אנו מודים מרכז אוהיו מקיף אוניברסיטת סרטן למתן מימון עבור עבודה זו.

1. Cell קו עם המצע רקומבינציה משולב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים הלה הפכו ביציבות עם PDR-GFP (מתנה פלסמיד 7 מ מ Jasin, ממוריאל סלואן קטרינג Cancer Center) ומתוחזק puromycin לבחירת transformants. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים passaged ב DMEM / FBS, המכיל 10% בסרום שור עוברית, 2 מ&quot;מ GlutaMAX, נתרן 1 mM pyruvate, פניצילין / סטרפטומיצין (100 U / mL/0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל), ו 1.5 UG / mL puromycin. </li></ol> המצע רקומבינציה ב-GFP-PDR הפלסמיד, וב transformants יציבה, מכיל שני אללים פעיל של ה-GFP (איור 1). אחת אלל אינו פעיל עקב הכללת ברצף קידוד של האתר 18 נ&quot;ב אנזים הכרה הגבלה עבור I-SCEI. הביטוי של I-SCEI בתאים אלה יוצר לשבור פעמיים גדילי דנ&quot;א (DSB). יש האלל השני של ה-GFP פעיל על ה-DNA הזה, אבל את החלק של הרצף שלה בקורלציה עם האתר I-SCEI על האלל הראשון הוא wild-type. זה האלל GFP השני יכול לתפקד בתור התורם רצף לתיקון הומולוגיים רקומבינציה של DSB ו תביא אלל GFP פעיל, אשר מזוהה בקלות על ידי cytometry הזרימה. לחלופין, DSB יכול להיות מתוקן על ידי nonhomologous סוף להצטרף, אשר יהרוס את האתר I-SCEI הגבלה תגרום GFP שלילי תאים. רמת רקומבינציה הומולוגיים בתא נקבע על ידי ספירת אחוז GFP חיובי תאים. קו זה התא, pHeLa-DR13-9, נבחר בין כל הכפילים לאות אפס רקע GFP ואחוז גבוה יחסית של ה-GFP חיובית על תאים transfection עם I-SCEI להביע pCBASce פלסמיד,. (PCBASce ושליטה וקטור שלה, pCAGGS, היו שניהם מסופק על ידי מ &#39;Jasin של מרכז הסרטן סלואן קטרינג הזיכרון). השורה הלה-DR13-9 תאים זמין המחברים על פי בקשה. 2. Transfection כדי לכלות BRCA1 אנדוגני הוסף חזור BRCA1 Mutant. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום לפני transfection הראשונה (בדרך כלל יום שלישי): התחל עם צלחת 10 ס&quot;מ של הלה-DR13-9 תאים לפחות 90% ומחוברות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinize ב 1 מ&quot;ל ולעצור את התגובה על ידי הוספת 9 מ&quot;ל DMEM / FBS, ומערבבים היטב על ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 40 μL של תאים trypsinized היטב לכל צלחת 24 היטב מ&quot;ל של 0.5 DME / FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 יום transfections (יום רביעי): תאים יש ~ ומחוברות 40-50%, אם הרבה פחות ולהתחיל מחדש. Transfect על ידי ערבוב: 5 siRNA pmol + 0.3 UG BRCA1-DNA פלסמיד המבטא מוטציה ב 12.5 μL Opti-ממ, ו 0.5 Lipofectamine μL 2000 ב 12.5 μL Opti-ממ. המשך transfection על פי פרוטוקול Lipofectamine (Invitrogen). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את המדיה 4-6 שעות מאוחר יותר. SiRNA אנו משתמשים כדי לרוקן BRCA1 מבוסס על GCUCCUCUCACUCUUCAGU רצף ציון BRCA1 3&#39;-UTR רצפים 80,780 עד 80,798 (מספר ההצטרפות AY273801). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 2: העברת התאים על ידי trypsinizing מהצלחת גם 24 לצלחת 6 באר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3 יום transfections: 25 siRNA pmol + 0.75 UG BRCA1-DNA פלסמיד המבטא מוטציה + 0.75 pCBASce UG (או שליטה pCAGGS וקטור) ב 62.5 μL Opti-ממ ו 2.5 Lipofectamine μL 2000 ב 62.5 μL Opti-ממ. החלף את המדיה 4-6 שעות מאוחר יותר. </li></ol> 3. ניתוח Transfectants. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 6, trypsinize התאים היטב כל עצירה 1 מ&quot;ל DMEM / FBS. ניתוח תאים לביטוי GFP יכול להיעשות על 5 או 7 ימים, אך אנו מוצאים כי ביום 6 עובד הכי טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח 10,000 תאים לכל היטב על ידי cytometry הזרימה. אנו משתמשים בכלי בקטון דיקינסון FACSCalibur של אוניברסיטת מדינת אוהיו מקיף סרטן משאב מרכז אנליטי cytometry משותף. יחיד, תאים חיים הם מגודרת באמצעות פרמטרים פיזור קדימה בצד. GFP חיובי תאים מזוהים באמצעות גלאי הקרינה GFP (FL1), והתוצאות מוצגות היסטוגרמה (איור 2, למטה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השמאל על התאים ניתן replated לצילום על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי אם תרצה בכך. </li></ol> 4. נציג תוצאות: BRCA1 מסדיר את מסלול תיקון של DNA גדילי כפול נשבר על ידי רקומבינציה הומולוגיים 6,11. תאים