1. إعداد MicroParticle <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجسام التسمية به البيوتين NHS الكيمياء </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد درجة Biotinylation </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المتقارن الخرز Streptavidin مع جسم Biotinylated <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend حبات في القنينة الأصلي لمدة 1-2 دقائق vortexing </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة حجم المطلوب من الخرز في أنبوب microcentrifuge </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل حبات 3 مرات مع PBST : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنبوب يحتوي على حبات على مغناطيس لمدة 2 دقيقة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف التي تطلع مع أنبوب على المغناطيس. يجب الحرص على عدم تعطيل الخرز </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أنبوب من المغناطيس وإضافة 1 مل PBST </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة لمدة 20 ثانية لresuspend الخرز </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 ثوان لإزالة الغطاء من الخرز </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2.3.1-2.3.5 كرر مرتين </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد غسل المكان الثالث في أنبوب على المغناطيس ونضح في PBST </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى الضد biotinylated الخرز وresuspend </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لزم الأمر جعل حجم الأجسام المضادة biotinylated تصل إلى 300 ميكرولتر مع برنامج تلفزيوني. إذا كان حجم الأجسام المضادة هي بالفعل أكبر من 300 ميكرولتر لا تضيف أي برنامج تلفزيوني </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان تعليق حبة / الضد لمدة 30 دقيقة في RT على شاكر دوامة أنبوب أو المدورة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل 3 مرات مع PBST كما في الخطوة 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كتلة الخرز مع جيش صرب البوسنة biotinylated <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد غسل الثالثة ، يضاف 10 ميكروغرام / مغ biotinylated جيش صرب البوسنة ، وضبط حجم إلى 300 ميكرولتر مع PBS إذا لزم الأمر ، واحتضان مع الانفعالات لمدة 30 دقيقة </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل 3 مرات مع PBST كما في الخطوة 3 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخرز في 100 ميليلتر من جيش صرب البوسنة PBS/0.05 ٪. يمكن إضافة أزيد الصوديوم للتخزين على المدى الطويل </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام معيار بروتوكولات فلوريسئين NHS ، fluoresceinate على الضد كاشف </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد درجة Fluorescination </li></ol> 2. المندوبية -- التنمية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد حلول العمل : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فلوريسئين جسم المسمى (FL - AB) : معظم تشو المندوبية المقايسات استخدام FL - آب بتركيز نهائي من 400 نانوغرام / مل. يضاف FL - أب كما ¼ من حجم الفحص النهائي ، وبالتالي فإن تركيز المحلول العمل هو 1.6 ميكروغرام / مل. يعد هذا الحل عن طريق تمييع شحم الأسهم مع الخرزة BioScale / مخفف شحم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخرز : معظم تشو المندوبية المقايسات استخدام حبات بتركيز نهائي 2x10 5 حبات / مليلتر. الكاشف يشكل ربع حبة من حجم الفحص النهائي ، وبالتالي تركيز العمل هو الحل 8X10 5 حبات / مليلتر. يعد هذا الحل عن طريق تمييع الأسهم حبة حبة مع BioScale / مخفف شحم. دوامة السهم حبة جيدا للتأكد من كل حبات في تعليق مسبق لإزالة أحد قسامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل المخزن المؤقت : تكوين المخزن المؤقت تشغيل قد تضطر إلى أن يكون الأمثل للأن الأجسام المضادة المستخدمة لتطوير الفحص ، ومع ذلك وضعت عدة تشو المندوبية المقايسات باستخدام 10 العازلة HEPES ملم ، 1 ٪ توين ، ودرجة الحموضة 7.5. وقد وضعت BioScale مضافة لتشغيل المخزن المؤقت (المرفق مع عدة التنمية) التي تضاف إلى المخزن المؤقت إلى تركيز من 1 ٪ قبل استخدامها. