1. Microparticle הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבל נוגדנים באמצעות ביוטין NHS לכימיה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת מידת Biotinylation </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המצומד streptavidin חרוזים עם נוגדן Biotinylated <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את החרוזים הבקבוקון המקורי על ידי vortexing במשך 1-2 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot נפח הרצויה של חרוזים לתוך צינור microcentrifuge </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את החרוזים 3 פעמים עם PBST: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור המכיל את החרוזים על המגנט במשך 2 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant על ידי שאיפה עם הצינור על המגנט. היזהר שלא לשבש את החרוזים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא את הצינור מתוך המגנט ולהוסיף 1 מ&quot;ל PBST </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס למשך 20 שניות כדי resuspend את החרוזים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה למשך 5 שניות כדי להסיר את החרוזים מן הכובע </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור 2.3.1-2.3.5 עוד פעמיים </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המקום השלישי לשטוף בצינור על המגנט לשאוב PBST </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נוגדן biotinylated על חרוזים resuspend </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש צורך להביא את עוצמת הקול של הנוגדן biotinylated עד 300 μL עם PBS. אם נפח נוגדן כבר יותר מ 300 μL אין להוסיף כל PBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על השעיית חרוז / נוגדנים במשך 30 דקות ב RT על שייקר מערבולת או rotator צינור </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 פעמים עם PBST כמו בשלב 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק עם חרוזים BSA biotinylated <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף third להוסיף 10 מיקרוגרם / מ&quot;ג biotinylated BSA, להתאים את עוצמת הקול כדי μL 300 עם PBS במידת הצורך, דגירה עם תסיסה במשך 30 דקות </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 פעמים עם PBST כמו בשלב 3 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את החרוזים μL 100 של BSA PBS/0.05%. אזיד הנתרן ניתן להוסיף לאחסון ארוך טווח </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בפרוטוקולים סטנדרטיים NHS והעמסת, fluoresceinate את הנוגדן גלאי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את מידת Fluorescination </li></ol> 2. HCP - פיתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו פתרונות עבודה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוגדנים והעמסת שכותרתו (FL-AB): רוב CHO-HCP מבחני להשתמש Fl-Ab בריכוז הסופי של 400 ng / mL. Fl-Ab יתווסף ¼ נפח assay הסופי, ולכן הריכוז של הפתרון עובד הוא 1.6 מיקרוגרם / מ&quot;ל. הכן את הפתרון הזה על ידי דילול המניות flab עם BioScale ביד / flab diluent. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חרוזים: רוב CHO-HCP מבחני להשתמש חרוזים בריכוז הסופי של 2x10 5 חרוזים / mL. מגיב חרוז מהווה ¼ נפח assay הסופי, ולכן הריכוז של הפתרון הוא לעבוד 8x10 5 חרוזים / mL. הכן את הפתרון הזה על ידי דילול המניות חרוז עם BioScale ביד / flab diluent. וורטקס המניות חרוז היטב כדי לוודא את כל החרוזים נמצאים ההשעיה לפני הסרת aliquot. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעלת מאגר: הרכב למאגר פועל עשויה להיות מותאם במיוחד את הנוגדנים המשמשים לפתח את assay, אולם מספר CHO-HCP מבחני פותחו באמצעות 10 mM HEPES חיץ, 1% Tween, pH 7.5. BioScale פיתחה תוסף עבור למאגר פועל (מסופק עם ערכת פיתוח) אשר מתווסף למאגר ריכוז של 1% לפני השימוש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל הכיול דגימות עם diluent לדוגמה BioScale. </li></ol> 3. VIBE מערכת הגדרת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובבו את Workstation על VIBE </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את אספקת מערכת ופסולת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראש מערכת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מחסנית VIBE </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסלול הצינורות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תבנית assay על ידי מילוי דף שכותרתו &quot;הגדרת דוגמה&quot;. BioScale מספק יכולת יש תבנית אחת assay assay עבור כל תחנת עבודה VIBE. זה מאפשר למשתמש לערוך ולשמור מציין ספציפית את גליון &quot;הערות&quot; של תבנית עבור מבחני שונות שמירה תיעוד מלא של הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תבנית assay ראשוניים להגדיר: התחל על ידי מילוי טבלה (בפינה השמאלית העליונה) של טווח ריכוז של סטנדרטים assay של הגיליון &quot;הגדרת דוגמה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, להזין מידע נוסף בטבלה בצד ימין של הסטנדרטים (Setup טור פשוט קרא, אחת הוסף מגיב ואת שני setups מגיב הוספה) להורות Workstation VIBE כמה דגימות ארוך צריך לדגור, כמה נפח הוא מגיב שיועברו , כמה זמן את הצטברות מדגם צריך להיות, והאם מיזוג חיישן טיהור של בדיקות דיו נחוצים, וכו &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את הצלחת הפריסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען מדגם / ריאגנטים לתוך הצלחות. VIBE יספק את הכרכים הדרושים צלחת מגיב. נפח לדוגמה יכול להשתנות, אבל במחצית של נפח assay סך של 120 μL היא מקום התחלה טובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מכסה צלחת. טען צלחות לסיפון תחנת עבודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את assay להתחיל את האשף, לעבור את האשף ולהתחיל assay. </li></ol> 4. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2493/2493fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1: immunoassay AMMP סנדוויץ </p&gt; בתחנת עבודה VIBE, assay AMMP אמצעים ריכוז אנטיגן. אותות נמדד כאשר נוגדן אנטיגן חרוז-hapten נקשר החיישן דרך hapten / אנטי hapten אינטראקציה. התחדשות מביא את החיישן בחזרה למצב ההתחלה ידי הסרת מתחמי החיסונית. <img src="/files/ftp_upload/2493/2493fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2: CHO-HCP AMMP עקומת כיול Assay איור 2 לעיל הוא דוגמה של עקומת HCP CHO AMMP כיול Assay. ניתוח ניתן לבצע דגימות מכל רחבי הנחל לטיהור כולל הכור בדייקנות reproducibility גבוהה. <img src="/files/ftp_upload/2493/2493fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3: חלבון עקומת כיול AMMP Assay איור 3 הוא עקומת כיול של חלבון שיורית Assay AMMP, הופיע עם חלבון VIBE שיורית ערכת Assay. הערכה דומה ניתן להשתמש assay מהיר עם תקופת דגירה 30 דקות, או לתוצאות יותר רגיש טווח דינמי רחב יותר עם תקופת דגירה זמן רב יותר ללא איבוד של דיוק או דיוק, אשר שניהם הם בדרך כלל טוב יותר מאשר המקבילה ELISA של משתמשים רשומים &quot; ידיים <img src="/files/ftp_upload/2493/2493fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4: מוצר titer AMMP Assay Workstation VIBE יכול לשמש גם עבור assay מוצר titer, התוצאות שמוצג בתרשים 4. בביצוע שונה מאשר מבחני AMMP אחרים, assay זה אינו מחייב טיפול מדגם אחר מאשר דילול פשוט, או חרוזים quantitation אומת ב &quot;שום ספין&quot; דגימות המכיל מעל 10 מיליון תאים על פני מגוון רחב של viabilities. <img src="/files/ftp_upload/2493/2493fig5.jpg" alt="איור 5" /> איור 5: סטנדרטי AMMP Assay עקומת עבור assay GST-Gadd34 סמן ביולוגי שמוצג באיור 5 היא עקומת תקן של האות המתקבל על ידי BioAnalyzer VIBE (לוח א &#39;) או באמצעות טכנולוגיה AlphaScreen רקומביננטי GST-Gadd34. תוצאות בפלטפורמת VIBE היו כ יומן רגיש יותר באמצעות נוגדנים אותו. AMMP ממנף את המדידה של חלקיקים גדולים יותר פחות, אך עדיין נהנית ללכוד פתרון שלב ומורכב היווצרות זיהוי. <img src="/files/ftp_upload/2493/2493fig6.jpg" alt="איור 6" /> איור 6: עקומת AMMP Assay תקן GST-Gadd34 במדגם הגידול באיור 6, אינדוקציה של Gadd34 מ CWR22 xenografts נבדק נוכחות או היעדר של מעכבי פרוטאזום boronate כמו מנותח על ידי אחד BioAnalyzer VIBE (לוח א &#39;) או AlphaScreen (לוח ב&#39;). הפלטפורמה VIBE היה מסוגל לייצר רגיש, תוצאות לשעתקו ב xenografts הגידול vivo ואילו האות AlphaScreen היה הרווה עם מיקרוגרם מוגברת של חלבון. דוגמה זו מראה את הכוח של הטכנולוגיה AMMP בדגימות מורכבות ביותר. בשל שבב זיהוי רגיש יעילות גבוהה של המגנט ליד הצ&#39;יפס, המספרים הנמוכים של microparticles מגנטי יכול ביעילות reproducibly לחפש עבור מטרה שפע נמוך בתוך המורכבות של lysed הסלולר (כולל ריאגנטים תמוגה) ופסולת דם.

