نشكر الدكاترة. ر وجود Samulski شياو شياو للهدايا من نوعها AAV3 المؤتلف والبلازميدات AAV - EGFP ، على التوالي ، والدكتور توملينسون غيل بسخاء لتوفير خلايا Hep293TT. وأيد هذا البحث في جزء من دائرة الصحة العامة R01 المنح منحة HL - 076901 ، 097088 HL - R01 ، وP01 DK - 058327 (المشروع 1) من المعاهد الوطنية للصحة (ك).

1. التعبئة والتغليف من المؤتلف المصلي غدة الفيروسات المرتبطة 3 (rAAV3) المتجهات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتقل إلى الموقع : &quot; <a href="http://www.geguchadze.com/calc">http://www.geguchadze.com/calc</a> &quot;وحساب كمية من الحمض النووي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل مزيج البلازميدات pHelper (مساعد اتش) ، pACG2c3 (AAV المساعد) وpdsAAV - CB - EGFP (rAAV ناقلات) في المتوسط ​​دون FBS والمضادات الحيوية. وينبغي أن يكون مجموع حجم ميكرولتر 8750 لمدة عشر لوحات 15 سم 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة إضافة ميكرولتر من 1250 PEI (0.1 ٪ M / V ، Polysciences ، القط # 23966 ، ودرجة الحموضة 4.5) في الحمض النووي في حل الخطوة 1.2. دوامة الحل PEI الحمض النووي لبضع ثوان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان DNA - PEI حل لتشكيل مجمع لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من الحمض النووي PEI حل بنسبة 15 صفيحة 2 سم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المتوسطة بعد 4 ساعات ، مع استبدال الطازجة المتوسطة 25 مل كاملة +10 ٪ FBS (C - DMEM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اثنتين وسبعين ساعة بعد ترنسفكأيشن ، وخلايا كشط وتصب في انبوب مخروطي سعة 250 مل الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور في 3000 دورة في الدقيقة ، عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. تخلصي طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعادة تعليق الخلية بيليه في 5 مل من الميزانية العادية TMS العازلة (50 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، كلوريد الصوديوم 150 ملم ، ودرجة الحموضة 8.0). نقل إلى أنبوب جديد 15 مل المخروطية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميد حمام الجليد الجاف الايثانول لمدة 10 دقيقة ، وذوبان الجليد عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. كرر ثلاث مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 ميكرولتر من MgCl 4.8 M 2 و 2 ميكرولتر من Benzonase (25 U / ميكرولتر ، Novagen ، القط # 70664-3). دوامة واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار في 4000 دورة في الدقيقة ، في 4 لمدة 40 دقيقة درجة مئوية وجمع طاف (توضيح lysate). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في أنبوب 13 مل الطرد المركزي السريعة الختم (بيكمان ، القط # 342413) ، تحميل iodixanol التدرج (OptiPrep ، القط # 1114542) من أعلى إلى أسفل : 2 مل من 15 ٪ ، و 2 مل من 25 ٪ ، و 1.5 مل من 40 ٪ و 1.5 مل من iodixanol 60 ٪. تحميل طاف (الخطوة 1.12) على رأس التدرج iodixanol. ملء الأنابيب العازلة مع TMS RB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 75000 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة عند 16 درجة مئوية باستخدام بيكمان 90Ti الدوار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الكسر iodixanol 40 ٪ عن طريق إدخال حقنة في حدود 40-60 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل جزء iodixanol 40 ٪ في أنبوب واحد 50 مل المخروطية وجعل ما يصل الى 40 مل مع الاحتياطي A (20 ملي تريس ، 15 مم كلوريد الصوديوم ، ودرجة الحموضة 8.5) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع جهاز التنقية باستخدام HiTrap س HP العمود (جنرال الكتريك للرعاية الصحية ، القط 17-1154-01 #). غسل العمود مع العازلة التالية : 25 مل من الاحتياطي A (20 ملي تريس ، 15 مم كلوريد الصوديوم ، ودرجة الحموضة 8.5) ؛ و 25 مل من الاحتياطي ب (10 ملي تريس ، 500 ملي مول كلوريد الصوديوم ، ودرجة الحموضة 8.5) و 50 مل من الاحتياطي A 40 مل من عينة الفيروس في الاحتياطي A و 50 مل من الاحتياطي A (20 ملي تريس ، 15 مم كلوريد الصوديوم ، ودرجة الحموضة 8.5) ؛ و 20 مل من الاحتياطي C (20 ملي تريس ، 175 مم كلوريد الصوديوم ، ودرجة الحموضة 8.5) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع C العازلة في المكثفات أبولو 20 مل (المداري العلوم البيولوجية). الطرد المركزي في 3000 دورة في الدقيقة ، عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل والتدفق من خلال إضافة 20 مل من برنامج تلفزيوني والمبردة الطرد المركزي في 3000 دورة في الدقيقة ، في 4 لمدة 10 دقيقة درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل والتدفق من خلال إضافة 500 ميكروليتر من PBS مبردة. غسل ناقلات الخروج من الغشاء ونقلها إلى أنابيب إيبندورف سيليكون المعاملة والمجمدة في مخزن صغير في aliquots -80 درجة مئوية. </li></ol> 2. تصميم التتر ناقل rAAV3 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أذاب 10 ميكرولتر من تنقية الفيروس في أنبوب إيبندورف على الجليد. إضافة 40 ميكرولتر من DDH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.2 ميكرولتر من Benzonase (25 U / ميكرولتر ، Novagen ، القط # 70664) ، ويحضن في 37 ساعة : 1 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 ميكرولتر من اتخاذ معيار البلازميد (0.2 نانوغرام / ميكرولتر) في أنبوب آخر إيبندورف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم 100 ملم في كل أنبوب واحتضان في 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البرد على الجليد على الفور الحصول على ما لا يقل عن 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع غشاء نقل (ميليبور ، القط # INYC00010) وفقا لمرشح ورقة بيو دوت (بيو راد ، القط # 1620161). شطف الغشاء في SSC 10X مع ثلاثة أوراق الترشيح لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين فتحة لطخة SF جهاز (بيو دوت ، القط # 170-6542). الاتصال قارورة فراغ وإضافة 100 ميكرولتر من SSC 10X لطخة جهاز الفتحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من 20X SSC و 1 ميكرولتر صبغة تحميل 6X إلى كل من العينات في الخطوة 2.