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع ومعايرة العينات مع عينة BioScale مخفف. </li></ol> 3. VIBE نظام تعيين لأعلى <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل محطة العمل على VIBE </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط نظام العرض والنفايات </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رئيس النظام </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضافة الى وجود خرطوشة VIBE </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسار أنابيب </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد قالب الفحص عن طريق ملء ورقة كتب عليها &quot;إعداد نموذج&quot;. BioScale يوفر القدرة على قالب واحد مقايسة لكل محطة عمل مقايسة VIBE. وهذا يسمح للمستخدم لتحرير وحفظ ملاحظات محددة في ورقة &quot;ملاحظات&quot; من القالب لفحوصات مختلفة الاحتفاظ بسجل كامل للتجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مجموعة أولية تصل مقايسة قالب : بيغن عن طريق ملء الجدول (أعلى الزاوية اليسرى) من مجموعة تركيز المعايير في مقايسة في ورقة &quot;نموذج الإعداد&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل ، أدخل معلومات إضافية في الجدول إلى اليمين للمعايير (العمود البسيط الإعداد القراءة ، إضافة الكاشف واحد واثنين من الاجهزة الكاشف إضافة) لإرشاد محطة VIBE كيف عينات طويلة تحتاج إلى احتضان ، وكم هو حجم الكاشف على أن يتم تحويلها ، وكيف تراكم طويل العينة يجب أن يكون ، وما إذا كان تكييف أجهزة الاستشعار وإزالة التلوث من تحقيقات وخرطوشة ضرورية ، الخ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء تخطيط لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل العينة / الكواشف في لوحات. سيتم توفير كميات VIBE المطلوبة لوحة كاشف. يمكن أن يختلف حجم العينة ، ولكن في نصف حجم فحص ما مجموعه 120 ميكرولتر هو مكان انطلاق جيدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق يغطي لوحة. تحميل لوحات على سطح محطة العمل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل مقايسة بدء المعالج ، انتقل من خلال المعالج وبدء الفحص. </li></ol> 4. ممثل النتائج <img src="/files/ftp_upload/2493/2493fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1 : AMMP المناعية ساندويتش </p&gt; على محطة العمل VIBE ، وهي مقايسة AMMP التدابير تركيز المستضد. ويقاس عند إشارة الضد مستضد حبة ناشبة بربط جهاز استشعار عن طريق ناشبة / التفاعل مكافحة الناشبة. التجدد يرتفع مرة أخرى إلى استشعار الدولة بداية من خلال إزالة المعقدات المناعية. <img src="/files/ftp_upload/2493/2493fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2 : شو المندوبية معايرة الفحص AMMP منحنى الشكل 2 أعلاه هو مثال لمنحنى CHO AMMP المندوبية معايرة الفحص. يمكن إجراء تحليل في عينات من جميع أنحاء تنقية دفق بما في ذلك المفاعل مع دقة عالية والتكاثر. <img src="/files/ftp_upload/2493/2493fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3 : البروتين معايرة الفحص AMMP منحنى الرقم 3 هو منحنى المعايرة لبروتين المتبقية والفحص AMMP ، غناء مع بروتين VIBE المتبقية ألف طقم الفحص. يمكن استخدام طقم نفس أسرع مقايسة مع فترة حضانة لمدة 30 دقيقة ، أو لنتائج أكثر حساسية ونطاق أوسع ديناميكية مع فترة أطول الحضانة دون فقدان الدقة أو دقة ، وكلاهما وعادة ما تكون أفضل من لELISA ما يعادلها في المستخدمين يد <img src="/files/ftp_upload/2493/2493fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4 : المنتج AMMP الفحص العيار الحجمي يمكن أيضا أن تستخدم محطة VIBE لمنتج مقايسة العيار الحجمي ، والنتائج هو مبين في الشكل 4. أداء مختلف عن AMMP فحوصات أخرى ، فإن هذا الفحص لا يتطلب العلاج عينة أخرى من تخفيف بسيط ، أو الخرز ، ولقد تم التحقق من الكميات في &quot;لا تدور&quot; العينات التي تحتوي على أكثر من 10 ملايين الخلايا خلال مجموعة واسعة من viabilities. <img src="/files/ftp_upload/2493/2493fig5.jpg" alt="الشكل 5" /> الشكل 5 : AMMP منحنى الفحص القياسية لفحص العلامات البيولوجية GST - Gadd34 هو مبين في الشكل (5) هو منحنى مستوى إشارة التي حصل عليها BioAnalyzer VIBE (لوحة أ) أو باستخدام تكنولوجيا AlphaScreen المؤتلف GST - Gadd34. وكانت النتائج على منصة VIBE حوالي سجل أكثر حساسية باستخدام الأجسام المضادة نفسها. AMMP روافع قياس الجسيمات الأكبر بعد أقل من الفوائد لا تزال التقاط مرحلة الحل وكشف عن تشكيل تعقيدا. <img src="/files/ftp_upload/2493/2493fig6.jpg" alt="الشكل 6" /> الشكل 6 : منحنى AMMP الفحص القياسية لضريبة السلع والخدمات ، في عينة الورم Gadd34 في الشكل (6) ، تم اختبار تحريض Gadd34 من CWR22 xenografts في وجود أو عدم وجود المانع a proteasome boronate وتحليلها من قبل أي من BioAnalyzer VIBE في (لوحة أ) أو AlphaScreen (لوحة باء). كانت منصة VIBE حساسة قادرة على انتاج والنتائج استنساخه في مروي كان الورم في الجسم الحي في حين xenografts إشارة AlphaScreen ميكروغرام مع زيادة البروتين. هذا المثال يدل على قوة التكنولوجيا AMMP في عينات معقدة للغاية. يرجع ذلك إلى الكشف عن رقاقة حساسة وعالية الكفاءة من المغناطيس بالقرب من الرقائق ، ويمكن أن انخفاض أعداد المجهرية الدقيقة المغناطيسي بكفاءة وبتكاثر يبحثون عن هدف وفرة منخفضة وسط تعقيد الخلوية lysed (بما في ذلك كواشف تحلل) والحطام في الدم.