המחברים של מאמר זה מועסקים על ידי Bioscale, Inc המייצרת כמה מכשירים ריאגנטים שימוש במאמר זה.

הדוגמאות לעיל להפגין רגישות גבוהה של AMMP תוצאות כמותיות בדגימות מורכבות. זה ביצועים, כאשר נמסר בקלות ובקרה של עיצוב ריאגנטים לתוך המערכת מאפשרת עבור מגוון של יישומים. יישומים אלה עשויים להיות מטרה ספציפית, כמו Gadd34 בגידול, או גנרי למגוון מטרות, כמו זיהוי התא המארח quantitation חלבון בדגימות כי לחצות את הנחל טיהור. תקורה נמוכה VIBE פלטפורמה בשילוב עם AMMP גמישה מספק כלי רב עוצמה להעברת מבחני קריטי.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>NHS-Chromogenic-biotin or NHS-Chromogenic Biotin Labeling kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>If NHS-Chromogenic-biotin is purchased as a reagent the following additional materials will be required</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water-miscible organic solvent such as dimethylsulfoxide (DMSO) or dimethylformamide (DMF)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate buffered saline (PBS) or other amine free buffer (pH 7 &#x2013; 9)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Desalting columns or dialysis units for buffer exchange</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spectrophotometer able to measure 354 and 280 nm &#x2013; for measuring protein and biotin concentrations</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotinylated antibody (2-5 biotins/Ab)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin magnetic beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://www.bioscale.com">BioScale</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>(10 mg/mL) ~108 beads/mg</td>
</tr>
<tr>
<td>Magnet for microcentrifuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England BioLabs</td>
<td>cat # S1510S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotinylated BSA for blocking</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS 0.1% Tween 20</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vortex</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microcentrifuge holder for Vortex or tube rotator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Antibody or protein to be labeled</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NHS-Fluorescein or NHS-Fluorescein Labeling kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>If NHS-Fluorescein is purchased as a reagent the following additional materials will be required</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water-miscible organic solvent such as dimethylsulfoxide (DMSO) or dimethylformamide (DMF)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 mM borate, pH 8.5 or other amine free buffer (pH 7 &#x2013; 9)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Desalting columns or dialysis units for buffer exchange</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Measurement of protein and fluorescein concentrations requires a spectrophotometer able to measure 493 and 280 nm.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Diluent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://www.bioscale.com">BioScale</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>to dilute beads and FlAb</td>
</tr>
<tr>
<td>Sample Diluent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://www.bioscale.com">BioScale</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>to dilute samples and calibrators</td>
</tr>
<tr>
<td>Running Buffer Additive</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://www.bioscale.com">BioScale</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

developing custom chinese hamster ovary-host cell protein assays using acoustic membrane microparticle technology