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل 100 ميكرولتر من كل العينات على الغشاء في الفتحة جهاز صمة عار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة آخر ميكرولتر 100 من SSC 10X في كل من العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات 2.9 و 2.10 حتى كل عينة يمر عبر الغشاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفكيك الجهاز وإزالة لطخة فتحة الغشاء. وضعه في رابط المفتش SL - 1000 Crosslinker الأشعة فوق البنفسجية. بدوره على &quot;الطاقة&quot; ، &quot;تشعبي الأمثل&quot; (عرض 1200) ، ودفع &quot;ابدأ&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغلي 1 مل من السائل المنوي السلمون (SS) DNA (فيشر ، القط # NC9753983) لمدة 5 دقائق. البرد على الجليد لمدة لا تقل عن 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل قبل التهجين عن طريق خلط 27.5 مل من DDH 2 O ، 15 مل من 20X SSC ، 5 مل من محلول 50x دينهارت و1.25 مل من SDS 20 ٪ ، 0.25 مل من PolyA و 1 مل من الحمض النووي من الخطوة SS 2.13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق الغشاء في 25 مل من محلول قبل التهجين في اسطوانة زجاجية وتوج احتضان عند 65 درجة مئوية في غرفة التهجين بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع 50 نانوغرام قوالب الحمض النووي في 10 ميكرولتر من DDH 2 O. يغلي عند 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق على الجليد والبرد على الفور الحصول على ما لا يقل عن 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 3000 دورة في الدقيقة في لRT 1 دقيقة. إضافة 2 ميكرولتر من dNTPs مم 3 10 (تفتقر dCTP) ، و 2 ميكرولتر من Hexanucleotide ميكس (روش ، القط # 11277081001) ، 1 ميكرولتر من Klenow (روش ، القط # 11008404001) و 5 ميكرولتر من α -32 ف dCTP. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي G - 50 أعمدة (GE للرعاية الصحية ، القط # 27-5330-01) في 3000 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة. تحميل التحقيق في الخطوة 2.17 في العمود. الطرد المركزي في 3000 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة وجمع من خلال تدفق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العد الإشعاعي. تغلي التحقيق في 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق على الجليد والبرد على الفور الحصول على ما لا يقل عن 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة لجنة التحقيق (6x10 5 نسخة في الدقيقة / مل) في حل ما قبل التهجين مع الغشاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يحضن بين عشية وضحاها على 65 درجة مئوية في غرفة التهجين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل حل التهجين وشطف الغشاء في 2X SSC SDS +0.1 ٪ على RT لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل الحل وشطف الغشاء في 0.1x SSC SDS +0.1 ٪ عند 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل الحل وشطف الغشاء في محكمة أمن الدولة في فترة وجيزة RT 0.1x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعرض الفيلم في -80 درجة مئوية لمدة 6 ساعات وتطوير الفيلم. ويبين نتيجة نموذجية في الشكل 1. </li></ol> 3. rAAV3 بوساطة ناقلات تنبيغ التعبير والتحوير في خلايا سرطان الكبد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور 1x10 4 خلايا (إما أو Huh7 Hep293TT) في كل جانب من لوحة 96 - جيدا. احتضان في حاضنة ترطيب CO 2 على الأقل 18 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لوحة المتوسطة من 96 - جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مرتين مع 50 ميكرولتر من وسيط وبدون FBS والمضادات الحيوية وإزالتها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر من وسيط وبدون FBS والمضادات الحيوية وناقلات rAAV في 5000 VGS / الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحات في الحاضنة CO 2 لمدة 4 ساعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل المتوسط. غسل الخلايا مرتين مع 50 ميكرولتر المتوسطة وإزالة كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 150 ميكرولتر من طراز C - DMEM إلى كل بئر واحتضان لوحة CO 2 في الحاضنة لمدة 72 ساعة ، ووضع تصور للتعبير EGFP باستخدام مجهر مضان (DMI 4000B ؛ ايكا مايكروسيستمز). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم تحليل الصور من ثلاثة آبار من الخلايا المصابة بالفيروسات كميا بواسطة ImageJ تحليل البرمجيات (المعاهد الوطنية للصحة في بيثيسدا ، MD ، الولايات المتحدة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم تقييم التعبير والتحوير المساحة الإجمالية للمضان أخضر (بكسل 2) في المجال البصري. ويبين نتيجة نموذجية في الشكل 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن أيضا التعبير التحوير يحددها التدفق الخلوي. </li></ol> 4. ممثل النتائج : بعد بروتوكول المبينة أعلاه ، يمكن للمرء أن تولد نواقل المصلي AAV بكفاءة. العائد نموذجية تحتوي على 500 ~ ~ 10 11 ميكرولتر VGS / ميكرولتر من الأسهم النقية النواقل. ويتحدد على نقاء المخزون ناقلات بمقارنة الإشارات التهجين على كمية البقع فتحة الحمض النووي ، مع وبدون هضم Benzonase. تنقية rAAV3 ناقلات تنبيغ سرطان الكبد البشري -- ورم أرومي كبدي (HB) وسرطان الخلايا الكبدية (HCC) -- خطوط الخلايا بكفاءة. <img src="/files/ftp_upload/2538/2538fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. كمية الحمض النووي من خلال فتحة لطخة تحليل لتحديد التتر من rAAV3 النواقل. وقد تم تحليل شقين التخفيفات لتنقية مخزونات الفيروسي ، ويتفاعل مع Benzonase (الصف العلوي) على كمية الحمض النووي البقع مع 32 فتحة ف المسبار المسمى DNA EGFP محددة. تم تحديد من عيار AAV3 ناقلات مقارنة مع 1 نانوغرام (الصف الأوسط) أو 10 نانوغرام (الصف السفلي) من AAV - EGFP معايير البلازميد تحميلها على الغشاء. الأرقام تتطابق مع نسخ الحمض النووي. <img src="/files/ftp_upload/2538/2538fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. AAV المؤتلف بوساطة ناقلات التعبير التحوير في خلايا سرطان الكبد. وكانت الخلايا Hep293TT ، والتي أنشئت مؤخرا خلية ورم أرومي كبدي الإنسان السطر 4 ، إما (اللوحة اليسرى) وهمية المصابة ، أو مع transduced VGS 5000 / خلية إما EGFP - scAAV2 أو ناقلات scAAV3 - EGFP في 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. تم التحوير التعبير تصور 72 ساعة بعد تنبيغ باستخدام مجهر مضان.