ويعمل واضعو هذه المادة Bioscale ، وشركة التي تنتج بعض الأدوات والكواشف المستخدمة في هذه المقالة.

الأمثلة السالفة الذكر لتبين النتائج AMMP الكمية حساسة للغاية في عينات معقدة. هذا الأداء ، عند تسليمها مع سهولة والسيطرة على الكواشف التنسيق في هذا النظام هو تمكين لمجموعة متنوعة من التطبيقات. قد تكون هذه التطبيقات لهدف محدد ، كما في Gadd34 في الورم ، أو عامة لطائفة من الأهداف ، كما هو الحال في الخلية المضيفة وكشف عن البروتين في عينات من الكميات التي تعبر تنقية دفق. فيبي انخفاض النفقات العامة جنبا إلى جنب مع AMMP منصة مرنة للغاية ويوفر أداة قوية لتقديم فحوصات حرجة.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>NHS-Chromogenic-biotin or NHS-Chromogenic Biotin Labeling kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>If NHS-Chromogenic-biotin is purchased as a reagent the following additional materials will be required</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water-miscible organic solvent such as dimethylsulfoxide (DMSO) or dimethylformamide (DMF)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate buffered saline (PBS) or other amine free buffer (pH 7 &#x2013; 9)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Desalting columns or dialysis units for buffer exchange</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spectrophotometer able to measure 354 and 280 nm &#x2013; for measuring protein and biotin concentrations</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotinylated antibody (2-5 biotins/Ab)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin magnetic beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://www.bioscale.com">BioScale</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>(10 mg/mL) ~108 beads/mg</td>
</tr>
<tr>
<td>Magnet for microcentrifuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England BioLabs</td>
<td>cat # S1510S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotinylated BSA for blocking</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS 0.1% Tween 20</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vortex</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microcentrifuge holder for Vortex or tube rotator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Antibody or protein to be labeled</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NHS-Fluorescein or NHS-Fluorescein Labeling kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>If NHS-Fluorescein is purchased as a reagent the following additional materials will be required</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water-miscible organic solvent such as dimethylsulfoxide (DMSO) or dimethylformamide (DMF)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 mM borate, pH 8.5 or other amine free buffer (pH 7 &#x2013; 9)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Desalting columns or dialysis units for buffer exchange</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Measurement of protein and fluorescein concentrations requires a spectrophotometer able to measure 493 and 280 nm.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Diluent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://www.bioscale.com">BioScale</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>to dilute beads and FlAb</td>
</tr>
<tr>
<td>Sample Diluent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://www.bioscale.com">BioScale</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>to dilute samples and calibrators</td>
</tr>
<tr>
<td>Running Buffer Additive</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://www.bioscale.com">BioScale</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

developing custom chinese hamster ovary-host cell protein assays using acoustic membrane microparticle technology