אלה אשר עברו תיקון ע&quot;י רקומבינציה הומולוגיים מזוהים בקלות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 2, למעלה). דלדול של תוצאות BRCA1 לירידה GFP חיובי זיהה התאים (איור 2, מימין). התפוקה של FACSCalibur היא היסטוגרמה בעוצמה GFP לכל תא על ציר ה-X ואת מספר התאים על ציר Y (איור 2, למטה). בכל קבוצה טיפוסית של תוצאות מניסוי אחד, 15.5% מכלל התאים היו GFP חיובי לאחר I-SCEI ביטוי ושליטה דלדול RNAi (איור 3). לשם השוואה, דלדול של BRCA1 ו - וקטור להוסיף מופחת בחזרה GFP המרה ל 0.7%. תוספות האחורי של BRCA1 wild-type או של רקומבינציה BRCA1 (I21V) הומולוגיים שוחזר במלואו, כפי שזוהו על ידי השגת 15-16% GFP חיובי תאים. תוספות האחורי של (BRCA1 M18T) מוטציה (איור 3, מסלול 5) היתה השפעה דומה לזו של התוספת האחורי של שליטה וקטור. מאז גרסה זו מתבטאת ברמות דומות כמו חלבון אנדוגני 9, ולכן אנו מפרשים את וריאנט (M18T) BRCA1 הוא לא פונקציונלי רקומבינציה הומולוגיים. אנחנו בדרך כלל יש 10-20% של התאים להמיר את ה-GFP חיובי לאחר transfecting הביטוי I-SCEI פלסמיד. דלדול של BRCA1 reproducibly מפחית את ההמרה של ה-GFP חיובי תאים על ידי קיפול על 8-10. למרות אחוזי בפועל של ה-GFP חיובי תאים עשויים להשתנות מניסוי לניסוי, יחס חיובי של ה-GFP בתאים בעקבות דלדול BRCA1 דלדול יחסי שליטה בתוך ניסוי עקבי למדי. אנו לנרמל את התוצאות על ידי קביעת שיעור ההמרה מעצורים עד 100% והתוצאות להביע עם depletions BRCA1 ו התוספת הגב באחוזים. בדרך זו, אנו יכולים לשלב מספר רב של ניסויים, ואת וריאציה הניסוי אינה גבוהה. הוסף האחורי של מוטציות BRCA1 עד כה הניבו תוצאות חזקות: כל גרסה יש BRCA1 או שמלוא הפעילות הומולוגיים רקומבינציה או יש לו כל השפעה. שיקול חשוב בהשגת התוצאות הללו היא כי התנאים transfection שלנו לייצר רמות של החלבון BRCA1 כי כ שווה את הריכוז של חלבון אנדוגני בתאים שלא טופלו. גבוה מדי של overexpression של מוטציה של BRCA1 פגום אפילו עלול לגרום פעילות כלשהי הומולוגיים חיובי רקומבינציה. הבעיה שאנחנו צריכים להתגבר היה את הרעילות של transfection. דלדול של BRCA1 עצמה יכול להאט צמיחת תאים, ואת היתרה של ה-DNA Lipofectamine-2000 ו - פלסמיד ביחס למספר התאים על צלחת חייב להתקיים ברמה עקבית. דנ&quot;א מדי Lipofectamine הרבה או פלסמיד תפחית מספרים סלולריים, את מספר התאים יהיה מספיק כדי לקבל תוצאות אמינות cytometry הזרימה. יתרת ריאגנטים פלסמיד ו Lipofectamine לעומת מספר של תאים transfected חשוב מאוד לשמור על יכולת הקיום של התאים. <img src="/files/ftp_upload/2468/2468fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. המצע רקומבינציה. האסטרטגיה אשר פותחה על ידי קבוצה של מ Jasin 7,12 מתואר. PDR-GFP פלסמיד המכיל שני אללים פגומים של ה-GFP, אשר אחד מהם מכיל I-SCEI endonuclease אתר הגבלה. שורת תאים הנגזרים הלה מכיל זה המצע DNA משולב באתר יחיד הגנום 9, ותיקון פעיל לשבור פעמיים תקועים ה-DNA באתר I-SCEI על ידי הומולוגיים תוצאות רקומבינציה בהמרה של אלל אחד GFP חיובי. <img src="/files/ftp_upload/2468/2468fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. גילוי ה-GFP חיובי תאים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. תאים נבדקו לפי פרוטוקול זה, שליטה מתרוקנים התאים היו פעילים רקומבינציה הומולוגיים, זוהה על ידי אחוז גבוה של תאים עם ביטוי של GFP (משמאל). דלדול של BRCA1 על ידי תוצאות RNAi לירידה חדה במספר של ה-GFP חיובי תאים (מימין). <img src="/files/ftp_upload/2468/2468fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. תוצאות של התוספת האחורי של מוטציות BRCA1 missense. תוצאות מניסוי בודד מוצגים היסטוגרמה זו. בהעדר transfected I-SCEI להביע פלסמיד (מסלול 1) אין GFP חיובי תאים זוהה. התוצאות במסלולים 2-6 נלקחו כל מתאי שבו אני מביע-SCEI הפלסמיד היה transfected ביום 3. בתאים שהיו מרוקנים עבור גן רלוונטית (בלוציפראז) ועם וקטור התוספת בחזרה, 15.5% מכלל התאים היו GFP חיובי (מסלול 2). דלדול של BRCA1 ו - וקטור התוספת בחזרה חושף את ההשפעה של אובדן BRCA1 על רקומבינציה הומולוגיים (מסלול 3). ההשפעות של דלדול של BRCA1 ו התוספת האחורי של BRCA1 wild-type (מסלול 4), BRCA1 (M18T) (מסלול 5), BRCA1 (I21V) (מסלול 6) מוצגים. תוצאות אלו מניסוי אחד, יהיה משולב עם לפחות שני ניסויים חוזרים יותר כדי להשיג מידה של רקומבינציה הומולוגיים נתמך על ידי חלבון נתון מוטציה BRCA1.