<ol>
	<li>Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+AAV+serotypes+1-9+mediated+gene+expression+and+tropism+in+mice+after+systemic+injection.">Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection.</a> Mol Ther. 16, 1073-1080 (2008).</li><li>Glushakova, L. G., Lisankie, M. J., Eruslanov, E. B., Ojano-Dirain, C., Zolotukhin, I., Liu, C., Srivastava, A., Stacpoole, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV3-mediated+transfer+and+expression+of+the+pyruvate+dehydrogenase+E1+alpha+subunit+gene+causes+metabolic+remodeling+and+apoptosis+of+human+liver+cancer+cells.">AAV3-mediated transfer and expression of the pyruvate dehydrogenase E1 alpha subunit gene causes metabolic remodeling and apoptosis of human liver cancer cells.</a> Mol Genet &#38; Metabol. 98, 289-299 (2009).</li><li>Ling, C., Lu, Y., Kalsi, J. K., Jayandharan, G. R., Li, B., Ma, W., Cheng, B., Gee, S. W., McGoogan, K. E., Govindasamy, L., Zhong, L., Agbandje-McKenna, M., Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatocyte+growth+factor+receptor+is+a+cellular+coreceptor+for+adeno-associated+virus+serotype+3.">Human hepatocyte growth factor receptor is a cellular coreceptor for adeno-associated virus serotype 3.</a> Hum Gene Ther. 21, 1741-1747 (2010).</li><li>Chen, T. T., Rakheja, D., Hung, J. Y., Hornsby, P. J., Tabaczewski, P., Malogolowkin, M., Feusner, J., Miskevich, F., Schultz, R., Tomlinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+cancer+cell+line+derived+from+an+aggressive+childhood+liver+tumor.">Establishment and characterization of a cancer cell line derived from an aggressive childhood liver tumor.</a> Pediatr Blood &#38; Cancer. 53, 1040-1047 (2009).</li><li>Daya, S., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+using+adeno-associated+virus+vectors.">Gene therapy using adeno-associated virus vectors.</a> Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).</li><li>Zhong, L., Li, B., Mah, C. S., Govindasamy, L., Agbandje-McKenna, M., Cooper, M., Herzog, R. W., Zolotukhin, I., Warrington, K. H., Weigel-Van Aken, K. A., Hobbs, J. A., Zolotukhin, S., Muzyczka, N., Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+of+adeno-associated+virus+2+vectors:+point+mutations+in+tyrosines+lead+to+high-efficiency+transduction+at+lower+doses.">Next generation of adeno-associated virus 2 vectors: point mutations in tyrosines lead to high-efficiency transduction at lower doses.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105, 7827-7832 (2008).</li><li>Petrs-Silva, H., Dinculescu, A., Li, Q., Min, S. H., Chiodo, V., Pang, J. J., Zhong, L., Zolotukhin, S., Srivastava, A., Lewin, A. S., Hauswirth, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transduction+of+the+mouse+retina+by+tyrosine-mutant+AAV+serotype+vectors.">High-efficiency transduction of the mouse retina by tyrosine-mutant AAV serotype vectors.</a> Mol Ther. 17, 463-471 (2009).</li><li>Jayandharan, G. R., Zhong, L., Sack, B. K., Rivers, A. E., Li, M., Li, B., Herzog, R. W., Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+adeno-associated+virus+(AAV)-protein+phosphatase-5+helper+viruses+for+efficient+liver+transduction+by+single-stranded+AAV+vectors:+therapeutic+expression+of+factor+IX+at+reduced+vector+doses.">Optimized adeno-associated virus (AAV)-protein phosphatase-5 helper viruses for efficient liver transduction by single-stranded AAV vectors: therapeutic expression of factor IX at reduced vector doses.</a> Hum. Gene Ther. 21, 271-283 (2010).</li><li>Li, M., Jayandharan, G. R., Li, B., Ling, C., Ma, W., Srivastava, A., Zhong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transduction+of+fibroblasts+and+mesenchymal+stem+cells+by+tyrosine-mutant+AAV2+vectors+for+their+potential+use+in+cellular+therapy.">High-efficiency transduction of fibroblasts and mesenchymal stem cells by tyrosine-mutant AAV2 vectors for their potential use in cellular therapy.</a> Hum Gene Ther. 21, 1527-1543 (2010).</li><li>Kauss, M. A., Smith, L. J., Zhong, L., Srivastava, A., Wong, K. K. J. r., Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+long-term+transduction+and+multilineage+engraftment+of+human+hematopoietic+stem+cells+transduced+with+tyrosine-modified+recombinant+adeno-associated+virus+serotype+2.">Enhanced long-term transduction and multilineage engraftment of human hematopoietic stem cells transduced with tyrosine-modified recombinant adeno-associated virus serotype 2.</a> Hum Gene Ther. 21, 1129-1136 (2010).</li><li>Qiao, C., Zhang, W., Yuan, Z., Shin, J. H., Li, J., Jayandharan, G. R., Zhong, L., Srivastava, A., Xiao, X., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+serotype+6+capsid+tyrosine-to-phenylalanine+mutations+improve+gene+transfer+to+skeletal+muscle.">Adeno-associated virus serotype 6 capsid tyrosine-to-phenylalanine mutations improve gene transfer to skeletal muscle.