غالبا ما تكون محدودة فحوصات مخصصة للبروتينات فريدة لاكتشاف دليل تستهلك الوقت والتقنيات الكميات مثل ELISA أو البقع الغربية نظرا لتعقيد وضع على منصات بديلة. BioScale غشاء الصوتية الملكية MicroParticle (AMMP) التكنولوجيا يسمح المناعية شطيرة المتقدمة بسهولة للاستخدام على منصة VIBE ، وتوفير أفضل الحساسية ، واستنساخ ، وتشغيل الآلي. على النحو المنصوص عليه على سبيل المثال ، هذا البروتوكول يحدد الإجراء مخصص لوضع الهامستر الصيني بروتين الخلية المبيض ، المضيف (تشو المندوبية) مقايسة. ويمكن تتبع المبادئ العامة التي وردت هنا من أجل تطوير مجموعة واسعة من المناعية. وهو مستضد AMMP التدابير تركيز الفحص عن طريق قياس التغيرات في وتيرة التذبذب الناجمة عن ربط المجهرية الدقيقة لسطح حساس لحساب. وهو يتألف من أربعة عناصر رئيسية هي : (1) خرطوشة تحتوي على رقاقة الاستشعار functionalized ثمانية (2) الأجسام المضادة المسماة المغناطيسي المجهرية الدقيقة ، (3) ناشبة الأضداد الموسومة التي تربط على سطح الرقاقة functionalized (4) تحتوي على عينات من مستضد الفائدة. جهاز الاستشعار البيولوجي BioScale هو جهاز الرنين أن يحتوي على ثمانية مسارات فردية مع الأغشية fluidic منفصلة. الأغشية تغيير التردد التذبذب ردا على تراكم الكتلة على السطح ، ويستخدم هذا التردد لتغيير quantitate مقدار كتلة المضافة. لتسهيل استخدامها في مجموعة متنوعة واسعة من المناعية هو functionalized المجس مع الأضداد المضادة للالناشبة. يتم تعديل مقايسة الأضداد محددة من خلال اقتران التساهمية من علامة ناشبة لأحد الأجسام المضادة والبيوتين إلى أخرى. يستخدم التسمية البيوتين لربط الأجسام المضادة لstreptavidin الخرز المغناطيسي الذي يقترن ، في تركيبة مع الأضداد الموسومة ناشبة ، تستخدم لالتقاط الحليلة في شطيرة. مجمع بربط الشريحة من خلال التفاعل anti-hapten/hapten. في نهاية كل تجربة تشغيل أجهزة الاستشعار يتم تنظيفها مع حمض مخفف تمكين التحليل المتسلسل من أعمدة من لوحة 96 - جيدا. هنا ، نقدم طريقة لوضع مخصص مقايسة AMMP تشو المندوبية العمليات الحيوية من أجل التنمية. ويمكن تطوير أو تعديل المقايسات AMMP المقايسات القائمة في المقايسات AMMP تقديم أداء أفضل (استنساخ ، والحساسية) في عينات معقدة وتقليل الوقت المشغل. بروتوكول يبين الخطوات من أجل التنمية واستعراض نتائج مناقشة الفرع التمثيلي. للحصول على شرح أكثر تعمقا التحسين مقايسة والمعلمات الاتصال BioScale التخصيص. تقدم هذه المجموعة عام المقايسات تطوير العمليات البيولوجية مثل البروتينات المتبقية ألف عيار المنتج ، وتشو المندوبية.

Watch this Scientific Journal Video about Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology at JoVE.com

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

يوصف تطوير المقايسات على منصة مخصصة لVIBE أكثر حساسية والنتائج واستنساخه في مصفوفات الآلي المعقدة. خرطوشة عالمي يسمح المقايسات تكييفها بسهولة للاستخدام مع فحوصات مخصصة. هذا التنوع يتيح التطور السريع والتحقق من صحة الرواية أو الإصدارات المقايسات الآلي دليل المقايسات القائمة ، والمتمثلة في هذا الفيديو.

مخصص الصينية النامية الهامستر بروتين الخلية المبيض في استضافة فحوصات باستخدام التكنولوجيا الصوتية Microparticle الغشائية

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

developing-custom-chinese-hamster-ovary-host-cell-protein-assays

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.1K Views.  BioScale, Inc.. يوصف تطوير المقايسات على منصة مخصصة لVIBE أكثر حساسية والنتائج واستنساخه في مصفوفات الآلي المعقدة. خرطوشة عالمي يسمح المقايسات تكييفها بسهولة للاستخدام مع فحوصات مخصصة. هذا التنوع يتيح التطور السريع والتحقق من صحة الرواية أو الإصدارات المقايسات الآلي دليل المق?...