<ol>
	<li>Carvalho, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+cancer+risk+associated+with+germ+line+BRCA1+missense+variants+by+functional+analysis.">Determination of cancer risk associated with germ line BRCA1 missense variants by functional analysis.</a> Cancer Res. 67, 1494-1501 (2007).</li><li>Couch, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+epidemiology+of+BRCA1.">Genetic epidemiology of BRCA1.</a> Cancer Biol Ther. 3, 509-514 (2004).</li><li>Couch, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+functional+effects+of+unclassified+genetic+variants.">Assessment of functional effects of unclassified genetic variants.</a> Hum Mutat. 29, 1314-1326 (2008).</li><li>Tomlinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+breast+cancer+cell+line+derived+from+a+germ-line+BRCA1+mutation+carrier.">Characterization of a breast cancer cell line derived from a germ-line BRCA1 mutation carrier.</a> Cancer Res. 58, 3237-3242 (1998).</li><li>Ruffner, H., Joazeiro, C. A., Hemmati, D., Hunter, T., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-predisposing+mutations+within+the+RING+domain+of+BRCA1:+loss+of+ubiquitin+protein+ligase+activity+and+protection+from+radiation+hypersensitivity.">Cancer-predisposing mutations within the RING domain of BRCA1: loss of ubiquitin protein ligase activity and protection from radiation hypersensitivity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 5134-5139 (2001).</li><li>Moynahan, M. E., Chiu, J. W., Koller, B. H., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brca1+controls+homology-directed+DNA+repair.">Brca1 controls homology-directed DNA repair.</a> Mol Cell. 4, 511-518 (1999).</li><li>Nakanishi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Fanconi+anemia+monoubiquitination+pathway+promotes+homologous+DNA+repair.">Human Fanconi anemia monoubiquitination pathway promotes homologous DNA repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1110-1115 (2005).</li><li>Pierce, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-strand+breaks+and+tumorigenesis.">Double-strand breaks and tumorigenesis.</a> Trends Cell Biol. 11, 52-59 (2001).</li><li>Ransburgh, D. J., Chiba, N., Ishioka, C., Toland, A. E., Parvin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+breast+tumor+mutations+in+BRCA1+that+abolish+its+function+in+homologous+DNA+recombination.">Identification of breast tumor mutations in BRCA1 that abolish its function in homologous DNA recombination.</a> Cancer Res. 70, 988-995 (2010).</li><li>Easton, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+genetic+assessment+of+1,433+sequence+variants+of+unknown+clinical+significance+in+the+BRCA1+and+BRCA2+breast+cancer-predisposition+genes.">A systematic genetic assessment of 1,433 sequence variants of unknown clinical significance in the BRCA1 and BRCA2 breast cancer-predisposition genes.</a> Am J Hum Genet. 81, 873-883 (2007).</li><li>Snouwaert, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA1+deficient+embryonic+stem+cells+display+a+decreased+homologous+recombination+frequency+and+an+increased+frequency+of+non-homologous+recombination+that+is+corrected+by+expression+of+a+brca1+transgene.">BRCA1 deficient embryonic stem cells display a decreased homologous recombination frequency and an increased frequency of non-homologous recombination that is corrected by expression of a brca1 transgene.</a> Oncogene. 18, 7900-7907 (1999).</li><li>Pierce, A. J., Hu, P., Han, M., Ellis, N., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ku+DNA+end-binding+protein+modulates+homologous+repair+of+double-strand+breaks+in+mammalian+cells.">Ku DNA end-binding protein modulates homologous repair of double-strand breaks in mammalian cells.</a> Genes Dev. 15, 3237-3242 (2001).</li><li>Spearman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinically+applicable+models+to+characterize+BRCA1+and+BRCA2+variants+of+uncertain+significance.">Clinically applicable models to characterize BRCA1 and BRCA2 variants of uncertain significance.</a> J Clin Oncol. 26, 5393-5400 (2008).</li><li>Sweet, K., Senter, L., Pilarski, R., Wei, L., Toland, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+BRCA1+ring+finger+variants+of+uncertain+significance.">Characterization of BRCA1 ring finger variants of uncertain significance.</a> Breast Cancer Res Treat. 119, 737-743 (2009).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