</a> Hum Gene Ther. 21, 1343-1348 (2010).</li><li>Markusic, D. M., Herzog, R. W., Aslanidi, G. V., Hoffman, B. E., Li, B., Li, M., Jayandharan, G. R., Ling, C., Zolotukhin, I., Ma, W., Zolotukhin, S., Srivastava, A., Zhong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transduction+and+correction+of+murine+hemophilia+B+using+AAV2+vectors+devoid+of+multiple+surface-exposed+tyrosines.">High-efficiency transduction and correction of murine hemophilia B using AAV2 vectors devoid of multiple surface-exposed tyrosines.</a> Mol Ther. 18, 2048-2056 (2010).</li><li>Ojano-Dirain, C., Glushakova, L. G., Zhong, L., Zolotukhin, S., Muzyczka, N., Srivastava, A., Stacpoole, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+animal+model+of+PDH+deficiency+using+AAV8-siRNA+vector-mediated+knockdown+of+pyruvate+dehydrogenase+E1&#945;.">An animal model of PDH deficiency using AAV8-siRNA vector-mediated knockdown of pyruvate dehydrogenase E1&#945;.</a> Mol Genet &#38; Metabol. 101, 183-191 (2010).</li><li>Petrs-Silva, H., Dinculescu, A., Li, Q., Deng, W. T., Pang, J. J., Min, S. H., Chiodo, V., Neeley, A. W., Govindasamy, L., Bennett, A., Agbandje-McKenna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+properties+of+tyrosine-mutant+AAV2+vectors+in+the+mouse+retina.">Novel properties of tyrosine-mutant AAV2 vectors in the mouse retina.</a> Mol Ther. , (2011).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وقد وضعت ناقلات المؤتلف على أساس البارفو غير ممرضة الإنسان ، والفيروس الغدة المرتبطة بها (AAV) ، والمستخدمة حاليا في عدد من التجارب السريرية العلاج الجيني 5. سابقا ، من الأنماط المصلية 10 AAV الأكثر شيوعا ، وقد تم الإبلاغ عن كفاءة تنبيغ من AAV3 ناقلات بصفة عامة لتكون منخفضة بشكل خاص ، سواء في المختبر والمجراة 1. ومع ذلك ، لدينا الملاحظة الأخيرة التي AAV3 ناقلات تنبيغ سرطان الكبد خطوط الخلايا البشرية بشكل جيد للغاية ، كما يحدد الكمية التي التدفق الخلوي 2 ، والتي تستخدم AAV3 النمو الكبدية البشرية مستقبلات عامل (hHGFR) كما شارك في مستقبلات الخلوية للدخول في هذه الملزمة و 3 خلايا ، توحي بقوة انتقائي الأنسجة tropism من AAV3 لخلايا الكبد البشرية بصفة عامة ، وخلايا سرطان الكبد بشكل خاص. ومع ذلك ، منذ AAV3 ناقلات تنبيغ أيضا خلايا الكبد البشرية العادية 2 بكفاءة ، واحتمال استخدامها في علاج الجينات السرطانية في الجسم الحي تطبيق ستتأثر سلبا. استراتيجية واحدة ممكنة للتحايل على هذه المشكلة المحتملة تشمل الترانسكربتي استهداف الخلايا السرطانية من خلال تحديد الجين المنتج الذي يتم انتاجه بشكل انتقائي من الورم ، ولكن ليس عن طريق خلايا الكبد الطبيعية. على سبيل المثال ، أظهرت الدراسات السابقة التي تستخدم مستويات مصل α - بروتين جنيني (اف ب) كعلامة محددة لتتبع وجود ، التقدم ، و / أو تكرار بعض أنواع سرطانات الكبد ، وخلايا الكبد الطبيعية منذ تنتج عادة كميات صغيرة جدا من هذا البروتين. في الواقع ، لقد استخدمنا AAV3 ناقلات تحتوي على مروج لوكالة فرانس برس في استهداف التعبير التحوير في خلايا سرطان الكبد ، ولكن ليس في خلايا الكبد الطبيعية 2 ، وتجري حاليا دراسات لاختبار فعالية هذا النهج في نموذج الفئران طعم أجنبي من سرطان الكبد. في دراساتنا إضافية ، لاحظنا أنه يمكن كفاءة تنبيغ مختلف ناقلات AAV المصلي زيادة ملموسة بنسبة الطفرات الموقع موجهة للمياه السطحية المعرضة للمخلفات في التيروزين الفيروسية capsids 14/06. حيث يتم حفظها أيضا 6 من 7 السطحية المعرضة للtyrosines في AAV3 ، وقد أجرينا موقع الطفرات الموجهة من هذه المخلفات وأشار إلى أن يتم تحسين كبير في كفاءة تنبيغ ناقلات AAV3 التيروزين ، متحولة في خلايا سرطان الكبد (بيانات غير منشورة). كما أن الدراسات التي تجري حاليا لتقييم سلامة وفعالية النواقل AAV3 التيروزين ، متحولة في نماذج طعم أجنبي الماوس لورم أرومي كبدي الإنسان وسرطان الكبد ، وإذا نجحت ، فإن الأمثل المصلي AAV3 التيروزين ، متحولة نواقل قد تكون مفيدة لاستهداف الكبد الإنسان السرطان العلاج الجيني لالمحتملين.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>10-0170CM</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polysciences</td>
<td>23966</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Benzonase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Novagen</td>
<td>70664-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HiTrap Q HP column</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1154-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Salmon sperm DNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>NC9753983</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Iodixanol gradient</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>OptiPrep</td>
<td>1114542</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>G-50 Columns</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>27-5330-01</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