Video: Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Increasing cDNA Yields from Single-cell Quantities of mRNA in Standard Laboratory Reverse Transcriptase Reactions using Acoustic Microstreaming

Correlating gene expression with cell behavior is ideally done at the single-cell level. However, this is not easily achieved because the small amount of labile mRNA present in a single cell (1-5% of 1-50pg total RNA, or 0.01-2.5pg mRNA, per cell 1) mostly degrades before it can be reverse transcribed into a stable cDNA copy. For example, using standard laboratory reagents and hardware, only a small number of genes can be qualitatively assessed per cell 2. One way to increase the efficiency of standard laboratory reverse transcriptase (RT) reactions (i.e. standard reagents in microliter volumes) comprising single-cell amounts of mRNA would be to more rapidly mix the reagents so the mRNA can be converted to cDNA before it degrades. However this is not trivial because at microliter scales liquid flow is laminar, i.e. currently available methods of mixing (i.e. shaking, vortexing and trituration) fail to produce sufficient chaotic motion to effectively mix reagents. To solve this problem, micro-scale mixing techniques have to be used 3,4. A number of microfluidic-based mixing technologies have been developed which successfully increase RT reaction yields 5-8. However, microfluidics technologies require specialized hardware that is relatively expensive and not yet widely available. A cheaper, more convenient solution is desirable. The main objective of this study is to demonstrate how application of a novel "micromixing" technique to standard laboratory RT reactions comprising single-cell quantities of mRNA significantly increases their cDNA yields. We find cDNA yields increase by approximately 10-100-fold, which enables: (1) greater numbers of genes to be analyzed per cell; (2) more quantitative analysis of gene expression; and (3) better detection of low-abundance genes in single cells. The micromixing is based on acoustic microstreaming 9-12, a phenomenon where sound waves propagating around a small obstacle create a mean flow near the obstacle. We have developed an acoustic microstreaming-based device ("micromixer") with a key simplification; acoustic microstreaming can be achieved at audio frequencies by ensuring the system has a liquid-air interface with a small radius of curvature 13. The meniscus of a microliter volume of solution in a tube provides an appropriately small radius of curvature. The use of audio frequencies means that the hardware can be inexpensive and versatile 13, and nucleic acids and other biochemical reagents are not damaged like they can be with standard laboratory sonicators.

We describe a novel method for increasing cDNA yield from single-cell quantities of mRNA in otherwise standard laboratory reverse transcription reactions. The novelty resides in the use of a micromixer, which utilizes the phenomenon of acoustic microstreaming, to mix fluids at microliter scales more effectively than shaking, vortexing or trituration.

زيادة غلال [كدنا] من خلية واحدة كميات مرنا في مختبر قياسي ردود الفعل الناسخ العكسي باستخدام Microstreaming الصوتية

Correlating gene expression with cell behavior is ideally done at the single-cell level.  However, this is not easily achieved because the small amount of ...

Isolation and Characterization Of Chimeric Human Fc-expressing Proteins Using Protein A Membrane Adsorbers And A Streamlined Workflow

Laboratory scale to industrial scale purification of biomolecules from cell culture supernatants and lysed cell solutions can be accomplished using affinity chromatography.&#160;While affinity chromatography using porous protein A agarose beads packed in columns is arguably the most common method of laboratory scale isolation of antibodies and recombinant proteins expressing Fc fragments of IgG, it can be a time consuming and expensive process.&#160;Time and financial constraints are especially daunting in small basic science labs that must recover hundreds of micrograms to milligram quantities of protein from dilute solutions, yet lack access to high pressure liquid delivery systems and/or personnel with expertise in bioseparations. Moreover, product quantification and characterization may also excessively lengthen processing time over several workdays and inflate expenses (consumables, wages, etc.).&#160;Therefore, a fast, inexpensive, yet effective protocol is needed for laboratory scale isolation and characterization of antibodies and other proteins possessing an Fc fragment.&#160;To this end, we have devised a protocol that can be completed by limited-experience technical staff in less than 9 hr (roughly one workday) and as quickly as 4 hr, as opposed to traditional methods that demand 20+ work hours. Most required equipment is readily available in standard biomedical science, biochemistry, and (bio)chemical engineering labs, and all reagents are commercially available.&#160;To demonstrate this protocol, representative results are presented in which chimeric&#160;murine galectin-1 fused to human Fc (Gal-1hFc) from cell culture supernatant was isolated using a protein A membrane adsorber.&#160;Purified Gal-1hFc was quantified using an expedited Western blotting analysis procedure and characterized using flow cytometry. The streamlined workflow can be modified for other Fc-expressing proteins, such as antibodies, and/or altered to incorporate alternative quantification and characterization methods.