מבחני התאמה אישית של חלבונים ייחודיים מוגבלים לעיתים קרובות בזיהוי זמן רב ידני וטכניקות quantitation כגון ELISA או כתמים המערבי בשל המורכבות של פיתוח על גבי פלטפורמות חלופיות. ממברנה אקוסטית הקניינית של BioScale microparticle (AMMP) הטכנולוגיה מאפשרת immunoassays כריך להתפתח בקלות לשימוש בפלטפורמת VIBE, מתן רגישות יותר, שחזור, והפעלה אוטומטית. בתנאי כדוגמה, פרוטוקול זה מתאר את הליך לפיתוח אוגר מנהג סינית השחלות-Cell Host חלבון (CHO-HCP) assay. העקרונות הכלליים שהותוו כאן ניתן בעקבות לפיתוח מגוון רחב של immunoassays. Assay מודד AMMP אנטיגן ריכוז ידי מדידת השינויים בתדירות תנודה הנגרמת על ידי קשירה של microparticles אל פני השטח את חיישן לחשב. היא מורכבת מארבעה מרכיבים עיקריים: (1) מחסנית המכילה שבב פונקציונליות eight חיישן (2) שכותרתו נוגדן microparticles מגנטי, (3) נוגדנים hapten מתויג שקושר אל פני השטח של שבב פונקציונליות (4) דגימות המכיל את האנטיגן של עניין. Biosensor של BioScale הוא מכשיר התהודה זה מכיל שמונה ממברנות הפרט עם fluidic נתיבים נפרדים. ממברנות שינוי תדר תנודה בתגובה צבירת מסה על פני השטח, וזה שינוי תדר משמש לכמת את כמות המסה הוסיף. כדי להקל על השימוש במגוון רחב של immunoassays החיישן פונקציונליות עם נוגדן אנטי hapten. נוגדנים ספציפיים Assay משתנים דרך נטיה קוולנטיים של תג hapten על נוגדן אחד ביוטין השני. התווית ביוטין משמש כדי לאגד את הנוגדן streptavidin בשילוב חרוזים מגנטיים, אשר בשילוב עם נוגדנים hapten-מתויג, משמשים כדי ללכוד את אנליטי בתוך כריך. הקומפלקס נקשר השבב דרך האינטראקציה anti-hapten/hapten. בסוף כל assay להפעיל את החיישנים מנקים עם חומצה לדלל המאפשר ניתוח רציף של עמודים מתוך צלחת 96-היטב. כאן, אנו מציגים את השיטה לפיתוח assay אישית CHO-HCP AMMP לפיתוח Bioprocess. פיתוח מבחני AMMP או שינוי מבחני הקיימים מבחני AMMP יכול לספק ביצועים טובים יותר (, רגישות reproducibility) בדגימות מורכבות הזמן מפעיל מופחת. פרוטוקול מראה את הצעדים לפיתוח בסעיף דיון ביקורות תוצאות נציג. לקבלת הסבר מעמיק יותר של אופטימיזציה assay ופרמטרים התאמה אישית מגע BioScale. ערכה זו מציעה הגנרית מבחני Bioprocess פיתוח כגון חלבון שיורית titer, מוצר, ואת CHO-HCP.

Watch this Scientific Journal Video about Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology at JoVE.com

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

הפיתוח של מבחני אישית על פלטפורמה VIBE עבור רגישים יותר, תוצאות לשעתקו אוטומטיות מטריצות מורכבות מתואר. מחסנית האוניברסלי מאפשר מבחני להיות מותאם בקלות לשימוש עם מבחני אישית. גמישות זו מאפשרת אימות פיתוח מהיר של מבחני רומן או בגרסאות אוטומטיות של מבחני ידנית הקיימת, מדגים בסרטון הזה.

פיתוח התאמה אישית הסינית השחלות-מארח אוגר Cell חלבון מבחני באמצעות טכנולוגיה אקוסטית microparticle ממברנה

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

developing-custom-chinese-hamster-ovary-host-cell-protein-assays

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.1K Views.  BioScale, Inc.. הפיתוח של מבחני אישית על פלטפורמה VIBE עבור רגישים יותר, תוצאות לשעתקו אוטומטיות מטריצות מורכבות מתואר. מחסנית האוניברסלי מאפשר מבחני להיות מותאם בקלות לשימוש עם מבחני אישית. גמישות זו מאפשרת אימות פיתוח מהיר של מבחני רומן או בגרסאות אוטומטיות של מבחני ידנית הקי?...

Video: Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Increasing cDNA Yields from Single-cell Quantities of mRNA in Standard Laboratory Reverse Transcriptase Reactions using Acoustic Microstreaming