היתרון של שיטה זו הוא כי אנו יכולים לחקור את הפונקציה של החלבון BRCA1 בוויסות תיקון DNA על ידי רקומבינציה הומולוגיים באמצעות תאים בעלי wild-type BRCA1 הביע endogenously. אימצנו שתי שיטות הוקמה נפרדים של הלומדים בתהליך הומולוגיים רקומבינציה של ניצול RNAi בתיווך דלדול כדי להשיג את שיטה חדשה לבדיקת גרסאות BRCA1 עבור לתפקד תיקון דנ&quot;א. המפתח להצלחה של שיטה זו היה להקים קו תא transfectable בקלות, כמו הלה, עם המצע רקומבינציה בגנום כך אנו מקבלים רמות גבוהות מאוד של ההמרה GFP. היו לנו מספר הוקרן שיבוטים של טרנספורמציה המקורי כדי להשיג אחד כי לא היה אות לגילוי GFP ברקע, אבל על transfection הביטוי I-SCEI הפלסמיד לו רמה גבוהה מאוד של ההמרה GFP. באמצעות שיטה זו, אנו נמצאים כעת בחקירת אחרים ספציפיים חומצה אמינית BRCA1 שאריות עבור לתפקד רקומבינציה הומולוגיים. יחד עם תובנות ביולוגיות מעבודה זו, מסקנות אלה יכול להיות מיושם על גנטיקה וסרטן קליניים. אחוז גבוה של מוטציות BRCA1 missense יש משמעות קלינית ידוע מאז ישנם וריאנטים נדירים רבים, ואין מספיק מידע עבור רבים של אלה לקבוע את הקשר סרטן על ידי ניתוח הפרדה גנטית 3,10,13,14. באמצעות שיטה זו, התוצאות של גרסה מסוימת על התפקוד הביולוגי של BRCA1 בוויסות הומולוגיים רקומבינציה יכול לשמש כדי ליידע את הנשים לבצע אחת הגרסאות הללו בגנום שלהם.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11960</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>9871-5200</td><td></td></tr><tr><td>siRNA</td><td>Invitrogen</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine-2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen</td><td>12604</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-GR312</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Invitrogen</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX I</td><td>Invitrogen</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr></tbody></table>

identifying the effects of brca1 mutations on homologous recombination using cells that express endogenous wild-type brca1