Compared with traditional affinity chromatography using protein A agarose bead-packed columns, protein A membrane adsorbers can significantly speed laboratory-scale isolation of antibodies and other Fc fragment-expressing proteins.&#160;Appropriate analysis and quantification methods can further accelerate protein processing, allowing isolation/characterization to be completed in one workday, instead of 20+ work hours.

عزل وتوصيف البروتينات التعبير عن مدينة Chimeric الإنسان باستخدام البروتين A غشاء Adsorbers وسير عمل مبسطة

Laboratory scale to industrial scale purification of biomolecules from cell culture supernatants and lysed cell solutions can be accomplished using ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of bioprocess conditions. One important aspect is the improvement of cultivation medium to provide an optimal environment for microbial formation of the product of interest. It is well accepted that the media composition can dramatically influence overall bioprocess performance. Nutrition medium optimization is known to improve recombinant protein production with microbial systems and thus, this is a rewarding step in bioprocess development. However, very often standard media recipes are taken from literature, since tailor-made design of the cultivation medium is a tedious task that demands microbioreactor technology for sufficient cultivation throughput, fast product analytics, as well as support by lab robotics to enable reliability in liquid handling steps. Furthermore, advanced mathematical methods are required for rationally analyzing measurement data and efficiently designing parallel experiments such as to achieve optimal information content.
The generic nature of the presented protocol allows for easy adaption to different lab equipment, other expression hosts, and target proteins of interest, as well as further bioprocess parameters. Moreover, other optimization objectives like protein production rate, specific yield, or product quality can be chosen to fit the scope of other optimization studies. The applied Kriging Toolbox (KriKit) is a general tool for Design of Experiments (DOE) that contributes to improved holistic bioprocess optimization. It also supports multi-objective optimization which can be important in optimizing both upstream and downstream processes.

This manuscript describes a generic approach for tailor-made design of microbial cultivation media. This is enabled by an iterative workflow combining Kriging-based experimental design and microbioreactor technology for sufficient cultivation throughput, which is supported by lab robotics to increase reliability and speed in liquid handling media preparation.

بروتوكول عام للاستفادة المثلى إنتاج البروتين مغايرة باستخدام تقنية ميكروبيوريكتور الآلي

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using Chinese hamster ovary (CHO) cells, culture and process conditions must be optimized to maximize antibody titers and achieve target quality profiles. Typically, this optimization uses automated microscale bioreactors (15 mL) to screen multiple process conditions in parallel. Optimization criteria include culture performance and the critical quality attributes (CQAs) of the monoclonal antibody (mAb) product, which may impact its efficacy and safety. Culture performance metrics include cell growth and nutrient consumption, while the CQAs include the mAb's N-glycosylation and aggregation profiles, charge variants, and molecular weight. This detailed protocol describes how to purify and subsequently analyze HCCF samples produced by an automated microbioreactor system to gain valuable performance metrics and outputs. First, an automated protein A fast protein liquid chromatography (FPLC) method is used to purify the mAb from harvested cell culture samples. Once concentrated, the glycan profiles are analyzed by mass spectrometry using a specific platform (refer to the Table of Materials). Antibody molecular weights and aggregation profiles are determined using size exclusion chromatography-multiple angle light scattering (SEC-MALS), while charge variants are analyzed using microchip capillary zone electrophoresis (mCZE). In addition to the culture performance metrics captured during the bioreactor process (i.e., culture viability, cell counts, and common metabolites including glutamine, glucose, lactate, and ammonia), spent media is analyzed to identify limiting nutrients to improve the feeding strategies and overall process design. Therefore, a detailed protocol for the absolute quantification of amino acids by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) of spent media is also described. The methods used in this protocol take advantage of high-throughput platforms that are compatible for large numbers of small-volume samples.

A detailed protocol for the purification and subsequent analysis of a monoclonal antibody from harvested cell culture fluid (HCCF) of automated microbioreactors has been described. Use of analytics to determine critical quality attributes (CQAs) and maximizing limited sample volume to extract vital information is also presented.

تنقية وتحليل الأجسام المضادة أحادية النسيلة من خلايا المبيض الهامستر الصينية باستخدام نظام مفاعل ميكروبيوم الآلي

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain selection and by developing bioprocess parameters. Shake flasks have been used for this purpose. They, however, lack the capability to control the process parameters such as pH and dissolved oxygen (DO). This limitation can be overcome with the help of an automated micro-bioreactor. These bioreactors mimic cultivation at a larger scale. One of the major advantages of this system is the integration of the Design of Experiment (DOE) in the software. This integration enables establishing a design where multiple process parameters can be varied simultaneously. The critical process parameters and optimum bioprocess conditions can be analyzed within the software. The focus of the work presented here is to introduce the user to the steps involved in process design in the software and incorporation of the DOE within the cultivation run.