Correlating gene expression with cell behavior is ideally done at the single-cell level. However, this is not easily achieved because the small amount of labile mRNA present in a single cell (1-5% of 1-50pg total RNA, or 0.01-2.5pg mRNA, per cell 1) mostly degrades before it can be reverse transcribed into a stable cDNA copy. For example, using standard laboratory reagents and hardware, only a small number of genes can be qualitatively assessed per cell 2. One way to increase the efficiency of standard laboratory reverse transcriptase (RT) reactions (i.e. standard reagents in microliter volumes) comprising single-cell amounts of mRNA would be to more rapidly mix the reagents so the mRNA can be converted to cDNA before it degrades. However this is not trivial because at microliter scales liquid flow is laminar, i.e. currently available methods of mixing (i.e. shaking, vortexing and trituration) fail to produce sufficient chaotic motion to effectively mix reagents. To solve this problem, micro-scale mixing techniques have to be used 3,4. A number of microfluidic-based mixing technologies have been developed which successfully increase RT reaction yields 5-8. However, microfluidics technologies require specialized hardware that is relatively expensive and not yet widely available. A cheaper, more convenient solution is desirable. The main objective of this study is to demonstrate how application of a novel "micromixing" technique to standard laboratory RT reactions comprising single-cell quantities of mRNA significantly increases their cDNA yields. We find cDNA yields increase by approximately 10-100-fold, which enables: (1) greater numbers of genes to be analyzed per cell; (2) more quantitative analysis of gene expression; and (3) better detection of low-abundance genes in single cells. The micromixing is based on acoustic microstreaming 9-12, a phenomenon where sound waves propagating around a small obstacle create a mean flow near the obstacle. We have developed an acoustic microstreaming-based device ("micromixer") with a key simplification; acoustic microstreaming can be achieved at audio frequencies by ensuring the system has a liquid-air interface with a small radius of curvature 13. The meniscus of a microliter volume of solution in a tube provides an appropriately small radius of curvature. The use of audio frequencies means that the hardware can be inexpensive and versatile 13, and nucleic acids and other biochemical reagents are not damaged like they can be with standard laboratory sonicators.

We describe a novel method for increasing cDNA yield from single-cell quantities of mRNA in otherwise standard laboratory reverse transcription reactions. The novelty resides in the use of a micromixer, which utilizes the phenomenon of acoustic microstreaming, to mix fluids at microliter scales more effectively than shaking, vortexing or trituration.

הגדלת התשואות cDNA של תא בודד כמויות ה-mRNA בתקן Reverse transcriptase תגובות מעבדה באמצעות Microstreaming אקוסטית

Correlating gene expression with cell behavior is ideally done at the single-cell level.  However, this is not easily achieved because the small amount of ...

Isolation and Characterization Of Chimeric Human Fc-expressing Proteins Using Protein A Membrane Adsorbers And A Streamlined Workflow

Laboratory scale to industrial scale purification of biomolecules from cell culture supernatants and lysed cell solutions can be accomplished using affinity chromatography.&#160;While affinity chromatography using porous protein A agarose beads packed in columns is arguably the most common method of laboratory scale isolation of antibodies and recombinant proteins expressing Fc fragments of IgG, it can be a time consuming and expensive process.&#160;Time and financial constraints are especially daunting in small basic science labs that must recover hundreds of micrograms to milligram quantities of protein from dilute solutions, yet lack access to high pressure liquid delivery systems and/or personnel with expertise in bioseparations. Moreover, product quantification and characterization may also excessively lengthen processing time over several workdays and inflate expenses (consumables, wages, etc.).&#160;Therefore, a fast, inexpensive, yet effective protocol is needed for laboratory scale isolation and characterization of antibodies and other proteins possessing an Fc fragment.&#160;To this end, we have devised a protocol that can be completed by limited-experience technical staff in less than 9 hr (roughly one workday) and as quickly as 4 hr, as opposed to traditional methods that demand 20+ work hours. Most required equipment is readily available in standard biomedical science, biochemistry, and (bio)chemical engineering labs, and all reagents are commercially available.&#160;To demonstrate this protocol, representative results are presented in which chimeric&#160;murine galectin-1 fused to human Fc (Gal-1hFc) from cell culture supernatant was isolated using a protein A membrane adsorber.&#160;Purified Gal-1hFc was quantified using an expedited Western blotting analysis procedure and characterized using flow cytometry. The streamlined workflow can be modified for other Fc-expressing proteins, such as antibodies, and/or altered to incorporate alternative quantification and characterization methods.

Compared with traditional affinity chromatography using protein A agarose bead-packed columns, protein A membrane adsorbers can significantly speed laboratory-scale isolation of antibodies and other Fc fragment-expressing proteins.&#160;Appropriate analysis and quantification methods can further accelerate protein processing, allowing isolation/characterization to be completed in one workday, instead of 20+ work hours.