ניתוח פונקציונלי של מוטציות missense יכול להיות מסובך ידי נוכחות בתא של חלבון אנדוגני. מבנה פונקציה ניתוח BRCA1 כבר מסובך מחוסר assay חזקים החלבון BRCA1 מלא אורך הקשיים הכרוכים בעבודה עם שורות תאים המבטאים חלבון BRCA1 hypomorphic 1,2,3,4,5. פיתחנו מערכת לפיה את החלבון BRCA1 אנדוגני בתא היה מדולדל בחריפות על ידי RNAi מיקוד 3&#39;-UTR-mRNA BRCA1 ו הוחלף על ידי שיתוף transfecting פלסמיד המבטא גרסה BRCA1. אחד היתרונות של הליך זה היא כי ההשתקה חריפה של החלפת BRCA1 ו סימולטני לאפשר לתאים לגדול ללא מוטציות משני או התאמות שעלולות להתעורר לאורך זמן על מנת לפצות על אובדן של הפונקציה BRCA1. דלדול זה ולהוסיף גב ההליך נעשה קו הלה הנגזרות תא היה assayed בקלות לפעילות הומולוגיים רקומבינציה. Assay הומולוגיים רקומבינציה מבוסס על שיטה שפורסמו בעבר לפיה מצע רקומבינציה משולב לתוך הגנום (איור 1) 6,7,8,9. זה המצע רקומבינציה יש נדיר חיתוך I-SCEI אנזים הגבלה בתוך אתר אלל GFP פעיל, במורד הוא אלל second-GFP פעיל. Transfection של פלסמיד המבטא I-SCEI תוצאות לשבור פעמיים תקועים, אשר עשוי להיות מתוקן על ידי רקומבינציה הומולוגיים, ואם הומולוגיים רקומבינציה עושה לתקן את לשבור אותו יוצר אלל GFP פעיל כי הוא הבקיע בקלות ביטוי חלבון ה-GFP על ידי זרימת cytometry . דלדול של BRCA1 אנדוגני הביא לירידה של 8-10 פי בפעילות הומולוגיים רקומבינציה, ולהוסיף גב של הפונקציה רקומבינציה פלסמיד wild-type שוחזר במלואו הומולוגיים. כאשר נקודה מסוימת של מוטציות BRCA1 באורך מלא באו לידי ביטוי מתוך שיתוף transfected פלסמידים, ההשפעה של מוטציה missense ספציפי יכול להיות קלע. כדוגמה, את הביטוי של החלבון BRCA1 (M18T), סוג של משמעות קלינית ידוע 10, באה לידי ביטוי התאים האלה, היא לא הצליחה לשחזר BRCA1 תלויי הומולוגיים רקומבינציה. על ידי הביטוי לעומת זאת, גרסה של אחר, גם משמעות ידועה, BRCA1 (I21V) שוחזר במלואו BRCA1 תלויי הומולוגיים פונקציה רקומבינציה. אסטרטגיה זו של בדיקות תפקוד של מוטציות BRCA1 missense הוחל על מערכת ביולוגית אחרת assaying לתפקוד centrosome (קייס ואח&#39;, תצפיות לא פורסם). ככלל, גישה זו מתאימה לניתוח מוטציות בגן missense כל זה יש לנתח recessively.

Watch this Scientific Journal Video about Identifying the Effects of BRCA1 Mutations on Homologous Recombination using Cells that Express Endogenous Wild-type BRCA1 at JoVE.com

Identifying the Effects of BRCA1 Mutations on Homologous Recombination using Cells that Express Endogenous Wild-type BRCA1

אנו מספקים שיטה לבדיקת גרסאות BRCA1 ב assay רקמה תרבות המבוססת לתיקון הומולוגיים רקומבינציה של נזק לדנ&quot;א על ​​ידי depleting החלבון BRCA1 אנדוגני מתא באמצעות RNAi והחלפתו מוטציה נקודת BRCA1 המכיל לשנות קידוד.

זיהוי השפעות של מוטציות BRCA1 על רקומבינציה הומולוגיים באמצעות תאים אקספרס BRCA1 אנדוגני wild-type

The functional analysis of missense mutations can be complicated by the presence in the cell of the endogenous protein. Structure-function analyses of the ...

identifying-effects-brca1-mutations-on-homologous-recombination-using

Research

JoVE Journal

Biology

14.6K Views.  The Ohio State University. אנו מספקים שיטה לבדיקת גרסאות BRCA1 ב assay רקמה תרבות המבוססת לתיקון הומולוגיים רקומבינציה של נזק לדנ"א על ​​ידי depleting החלבון BRCA1 אנדוגני מתא באמצעות RNAi והחלפתו מוטציה נקודת BRCA1 המכיל לשנות קידוד.

