يمكن استخدام هذا البروتوكول للحصول على نظرة ثاقبة أكبر على ديناميكيات وأدوار البروتينات الفوسفاتية النشطة أثناء التطور القحفي الوجهي للثدييات. يتغلب هذا البروتوكول على الحاجز الشائع لإزالة الفسفرة أثناء عزل البروتين من سياقين ذوي صلة فسيولوجيا ، وهما عمليات وجه الفأر وخلايا اللحمة الحنكية الجنينية المزروعة للفأر. من الضروري التحرك بسرعة مع الحفاظ على جميع الكواشف والمواد على الجليد واستخدام مثبطات الفوسفاتيز في جميع مخازن التحلل للحفاظ على سلامة البروتينات المفسفرة.
للبدء ، ضع جسم الفأر على لوحة تشريح مع توجيه الجانب البطني لأعلى ، ورش بطن الماوس بنسبة 70٪ من الإيثانول. ثم افتح تجويف البطن عن طريق قرص ورفع الجلد الأمامي إلى فتحة المهبل باستخدام ملقط Semken المستقيم. بعد ذلك ، قم بقطع الجلد المرفوع في الطبقات السفلية باستخدام مقص جراحي مستقيم الشفرة بزاوية 45 درجة على كلا الجانبين لإنشاء شكل V يمتد إلى كل سطح جانبي في منتصف الطريق تقريبا بين الأطراف الأربعة والأطراف الخلفية.
باستخدام ملقط Semken ، أمسك بأحد قرون الرحم وقطعه أسفل قناة البيض وفوق عنق الرحم باستخدام مقص جراحي. للسماح بالإزالة الكاملة لقرن الرحم ، قم بقطع الميزومتريوم ، ثم انقل قرن الرحم التشريحي إلى 10 ملليلتر من الأنسجة PBS في طبق بتري 10 سم. وبالمثل ، قم بإزالة قرن الرحم الثاني على الجانب الآخر من تجويف البطن.
بعد ذلك ، ضع طبق بتري الذي يبلغ طوله 10 سنتيمترات والذي يحتوي على قرني الرحم على الجليد. تحت مجهر ستيريو تشريح ، تشريح بعناية كل جنين من قرون الرحم مع ملقط Dumont 5 الدقيق. ثم اسحب ببطء عضل الرحم ، و decidua ، و chorion.
بعد ذلك ، قم بتمزيق وإزالة السلى الشفاف نسبيا المحيط بالجنين وقطع الحبل السري الذي يربط الجنين بالمشيمة. ثم انقل كل جنين تم تشريحه إلى 2.5 ملليلتر من الأنسجة PBS في بئر فردي من صفيحة زراعة خلايا مكونة من 12 بئرا على الجليد باستخدام ماصة نقل بلاستيكية مقطوعة. تحضير ثلاثة أطباق بتري بطول 10 سنتيمترات تحتوي على 10 ملليلتر من الأنسجة PBS والاحتفاظ بها على الجليد لاستخدامها بالتناوب بين الأجنة.
ثم انقل جنينا واحدا من بئر فردي من صفيحة زراعة الخلايا المكونة من 12 بئرا إلى أحد أطباق بتري التي يبلغ طولها 10 سنتيمترات مع علم الأنسجة PBS على الجليد باستخدام ماصة نقل بلاستيكية مقطوعة. تحت المجهر التشريحي ، افصل كل عملية فكية عن الوجه باستخدام الملقط الدقيق عن طريق إجراء قطع أولا في الجانب الأمامي من عملية الفك العلوي على طول المسافة البادئة الطبيعية التي تفصل عملية الأنف الجانبية في عملية الفك العلوي. بعد ذلك ، قم بقطع الجانب الخلفي من عملية الفك العلوي على طول المسافة البادئة الطبيعية التي تفصل بين العملية الفكية وعملية الفك السفلي.