בידוד ואפיון של חלבונים דוברי Fc אנושיים כימריים באמצעות חלבון ספיחה ממברנה וזרימת עבודה יעילה

Laboratory scale to industrial scale purification of biomolecules from cell culture supernatants and lysed cell solutions can be accomplished using ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of bioprocess conditions. One important aspect is the improvement of cultivation medium to provide an optimal environment for microbial formation of the product of interest. It is well accepted that the media composition can dramatically influence overall bioprocess performance. Nutrition medium optimization is known to improve recombinant protein production with microbial systems and thus, this is a rewarding step in bioprocess development. However, very often standard media recipes are taken from literature, since tailor-made design of the cultivation medium is a tedious task that demands microbioreactor technology for sufficient cultivation throughput, fast product analytics, as well as support by lab robotics to enable reliability in liquid handling steps. Furthermore, advanced mathematical methods are required for rationally analyzing measurement data and efficiently designing parallel experiments such as to achieve optimal information content.
The generic nature of the presented protocol allows for easy adaption to different lab equipment, other expression hosts, and target proteins of interest, as well as further bioprocess parameters. Moreover, other optimization objectives like protein production rate, specific yield, or product quality can be chosen to fit the scope of other optimization studies. The applied Kriging Toolbox (KriKit) is a general tool for Design of Experiments (DOE) that contributes to improved holistic bioprocess optimization. It also supports multi-objective optimization which can be important in optimizing both upstream and downstream processes.

This manuscript describes a generic approach for tailor-made design of microbial cultivation media. This is enabled by an iterative workflow combining Kriging-based experimental design and microbioreactor technology for sufficient cultivation throughput, which is supported by lab robotics to increase reliability and speed in liquid handling media preparation.

פרוטוקול גנרי עבור אופטימיזציה של ייצור החלבון Heterologous באמצעות טכנולוגיית Microbioreactor אוטומטיות

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using Chinese hamster ovary (CHO) cells, culture and process conditions must be optimized to maximize antibody titers and achieve target quality profiles. Typically, this optimization uses automated microscale bioreactors (15 mL) to screen multiple process conditions in parallel. Optimization criteria include culture performance and the critical quality attributes (CQAs) of the monoclonal antibody (mAb) product, which may impact its efficacy and safety. Culture performance metrics include cell growth and nutrient consumption, while the CQAs include the mAb's N-glycosylation and aggregation profiles, charge variants, and molecular weight. This detailed protocol describes how to purify and subsequently analyze HCCF samples produced by an automated microbioreactor system to gain valuable performance metrics and outputs. First, an automated protein A fast protein liquid chromatography (FPLC) method is used to purify the mAb from harvested cell culture samples. Once concentrated, the glycan profiles are analyzed by mass spectrometry using a specific platform (refer to the Table of Materials). Antibody molecular weights and aggregation profiles are determined using size exclusion chromatography-multiple angle light scattering (SEC-MALS), while charge variants are analyzed using microchip capillary zone electrophoresis (mCZE). In addition to the culture performance metrics captured during the bioreactor process (i.e., culture viability, cell counts, and common metabolites including glutamine, glucose, lactate, and ammonia), spent media is analyzed to identify limiting nutrients to improve the feeding strategies and overall process design. Therefore, a detailed protocol for the absolute quantification of amino acids by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) of spent media is also described. The methods used in this protocol take advantage of high-throughput platforms that are compatible for large numbers of small-volume samples.

A detailed protocol for the purification and subsequent analysis of a monoclonal antibody from harvested cell culture fluid (HCCF) of automated microbioreactors has been described. Use of analytics to determine critical quality attributes (CQAs) and maximizing limited sample volume to extract vital information is also presented.

טיהור וניתוח של נוגדן חד שבטיים מן הסינית שחלות אוגר תאים באמצעות מערכת Microbioreactor חקן אוטומטי

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain selection and by developing bioprocess parameters. Shake flasks have been used for this purpose. They, however, lack the capability to control the process parameters such as pH and dissolved oxygen (DO). This limitation can be overcome with the help of an automated micro-bioreactor. These bioreactors mimic cultivation at a larger scale. One of the major advantages of this system is the integration of the Design of Experiment (DOE) in the software. This integration enables establishing a design where multiple process parameters can be varied simultaneously. The critical process parameters and optimum bioprocess conditions can be analyzed within the software. The focus of the work presented here is to introduce the user to the steps involved in process design in the software and incorporation of the DOE within the cultivation run.