Video: Identifying the Effects of BRCA1 Mutations on Homologous Recombination using Cells that Express Endogenous Wild-type BRCA1

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair complexes. This process is regulated by a myriad of proteins that promote the association and disassociation of proteins to these lesions. Thanks in large part to the ability to perform functional screens of a vast library of proteins, there is a greater appreciation of the genes necessary for the double-strand DNA break repair. Often knockout or chemical inhibitor screens identify proteins involved in repair processes by using increased toxicity as a marker for a protein that is required for DSB repair. Although useful for identifying novel cellular proteins involved in maintaining genome fidelity, functional analysis requires the determination of whether the protein of interest promotes localization, formation, or resolution of repair complexes. 
The accumulation of repair proteins can be readily detected as distinct nuclear foci by immunofluorescence microscopy. Thus, association and disassociation of these proteins at sites of DNA damage can be accessed by observing these nuclear foci at representative intervals after the induction of double-strand DNA breaks. This approach can also identify mis-localized repair factor proteins, if repair defects do not simultaneously occur with incomplete delays in repair. In this scenario, long-lasting double-strand DNA breaks can be engineered by expressing a rare cutting endonuclease (e.g., I-SceI) in cells where the recognition site for the said enzyme has been integrated into the cellular genome. The resulting lesion is particularly hard to resolve as faithful repair will reintroduce the enzyme's recognition site, prompting another round of cleavage. As a result, differences in the kinetics of repair are eliminated. If repair complexes are not formed, localization has been impeded. This protocol describes the methodology necessary to identify changes in repair kinetics as well as repair protein localization.

Repair of double-strand DNA breaks is a dynamic process, requiring not only formation of repair complexes at the breaks, but also their resolution after the lesion is addressed. Here, we use immunofluorescence microscopy for transient and long-lasting double-stranded breaks as a tool to dissect this genome maintenance mechanism.

אפיון תהליכי תיקון DNA-ארעי ומעברי DNA ארוך כפול-strand על ידי מיקרוסקופ Immunofluorescence

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Cancer Research

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter assays, embryonic stem cell viability assays, and therapeutic drug-based sensitivity assays. Although they have clarified a lot of BRCA1 variants, these assays involving the use of exogenously expressed BRCA1 variants are associated with overexpression issues and cannot be applied to post-transcriptional regulation. To resolve these limitations, we previously reported a method for functional analysis of BRCA1 variants via CRISPR-mediated cytosine base editor that induce targeted nucleotide substitution in living cells. Using this method, we identified variants whose functions remain ambiguous, including c.-97C&#62;T, c.154C&#62;T, c.3847C&#62;T, c.5056C&#62;T, and c.4986+5G&#62;A, and confirmed that CRISPR-mediated base editors are useful tools for reclassifying the variants of uncertain significance in BRCA1. Here, we describe a protocol for functional analysis of BRCA1 variants using CRISPR-based cytosine base editor. This protocol provides guidelines for the selection of target sites, functional analysis and evaluation of BRCA1 variants.

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

People with BRCA1 mutations have a higher risk of developing cancer, which warrants accurate evaluation of the function of BRCA1 variants. Herein, we described a protocol for functional assessment of BRCA1 variants using CRISPR-mediated cytosine base editors that enable targeted C:G to T:A conversion in living cells.

הערכה פונקציונלית של גרסאות BRCA1 באמצעות עורכי בסיס בתיווך CRISPR

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter ...

Using Next Generation Sequencing to Identify Mutations Associated with Repair of a CAS9-induced Double Strand Break Near the CD4 Promoter