high-efficiency transduction of liver cancer cells by recombinant adeno-associated virus serotype 3 vectors

نواقل المؤتلف على أساس البارفو غير الممرضة للإنسان ، وقد تم تطوير هذا الفيروس الغدة المرتبطة 2 (AAV2) ، والمستخدمة حاليا في عدد من التجارب السريرية العلاج الجيني. في الآونة الأخيرة ، وعدد من المصليين AAV إضافية كما تم المعزولة ، والتي ثبت لعرض انتقائي الأنسجة tropism في مختلف النماذج الحيوانية الكبيرة والصغيرة 1. من الأنماط المصلية 10 AAV الأكثر شيوعا ، AAV3 هي حتى الآن في الأقل كفاءة transducing الخلايا والأنسجة في المختبر وكذلك في الجسم الحي. ومع ذلك ، في دراساتنا المنشورة مؤخرا ، وقد وثقت لنا أن AAV3 ناقلات تنبيغ الإنسان بسرطان الكبد -- ورم أرومي كبدي (HB) وسرطان الخلايا الكبدية (HCC) -- خطوط الخلايا بكفاءة للغاية بسبب AAV3 يستخدم الإنسان مستقبلات عامل النمو الكبدية الخلوية كما شارك في لمستقبلات ملزمة والدخول في هذه الخلايا 2،3. في هذه المقالة ، نحن تصف الخطوات اللازمة لتحقيق الكفاءة العالية تنبيغ من خلايا سرطان الكبد عن طريق ناقلات المؤتلف AAV3 يحمل الجين المراسل. قد تستخدم ناقلات AAV3 المؤتلف يحمل الجين العلاجي تؤدي في نهاية المطاف إلى العلاج الجيني المحتملة لسرطان الكبد لدى البشر.