Here, we present a detailed procedure to run a Design of Experiment in an automated micro-bioreactor followed by cell harvest and protein quantification using a Protein A column.

عملية التحسين باستخدام الإنتاجية العالية الإنتاجية المفاعلات الحيوية الدقيقة الآلية في زراعة الخلايا المبيض الهامستر الصينية

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell mimicking environment. Furthermore, the development of cell-free expression systems has demonstrated the ability to reconstitute the protein production, transcription and translation processes (DNA&#8594;RNA&#8594;protein) in a controlled manner, harnessing synthetic biology. Here we describe a protocol for preparing a cell-free expression system, including the production of a potent bacterial lysate and encapsulating this lysate inside cholesterol-rich lipid-based giant unilamellar vesicles (GUVs) (i.e., stable liposomes), to form synthetic cells. The protocol describes the methods for preparing the components of the synthetic cells including the production of active bacterial lysates, followed by a detailed step-by-step preparation of the synthetic cells based on a water-in-oil emulsion transfer method. These facilitate the production of millions of synthetic cells in a simple and affordable manner with a high versatility for producing different types of proteins. The obtained synthetic cells can be used to investigate protein/RNA production and activity in an isolated environment, in directed evolution, and also as a controlled drug delivery platform for on-demand production of therapeutic proteins inside the body.

This protocol describes the method, materials, equipment and steps for bottom-up preparation of RNA and protein producing synthetic cells. The inner aqueous compartment of the synthetic cells contained the S30 bacterial lysate encapsulated within a lipid bilayer (i.e., stable liposomes), using a water-in-oil emulsion transfer method.

إعداد البروتين إنتاج الخلايا الاصطناعية باستخدام مقتطفات البكتيريا الحرة الخلية، Liposomes ونقل المستحلب

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested cell culture fluid. While traditional methods like centrifugation or filtration are widely implemented for cell removal, the equipment for these processes have large footprints and operation can involve contamination risks and filter fouling. Additionally, traditional methods may not be ideal for continuous bioprocessing schemes for primary clarification. Thus, an alternate application using acoustic (sound) waves was investigated to continuously separate cells from the cell culture fluid. Presented in this study is a detailed protocol for using a bench-scale acoustic wave separator (AWS) for the primary separation of culture fluid containing a monoclonal IgG1 antibody from a CHO cell bioreactor harvest. Representative data are presented from the AWS and demonstrate how to achieve effective cell clarification and product recovery. Finally, potential applications for AWS in continuous bioprocessing are discussed. Overall, this study provides a practical and general protocol for the implementation of AWS in primary clarification for CHO cell cultures and further describes its application potential in continuous bioprocessing.

Presented here is a protocol for the primary clarification of CHO cell culture using an acoustic separator. This protocol can be used for the primary clarification of shake flask cultures or bioreactor harvests and has the potential application for continuous clarification of the cell bleed material during perfusion bioreactor operations.

التوضيح الأولي لسائل زراعة الخلايا المقطوعة CHO باستخدام فاصل صوتي

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...

Formulation and Acoustic Modulation of Optically Vaporized Perfluorocarbon Nanodroplets

Microbubbles are the most commonly used imaging contrast agent in ultrasound. However, due to their size, they are limited to vascular compartments. These microbubbles can be condensed or formulated as perfluorocarbon nanodroplets (PFCnDs) that are small enough to extravasate and then be triggered acoustically at the target site. These nanoparticles can be further enhanced by including an optical absorber such as near infrared organic dye or nanoparticles (e.g., copper sulfide nanoparticles or gold nanoparticles/nanorods). Optically tagged PFCnDs can be vaporized through laser irradiation in a process known as optical droplet vaporization (ODV). This process of activation enables the use of high boiling point perfluorocarbon cores, which cannot be vaporized acoustically under the maximum mechanical index threshold for diagnostic imaging. Higher boiling point cores result in droplets that will recondense after vaporization, resulting in "blinking" PFCnDs that briefly produce contrast after vaporization before condensing back into nanodroplet form. This process can be repeated to produce contrast on demand, allowing for the background free imaging, multiplexing, super-resolution, and contrast enhancement through both optical and acoustic modulation. This article will demonstrate how to synthesize optically-triggerable, lipid shell PFCnDs utilizing probe sonication, create polyacrylamide phantoms to characterize the nanodroplets, and acoustically modulate the PFCnDs after ODV to improve contrast.