Double strand breaks (DSBs) in DNA are the most cytotoxic type of DNA damage. Because a myriad of insults can result in these lesions (e.g., replication stress, ionizing radiation, unrepaired UV damage), DSBs occur in most cells each day. In addition to cell death, unrepaired DSBs reduce genome integrity and the resulting mutations can drive tumorigenesis. These risks and the prevalence of DSBs motivate investigations into the mechanisms by which cells repair these lesions. Next generation sequencing can be paired with the induction of DSBs by ionizing radiation to provide a powerful tool to precisely define the mutations associated with DSB repair defects. However, this approach requires computationally challenging and cost prohibitive whole genome sequencing to detect the repair of the randomly occurring DSBs associated with ionizing radiation. Rare cutting endonucleases, such as I-Sce1, provide the ability to generate a single DSB, but their recognition sites must be inserted into the genome of interest. As a result, the site of repair is inherently artificial. Recent advances allow guide RNA (sgRNA) to direct a Cas9 endonuclease to any genome locus of interest. This could be applied to the study of DSB repair making next generation sequencing more cost effective by allowing it to be focused on the DNA flanking the Cas9-induced DSB. The goal of the manuscript is to demonstrate the feasibility of this approach by presenting a protocol that can define mutations that stem from the repair of a DSB upstream of the CD4 gene. The protocol can be adapted to determine changes in the mutagenic potential of DSB associated with exogenous factors, such as repair inhibitors, viral protein expression, mutations, and environmental exposures with relatively limited computation requirements. Once an organism's genome has been sequenced, this method can be theoretically employed at any genomic locus and in any cell culture model of that organism that can be transfected. Similar adaptations of the approach could allow comparisons of repair fidelity between different loci in the same genetic background.

Presented here is sgRNA/CAS9 endonuclease and next-generation sequencing protocol that can be used to identify the mutations associated with double strand break repair near the CD4 promoter.

שימוש בריצוף הדור הבא כדי לזהות מוטציות הקשורות לתיקון של שבר גדיל כפול המושרה על ידי CAS9 ליד מקדם CD4

Double strand breaks (DSBs) in DNA are the most cytotoxic type of DNA damage. Because a myriad of insults can result in these lesions (e.g., replication ...

Genetics

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

ניתוח תיקון DNA פעמיים גדיל Break (DSB) בתאי יונקים

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

חקירת היקף הפסקות הדנ"א המתרחשות במהלך שכפול הדנ"א 

Detection of DNA Breaks in Dividing Human Cells by Neutral Comet Assay

DNA replication is constantly challenged by a wide variety of endogenous and exogenous stressors that can damage DNA. Such lesions encountered during genome duplication can stall replisomes and convert replication forks into double-strand breaks. If left unrepaired, these toxic DNA breaks can trigger chromosomal rearrangements, leading to heightened genome instability and an increased likelihood of cellular transformation. Additionally, cancer cells exhibit persistent replication stress, making the targeting of replication fork vulnerabilities in tumor cells an attractive strategy for chemotherapy. A highly versatile and powerful technique to study DNA breaks during replication is the comet assay. This gel electrophoresis technique reliably detects the induction and repair of DNA breaks at the single-cell level. Herein, a protocol is outlined that allows investigators to measure the extent of DNA damage in mitotically dividing human cells using fork-stalling agents across multiple cell types. Coupling this with automated comet scoring facilitates rapid analysis and enhances the reliability in studying induction of DNA breaks.

מחבר זרקור: חשיפת תפקידו של SNF2L ביציבות מזלג שכפול ושכפול גנום

This protocol is designed to investigate the extent of DNA damage occurring during DNA replication. Under neutral conditions, the induction of DNA breaks can be readily assessed within a short time frame. Additionally, the protocol is adaptable to other cell types and various replication stress reagents.

זיהוי הפסקות DNA בחלוקת תאים אנושיים על ידי בדיקת שביט נייטרלי

DNA replication is constantly challenged by a wide variety of endogenous and exogenous stressors that can damage DNA. Such lesions encountered during ...

Bioengineering

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on cancer, and especially cancer genetics. Current knowledge and future discoveries will make it necessary to study a huge number of genes that could be involved in a genetic predisposition to cancer. In this regard, we developed a Nextera design to study 11 complete genes involved in DNA damage repair. This protocol was developed to safely study 11 genes (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80, and TP53) from promoter to 3&#39;-UTR in 24 patients simultaneously. This protocol, based on transposase technology and gDNA enrichment, gives a great advantage in terms of time for the genetic diagnosis thanks to sample multiplexing. This protocol can be safely used with blood gDNA.