Here, we present a detailed procedure to run a Design of Experiment in an automated micro-bioreactor followed by cell harvest and protein quantification using a Protein A column.

מיטוב תהליכים באמצעות תפוקה גבוהה מיקרו-Bioreactors שחקנים בסינית טיפוח תא שחלה אוגר

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell mimicking environment. Furthermore, the development of cell-free expression systems has demonstrated the ability to reconstitute the protein production, transcription and translation processes (DNA&#8594;RNA&#8594;protein) in a controlled manner, harnessing synthetic biology. Here we describe a protocol for preparing a cell-free expression system, including the production of a potent bacterial lysate and encapsulating this lysate inside cholesterol-rich lipid-based giant unilamellar vesicles (GUVs) (i.e., stable liposomes), to form synthetic cells. The protocol describes the methods for preparing the components of the synthetic cells including the production of active bacterial lysates, followed by a detailed step-by-step preparation of the synthetic cells based on a water-in-oil emulsion transfer method. These facilitate the production of millions of synthetic cells in a simple and affordable manner with a high versatility for producing different types of proteins. The obtained synthetic cells can be used to investigate protein/RNA production and activity in an isolated environment, in directed evolution, and also as a controlled drug delivery platform for on-demand production of therapeutic proteins inside the body.

This protocol describes the method, materials, equipment and steps for bottom-up preparation of RNA and protein producing synthetic cells. The inner aqueous compartment of the synthetic cells contained the S30 bacterial lysate encapsulated within a lipid bilayer (i.e., stable liposomes), using a water-in-oil emulsion transfer method.

הכנת חלבון הפקת תאים סינתטיים באמצעות שולפת תא חינם בקטריאלי, ליפוזומים והעברת אמולסיה

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested cell culture fluid. While traditional methods like centrifugation or filtration are widely implemented for cell removal, the equipment for these processes have large footprints and operation can involve contamination risks and filter fouling. Additionally, traditional methods may not be ideal for continuous bioprocessing schemes for primary clarification. Thus, an alternate application using acoustic (sound) waves was investigated to continuously separate cells from the cell culture fluid. Presented in this study is a detailed protocol for using a bench-scale acoustic wave separator (AWS) for the primary separation of culture fluid containing a monoclonal IgG1 antibody from a CHO cell bioreactor harvest. Representative data are presented from the AWS and demonstrate how to achieve effective cell clarification and product recovery. Finally, potential applications for AWS in continuous bioprocessing are discussed. Overall, this study provides a practical and general protocol for the implementation of AWS in primary clarification for CHO cell cultures and further describes its application potential in continuous bioprocessing.

Presented here is a protocol for the primary clarification of CHO cell culture using an acoustic separator. This protocol can be used for the primary clarification of shake flask cultures or bioreactor harvests and has the potential application for continuous clarification of the cell bleed material during perfusion bioreactor operations.

הבהרה ראשונית של נוזל תרבית תאים שנקטפו על ידי CHO באמצעות מפריד אקוסטי

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...

Formulation and Acoustic Modulation of Optically Vaporized Perfluorocarbon Nanodroplets

Microbubbles are the most commonly used imaging contrast agent in ultrasound. However, due to their size, they are limited to vascular compartments. These microbubbles can be condensed or formulated as perfluorocarbon nanodroplets (PFCnDs) that are small enough to extravasate and then be triggered acoustically at the target site. These nanoparticles can be further enhanced by including an optical absorber such as near infrared organic dye or nanoparticles (e.g., copper sulfide nanoparticles or gold nanoparticles/nanorods). Optically tagged PFCnDs can be vaporized through laser irradiation in a process known as optical droplet vaporization (ODV). This process of activation enables the use of high boiling point perfluorocarbon cores, which cannot be vaporized acoustically under the maximum mechanical index threshold for diagnostic imaging. Higher boiling point cores result in droplets that will recondense after vaporization, resulting in "blinking" PFCnDs that briefly produce contrast after vaporization before condensing back into nanodroplet form. This process can be repeated to produce contrast on demand, allowing for the background free imaging, multiplexing, super-resolution, and contrast enhancement through both optical and acoustic modulation. This article will demonstrate how to synthesize optically-triggerable, lipid shell PFCnDs utilizing probe sonication, create polyacrylamide phantoms to characterize the nanodroplets, and acoustically modulate the PFCnDs after ODV to improve contrast.