Optically activated perfluorocarbon nanodroplets show promise in imaging applications outside of the vascular system. This article will demonstrate how to synthesize these particles, crosslink polyacrylamide phantoms, and modulate the droplets acoustically to enhance their signal.

صياغة وتعديل صوتي للقطرات النانوية المشبعة بالفلور الكربون المتبخرة بصريا

Microbubbles are the most commonly used imaging contrast agent in ultrasound. However, due to their size, they are limited to vascular compartments. These ...

Rapid Antibody Glycoengineering in Chinese Hamster Ovary Cells

Recombinant monoclonal antibodies bind specific molecular targets and, subsequently, induce an immune response or inhibit the binding of other ligands. However, monoclonal antibody functionality and half-life may be reduced by the type and distribution of host-specific glycosylation. Attempts to produce superior antibodies have inspired the development of genetically modified producer cells that synthesize glyco-optimized antibodies. Glycoengineering typically requires the generation of a stable knockout or knockin cell line using methods such as clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9. Monoclonal antibodies produced by engineered cells are then characterized using mass spectrometric methods to determine if the desired glycoprofile has been obtained. This strategy is time-consuming, technically challenging, and requires specialists. Therefore, an alternative strategy that utilizes streamlined protocols for genetic glycoengineering and glycan detection may assist endeavors toward optimal antibodies. In this proof-of-concept study, an IgG-producing Chinese hamster ovary cell served as an ideal host to optimize glycoengineering. Short interfering RNA targeting the Fut8 gene was delivered to Chinese hamster ovary cells, and the resulting changes in FUT8 protein expression were quantified. The results indicate that knockdown by this method was efficient, leading to a ~60% reduction in FUT8. Complementary analysis of the antibody glycoprofile was performed using a rapid yet highly sensitive technique: capillary gel electrophoresis and laser-induced fluorescence detection. All knockdown experiments showed an increase in afucosylated glycans; however, the greatest shift achieved in this study was ~20%. This protocol simplifies glycoengineering efforts by harnessing in silico design tools, commercially synthesized gene targeting reagents, and rapid quantification assays that do not require extensive prior experience. As such, the time efficiencies offered by this protocol may assist investigations into new gene targets.

The glycosylation pattern of an antibody determines its clinical performance, thus industrial and academic efforts to control glycosylation persist. Since typical glycoengineering campaigns are time- and labor-intensive, the generation of a rapid protocol to characterize the impact of glycosylation genes using transient silencing would prove useful.

هندسة جليكو الأجسام المضادة السريعة في خلايا مبيض الهامستر الصينية

Recombinant monoclonal antibodies bind specific molecular targets and, subsequently, induce an immune response or inhibit the binding of other ligands. ...

In Vitro Cleavage Assays using Purified Recombinant Drosophila Caspases for Substrate Screening

Caspases are very specific cell death proteases that are involved in apoptotic and non-apoptotic processes. While the role of caspases during apoptosis has been very well defined and many apoptotic proteolytic substrates of caspases have been identified and characterized, the role of caspases for non-apoptotic processes is not well understood. In particular, few non-apoptotic substrates of caspases have been identified thus far. Here, in order to facilitate the identification and characterization of potential caspase substrates, a protocol that allows the testing of candidate substrates in caspase cleavage assays in vitro is described. This protocol includes the production and purification of recombinant caspase proteins, the production of the candidate substrates either recombinantly or in a cell-free expression system, and the actual in vitro cleavage reaction followed by SDS-PAGE and immunoblotting. This protocol is tailored for the Drosophila caspases Dronc and Drice but can easily be adapted for caspases from other organisms, including mammals.

In Vitro Cleavage Assays using Purified Recombinant Drosophila Caspases for Substrate Screening

Here we present a protocol to express and purify recombinant Drosophila caspases Dronc and Drice, and their use in in vitro cleavage assays.

في المختبر مقايسات الانقسام باستخدام كاسباز ذبابة الفاكهة المؤتلف المنقى لفحص الركيزة

Caspases are very specific cell death proteases that are involved in apoptotic and non-apoptotic processes. While the role of caspases during apoptosis ...