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair.

gDNA העשרה על ידי טכנולוגיה מבוססת Transposase לניתוח NGS של הרצף השלם של<em&gt; BRCA1</em&gt;,<em&gt; BRCA2</em&gt;, ו -9 גנים המעורבים בתיקון נזק לדנ&quot;א

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the large size of the human BRCA2 protein (approximately 390 kDa). We report modifications of standard siRNA transfection and immunoblotting protocols to silence human BRCA2 and detect endogenous BRCA2 protein, respectively, in human epithelial cell lines. Key steps include a high siRNA to transfection reagent ratio and two subsequent rounds of siRNA transfection within the same experiment. Using these and other modifications to the standard protocol we consistently achieve more than 70% silencing of the human BRCA2 gene as judged by immunoblotting analysis with anti-BRCA2 antibodies. In addition, denaturation of the cell lysates at 55 &#176;C instead of the conventional 70-100 &#176;C and other technical optimizations of the immunoblotting procedure allow detection of intact BRCA2 protein even when very low amounts of starting material are available or when BRCA2 protein expression levels are very low. Efficient silencing of BRCA2 in human cells offers a valuable strategy to disrupt BRCA2 function in cells with intact BRCA2, including tumor cells, to examine new molecular pathways and cellular functions that may be affected by pathogenic BRCA2 mutations in tumors. Adaptation of this protocol for efficient silencing and analysis of other &#39;large&#39; proteins like BRCA2 should be readily achievable.

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Gene silencing by siRNA represents a convenient experimental strategy to analyze BRCA2-dependent biological functions with immediate implications to better understand cancer biology. A method to efficiently silence BRCA2, along with the experimental procedure to detect and quantify changes in BRCA2 protein expression by immunoblotting in human cell lines, is presented.

השתקת<em&gt; BRCA2</em&gt; לזיהוי פונקציות ביולוגיות-מוסדר BRCA2 רומן בתאי אדם בתרבית

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA insults. Genotoxic agents can damage the DNA backbone, break it, or modify the chemical nature of individual bases. Following DNA insult, DNA damage response (DDR) pathways are activated and proteins involved in the repair are recruited. A plethora of factors are involved in sensing the type of damage and activating the appropriate repair response. Failure to correctly activate and recruit DDR factors can lead to genomic instability, which underlies many human pathologies including cancer. Studies of DDR proteins can provide insights into genotoxic drug response and cellular mechanisms of drug resistance.
There are two major ways of visualizing&#160;proteins in vivo: direct observation, by tagging the protein of interest with a fluorescent protein and following it by live imaging, or indirect immunofluorescence on fixed samples. While visualization of fluorescently tagged proteins allows precise monitoring over time, direct tagging in N- or C-terminus can interfere with the protein localization or function. Observation of proteins in their unmodified, endogenous version is preferred. When DNA repair proteins are recruited to the DNA insult, their concentration increases locally and they form groups, or &#8220;foci&#8221;, that can be visualized by indirect immunofluorescence using specific antibodies.
Although detection of protein foci does not provide a definitive proof of direct interaction, co-localization of proteins in cells indicates that they regroup to the site of damage and can inform of the sequence of events required for complex formation. Careful analysis of foci spatial overlap in cells expressing wild type or mutant versions of a protein can provide precious clues on functional domains important for DNA repair function. Last, co-localization of proteins indicates possible direct interactions that can be verified by co-immunoprecipitation in cells, or direct pulldown using purified proteins.

Following DNA damage, human cells activate essential repair pathways to restore the integrity of their genome. Here, we describe the method of indirect immunofluorescence as a means to detect DNA repair proteins, analyze their spatial and temporal recruitment, and help interrogate protein-protein interaction at the sites of DNA damage.

זיהוי השפעות של מוטציות BRCA1 על רקומבינציה הומולוגיים באמצעות תאים אקספרס BRCA1 אנדוגני wild-type

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

אפיון תהליכי תיקון DNA-ארעי ומעברי DNA ארוך כפול-strand על ידי מיקרוסקופ Immunofluorescence

הערכה פונקציונלית של גרסאות BRCA1 באמצעות עורכי בסיס בתיווך CRISPR

שימוש בריצוף הדור הבא כדי לזהות מוטציות הקשורות לתיקון של שבר גדיל כפול המושרה על ידי CAS9 ליד מקדם CD4

ניתוח תיקון DNA פעמיים גדיל Break (DSB) בתאי יונקים

זיהוי הפסקות DNA בחלוקת תאים אנושיים על ידי בדיקת שביט נייטרלי

זיהוי הפסקות DNA בחלוקת תאים אנושיים על ידי בדיקת שביט נייטרלי

זיהוי הפסקות DNA בחלוקת תאים אנושיים על ידי בדיקת שביט נייטרלי

gDNA העשרה על ידי טכנולוגיה מבוססת Transposase לניתוח NGS של הרצף השלם של

השתקת

הדמיה של אינטראקציה חלבוני תיקון DNA על ידי אימונופלואורסץ