Watch this Scientific Journal Video about High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors at JoVE.com

High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors

في هذه المقالة ، ونحن تصف تحديد النمط المصلي الفيروس الغدة المرتبطة 3 (AAV3) مثل ناقلات الأكثر كفاءة لاستهداف خلايا سرطان الكبد.

عالية الكفاءة تنبيغ الخلايا السرطانية الكبد المصلي المؤتلف الفيروسات الغدة المرتبطين 3 ناقلات

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a ...

high-efficiency-transduction-liver-cancer-cells-recombinant-adeno

Research

JoVE Journal

Medicine

13.1K Views.  University of Florida. في هذه المقالة ، ونحن تصف تحديد النمط المصلي الفيروس الغدة المرتبطة 3 (AAV3) مثل ناقلات الأكثر كفاءة لاستهداف خلايا سرطان الكبد.

Video: High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy tissue is the root cause of disease and death. For other cancers (e.g. breast, lung, etc.), it is the process of metastasis, in which tumor cells move from a primary tumor mass, colonize distal sites and ultimately contribute to organ failure, that eventually leads to morbidity and mortality 3. It has been estimated that invasion and metastasis are responsible for 90&#37; of cancer deaths 4. As a result, there has been intense interest in identifying the molecular processes and critical protein mediators of invasion and metastasis for the purposes of improving diagnosis and treatment 5.
A challenge for cancer scientists is to develop invasion assays that sufficiently resemble the in vivo situation to enable accurate disease modeling 6. Two-dimensional cell motility assays are only informative about one aspect of invasion and do not take into account extracellular matrix (ECM) protein remodeling which is also a critical element. Recently, research has refined our understanding of tumor cell invasion and revealed that individual cells may move by elongated or rounded modes 7. In addition, there has been greater appreciation of the contribution of collective invasion, in which cells invade in strands, sheets and clusters, particularly in highly differentiated tumors that maintain epithelial characteristics, to the spread of cancer 8.
We present a refined method 9 for examining the contributions of candidate proteins to collective invasion 10. In particular, by engineering separate pools of cells to express different fluorescent proteins, it is possible to molecularly dissect the activities and proteins required in leading cells versus those required in following cells. The use of RNAi provides the molecular tool to experimentally disassemble the processes involved in individual cell invasion as well as in different positions of collective invasion. In this procedure, mixtures of fluorescently-labeled cells are plated on the bottom of a Transwell insert previously filled with Matrigel ECM protein, then allowed to invade "upwards" through the filter and into the Matrigel. Reconstruction of z-series image stacks, obtained by confocal imaging, into three-dimensional representations allows for visualization of collectively invading strands and analysis of the representation of fluorescently-labeled cells in leading versus following positions.

Models of tumor cell invasion into three-dimensional extracellular matrix better reflect the in vivo situation than two-dimensional motility assays. Using matrix invasion assays combined with confocal imaging of fluorescently-labeled cells, detailed information on invasion modes and the distinct contributions of leading versus following cells can be obtained.