Optically activated perfluorocarbon nanodroplets show promise in imaging applications outside of the vascular system. This article will demonstrate how to synthesize these particles, crosslink polyacrylamide phantoms, and modulate the droplets acoustically to enhance their signal.

נוסחה ואפנון אקוסטי של ננו-טיפות פרפלואורוקרבון שעברו אידוי אופטי

Microbubbles are the most commonly used imaging contrast agent in ultrasound. However, due to their size, they are limited to vascular compartments. These ...

Rapid Antibody Glycoengineering in Chinese Hamster Ovary Cells

Recombinant monoclonal antibodies bind specific molecular targets and, subsequently, induce an immune response or inhibit the binding of other ligands. However, monoclonal antibody functionality and half-life may be reduced by the type and distribution of host-specific glycosylation. Attempts to produce superior antibodies have inspired the development of genetically modified producer cells that synthesize glyco-optimized antibodies. Glycoengineering typically requires the generation of a stable knockout or knockin cell line using methods such as clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9. Monoclonal antibodies produced by engineered cells are then characterized using mass spectrometric methods to determine if the desired glycoprofile has been obtained. This strategy is time-consuming, technically challenging, and requires specialists. Therefore, an alternative strategy that utilizes streamlined protocols for genetic glycoengineering and glycan detection may assist endeavors toward optimal antibodies. In this proof-of-concept study, an IgG-producing Chinese hamster ovary cell served as an ideal host to optimize glycoengineering. Short interfering RNA targeting the Fut8 gene was delivered to Chinese hamster ovary cells, and the resulting changes in FUT8 protein expression were quantified. The results indicate that knockdown by this method was efficient, leading to a ~60% reduction in FUT8. Complementary analysis of the antibody glycoprofile was performed using a rapid yet highly sensitive technique: capillary gel electrophoresis and laser-induced fluorescence detection. All knockdown experiments showed an increase in afucosylated glycans; however, the greatest shift achieved in this study was ~20%. This protocol simplifies glycoengineering efforts by harnessing in silico design tools, commercially synthesized gene targeting reagents, and rapid quantification assays that do not require extensive prior experience. As such, the time efficiencies offered by this protocol may assist investigations into new gene targets.

The glycosylation pattern of an antibody determines its clinical performance, thus industrial and academic efforts to control glycosylation persist. Since typical glycoengineering campaigns are time- and labor-intensive, the generation of a rapid protocol to characterize the impact of glycosylation genes using transient silencing would prove useful.

גליקו-הנדסה מהירה של נוגדנים בתאי שחלת אוגר סיניים

Recombinant monoclonal antibodies bind specific molecular targets and, subsequently, induce an immune response or inhibit the binding of other ligands. ...

In Vitro Cleavage Assays using Purified Recombinant Drosophila Caspases for Substrate Screening

Caspases are very specific cell death proteases that are involved in apoptotic and non-apoptotic processes. While the role of caspases during apoptosis has been very well defined and many apoptotic proteolytic substrates of caspases have been identified and characterized, the role of caspases for non-apoptotic processes is not well understood. In particular, few non-apoptotic substrates of caspases have been identified thus far. Here, in order to facilitate the identification and characterization of potential caspase substrates, a protocol that allows the testing of candidate substrates in caspase cleavage assays in vitro is described. This protocol includes the production and purification of recombinant caspase proteins, the production of the candidate substrates either recombinantly or in a cell-free expression system, and the actual in vitro cleavage reaction followed by SDS-PAGE and immunoblotting. This protocol is tailored for the Drosophila caspases Dronc and Drice but can easily be adapted for caspases from other organisms, including mammals.

In Vitro Cleavage Assays using Purified Recombinant Drosophila Caspases for Substrate Screening

Here we present a protocol to express and purify recombinant Drosophila caspases Dronc and Drice, and their use in in vitro cleavage assays.

במבחנה מבחני ביקוע באמצעות מפלי דרוזופילה רקומביננטיים מטוהרים לבדיקת מצעים

Caspases are very specific cell death proteases that are involved in apoptotic and non-apoptotic processes. While the role of caspases during apoptosis ...