ثم افصل تماما عملية الفك العلوي عن طريق إجراء قطع رأسي من الجانبين الأمامي إلى الخلفي للعملية الفكية على جانب العين من العملية الفكية حيث تنتهي المسافات البادئة الطبيعية المشار إليها أعلاه. باستخدام ماصة باستور مقاس 9 بوصات مع لمبة لاتكس صغيرة بمليلترين ، انقل الزوج التشريحي من العمليات الفكية في قطرة صغيرة من حوالي 30 ميكرولتر من الأنسجة PBS إلى طبق بتري 35 ملم على الجليد. ثم انقل زوج أنسجة عملية الفك العلوي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 ملليلتر على الجليد باستخدام ماصة باستور ، مما يقلل من نقل الأنسجة PBS.
علاوة على ذلك ، قم بإزالة أي أنسجة زائدة PBS في أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 ملليلتر باستخدام ماصة باستور. أضف 0.1 ملليلتر من المخزن المؤقت لتحلل NP40 البارد مع مثبطات البروتياز والفوسفاتيز المضافة مباشرة قبل الاستخدام على الثلج. ثم ماصة صعودا وهبوطا 10 مرات مع 200 ميكرولتر PIPETMAN.
بعد ذلك ، دوامة لمدة 10 ثوان ، ثم ماصة لأعلى ولأسفل 10 مرات مع PIPETMAN 200 ميكرولتر ، مع تجنب توليد الفقاعات. احتضن عند أربع درجات مئوية لمدة ساعتين أثناء الدوران من طرف إلى طرف باستخدام مجداف 1.5 ملليلتر أو ملليلتر مع مسدس أنبوبي. ثم الطرد المركزي للعينات في 13،500 × غرام لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية وجمع supernatant إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر جهاز طرد مركزي صغير على الجليد مع 200 ملليلتر PIPETMAN.
أولا ، استنشاق الوسط من خلايا اللحمة الحنكية الجنينية للفأر باستخدام ماصة باستور مقاس 5.75 بوصة متصلة بنظام فراغ. ثم اغسل الخلايا مرتين باستخدام زراعة الأنسجة الباردة المثلجة PBS وقم بإمالة اللوحة إلى الجانب أثناء الغسيل الأخير لضمان شفط جميع زراعة الأنسجة PBS. بعد ذلك ، أضف المخزن المؤقت لتحلل NP40 البارد مع مثبطات البروتياز والفوسفاتيز المضافة مباشرة قبل الاستخدام على الثلج لتحليل الخلايا.
احتضن الصفيحة على الجليد لمدة خمس دقائق مع الدوران كل دقيقة تقريبا لضمان التغطية الكاملة للصفيحة. ثم قم بكشط الخلايا من اللوحة باستخدام رافع خلية مبرد مسبقا ، ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 ملليلتر مبرد مسبقا على الجليد. بعد ذلك ، احتضن تعليق الخلية عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة أثناء الدوران من طرف إلى طرف باستخدام مجداف 1.5 ملليلتر أو ملليلتر مع مسدس أنبوبي.
ثم الطرد المركزي للعينات في 13،500 × غرام لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية وجمع supernatant إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر جهاز طرد مركزي صغير على الجليد مع 200 ملليلتر PIPETMAN. كشف تحليل اللطخة الغربية للخلايا الكاملة من خلايا اللحمة الحنكية الجنينية المخلدة للفأر بعد التحفيز باستخدام رباط PDFG-B من 2 إلى 15 دقيقة عن نطاقات متميزة قابلة للتكرار للبروتينات الفوسفاتية التي تعمل عند أو بالقرب من ارتفاع نطاق البروتين الكلي المقابل. لوحظت زيادة في كثافة نطاق البروتين الفوسفوبروتيني عند العلاج بعامل نمو مقارنة بالخلايا غير المعالجة ، في حين كانت كثافة نطاق البروتين الكلية متساوية نسبيا بين العينات.
يمكن استخدام هذا البروتوكول للتحقيق في كيفية تأثير الاضطرابات والفسفرة بشكل مباشر على الإشارات بين الخلايا والتعبير الجيني والنشاط الخلوي في السياقات القحفية الوجهية.