النمذجة والتصوير 3 الأبعاد غزو الخلية الجماعية

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy ...

A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi) holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable cancer cell vulnerabilities. Limiting the potential of this technology is the inability to rapidly delineate the mechanistic basis of phenotypic outcomes and thus inform the development of molecularly targeted therapeutic strategies. We outline here methods to deconstruct cellular phenotypes induced by RNAi-mediated gene targeting using multiplexed reporter systems that allow monitoring of key cancer cell-associated processes. This high-content screening methodology is versatile and can be readily adapted for the screening of other types of large molecular libraries.

Achieving a systems level understanding of cellular processes is a goal of modern-day cell biology. We describe here strategies for multiplexing luciferase reporters of various cellular function end-points to interrogate gene function using genome-scale RNAi libraries.

A تعدد في منصة الفرز القائم على luciferase المراسل لاستجواب المرتبطة بالسرطان نقل الإشارة في الخلايا المستزرعة

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the extracellular matrix (ECM). Characterizing the biology of this phenotypically distinct group of cells could substantially improve our understanding of early events during the metastatic cascade.

Tumor invasion is a dynamic process facilitated by bidirectional interactions between malignant epithelium and the cancer associated stroma. In order to examine cell-specific responses at the tumor stroma-interface we have combined organotypic co-culture and laser micro-dissection techniques.
Organotypic models, in which key stromal constituents such as fibroblasts are 3-dimentioanally co-cultured with cancer epithelial cells, are highly manipulatable experimental tools which enable invasion and cancer-stroma interactions to be studied in near-physiological conditions.

Laser microdissection (LMD) is a technique which entails the surgical dissection and extraction of the various strata within tumor tissue, with micron level precision.
By combining these techniques with genomic, transcriptomic and epigenetic profiling we aim to develop a deeper understanding of the molecular characteristics of invading tumor cells and surrounding stromal tissue, and in doing so potentially reveal novel biomarkers and opportunities for drug development in CRC.&#160;&#160;&#160;

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular profiling of laser microdissected cells and stroma from synthetic, tissue-engineered colorectal cancer models represents a novel and manipulatable approach to characterize and dissect the distinctive biology at the interface between tumor cells at the invasive front and cancer associated stromal cells. &#160;

التنميط الجزيئي للالمكروية ورم الغازية في نموذج 3 الأبعاد للخلايا سرطان القولون والمستقيم و<em&gt; خارج الحي</em&gt; الخلايا الليفية

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes (ILM), and in conjunction with astrocytes, pericytes and endothelial cells they establish the blood-retinal barrier (BRB). BRB limits material transport between the bloodstream and the retina while the ILM acts as a basement membrane that defines histologically the border between the retina and the vitreous cavity. Labeling M&#252;ller cells is particularly relevant to study the physical state of the retinal barriers, as these cells are an integral part of the BRB and ILM. Both BRB and ILM are frequently altered in retinal disease and are responsible for disease symptoms.
There are several well-established methods to study the integrity of the BRB, such as the Evans blue assay or fluorescein angiography. However these methods do not provide information on the extent of BRB permeability to larger molecules, in nanometer range. Furthermore, they do not provide information on the state of other retinal barriers such as the ILM. To study BRB permeability alongside retinal ILM, we used an AAV based method that provides information on permeability of BRB to larger molecules while indicating the state of the ILM and extracellular matrix proteins in disease states. Two AAV variants are useful for such study: AAV5 and ShH10. AAV5&#160;has a natural tropism for photoreceptors but it cannot get across to the outer retina when administered into the vitreous when the ILM is intact (i.e., in wild-type retinas). ShH10 has a strong tropism towards glial cells and will selectively label M&#252;ller glia in both healthy and diseased retinas. ShH10 provides more efficient gene delivery in retinas where ILM is compromised. These viral tools coupled with immunohistochemistry and blood-DNA analysis shed light onto the state of retinal barriers in disease.

To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.

باستخدام فيروس الغدة اسوشيتد كأداة لدراسة الحواجز الشبكية في مرض

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

دراسة سرطان البنكرياس الجذعية خصائص الخلايا لتطوير استراتيجيات علاجية جديدة

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson's Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on animal models. The identification of PD-associated genes has led to the development of genetic PD models. Most transgenic &#945;-SYN mouse models develop gradual &#945;-SYN pathology but fail to display clear dopaminergic cell loss and dopamine-dependent behavioral deficits. This hurdle was overcome by direct targeting of the substantia nigra with viral vectors overexpressing PD-associated genes. Local gene delivery using viral vectors provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. Specific brain regions can be targeted (e.g. the substantia nigra), expression can be induced in the adult setting and high expression levels can be achieved. Further, different vector systems based on various viruses can be used. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based alpha-synuclein animal model for Parkinson&#39;s disease.

