysis of germination and outgrowth of spores by live cell microscopy. A major target of plasma species is genomic material (DNA) and repair of plasma-induced DNA lesions upon spore revival is crucial for survival of the organism. Here, we study the germination capacity of spores and the role of DNA repair during spore germination and outgrowth after treatment with LPP by tracking fluorescently-labelled DNA repair proteins (RecA) with time-resolved confocal fluorescence microscopy. Treated and untreated spore monolayers are activated for germination and visualized with an inverted confocal live cell microscope over time to follow the reaction of individual spores. Our observations reveal that the fraction of germinating and outgrowing spores is dependent on the duration of LPP-treatment reaching a minimum after 120 s. RecA-YFP (yellow fluorescence protein) fluorescence was detected only in few spores and developed in all outgrowing cells with a slight elevation in LPP-treated spores. Moreover, some of the vegetative bacteria derived from LPP-treated spores showed an increase in cytoplasm and tended to lyse. The described methods for analysis of individual spores could be exemplary for the study of other aspects of spore germination and outgrowth.

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

This protocol illustrates the important consecutive steps required to assess the relevance of monitoring vitality parameter and DNA repair processes in reviving Bacillus subtilis spores after treatment with low pressure plasma by tracking fluorescence-labelled DNA repair proteins via time-resolved confocal microscopy and scanning electron microscopy.

التحقيق "تضر الآثار من منخفضة الضغط البلازما التعقيم" على البقاء لجراثيم Bacillus نجحت "باستخدام خلية يعيش مجهرية"

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...