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson&#039;s Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

This manuscript describes how viral vector-mediated local gene delivery provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based animal model for Parkinson's disease.

تطوير وبناء الجرذ نموذج ألفا synuclein لمرض باركنسون عن طريق حقن المجسم من النواقل الفيروسية المؤتلف المرتبطة الغدة

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on ...

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Even with the revolution of gene-targeting technologies led by CRISPR-Cas9, genetic modification of human pluripotent stem cells&#160;(hPSCs)&#160;is still time consuming. Comparative studies that use recombinant lines with transgenes integrated into safe harbor loci could benefit from approaches that use site-specific targeted recombinases, like Cre or FLPe, which are more rapid and less prone to off-target effects. Such methods have been described, although they do not significantly outperform gene targeting in most aspects. Using Zinc-finger nucleases, we previously created a master cell line in the AAVS1 locus of hPSCs&#160;that contains a GFP-Hygromycin-tk expressing cassette, flanked by heterotypic FRT sequences. Here, we describe the procedures to perform FLPe recombinase-mediated cassette exchange (RMCE) using this line. The master cell line is transfected with a RMCE donor vector, which contains a promoterless Puromycin resistance, and with FLPe recombinase. Application of both a positive (Puromycin) and negative (FIAU) selection program leads to the selection of RMCE without random integrations. RMCE generates fully characterized pluripotent polyclonal transgenic lines in 15 d&#160;with 100% efficiency. Despite the recently described limitations of the AAVS1 locus, the ease of the system paves the way for hPSC transgenesis in isogenic settings, is necessary for comparative studies, and enables semi-high-throughput genetic screens for gain/loss of function analysis that would otherwise be highly time consuming.

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Here we report a rapid and efficient gene editing method based on RMCE in the AAVS1 locus of human Pluripotent Stem Cells (hPSCs) that improves upon previously described systems. Using this technique, isogenic lines can be rapidly and reliably generated for proper comparative studies, facilitating transgenesis-mediated research with hPSCs.

الجيل السريع والفعال للخلايا الجذعية متعددة القدرات المؤتلف الإنسان التي تتوسط Recombinase-تبادل كاسيت في<em&gt; AAVS1</em&gt; الحالة رقم

Even with the revolution of gene-targeting technologies led by CRISPR-Cas9, genetic modification of human pluripotent stem cells&#160;(hPSCs)&#160;is ...

Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and living organisms from a wide variety of species. The CRISPR technology has also been explored as novel therapeutics for a number of human diseases. Proof-of-concept data are highly encouraging as exemplified by recent studies that demonstrate the feasibility and efficacy of gene editing-based therapeutic approach for Duchenne muscular dystrophy (DMD) using a murine model. In particular, intravenous and intraperitoneal injection of the recombinant adeno-associated virus (rAAV) serotype rh.74 (rAAVrh.74) has enabled efficient cardiac delivery of the Staphylococcus aureus CRISPR-associated protein 9 (SaCas9) and two guide RNAs (gRNA) to delete a genomic region with a mutant codon in exon 23 of mouse Dmd gene. This same approach can also be used to knock out the gene-of-interest and study their cardiac function in postnatal mice when the gRNA is designed to target the coding region of the gene. In this protocol, we show in detail how to engineer rAAVrh.74-CRISPR vector and how to achieve highly efficient cardiac delivery in neonatal mice.

Here we provide a detailed protocol to carry out in vivo cardiac gene editing in mice using recombinant Adeno-Associated Virus(rAAV)-mediated delivery of CRISPR. This protocol offers a promising therapeutic strategy to treat dystrophic cardiomyopathy in Duchenne muscular dystrophy and can be used to generate cardiac-specific knockout in postnatal mice.

مرتبطة بالغدة التسليم الفيروس بوساطة من كريسبر للجينات القلب التحرير في الفئران

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

Subconjunctival Administration of Adeno-associated Virus Vectors in Small Animal Models

Ocular diseases include a wide range of inherited genetic and acquired disorders that are appealing targets for local drug delivery due to their relative ease of accessibility via multiple administration routes. Subconjunctival (SCJ) injections offer advantages over other intraocular administration routes as they are simple, safe, and usually performed in an outpatient setting. SCJ injections in small animals usually require the assistance of an operating microscope due to the size of the eye. Previous work has demonstrated that SCJ injection of specific adeno-associated virus (AAV) serotypes is a valid gene delivery strategy for targeted transduction of the ocular surface, eye muscle, cornea, and optic nerve, providing a potential approach for the treatment of many ocular diseases.
Herein, a detailed protocol is presented for SCJ injections in a mouse model using an injection system consisting of a programmable infusion/withdrawal syringe pump (which allows for consistent and precise injection speed and pressure) and a gastight removable syringe coupled with microinjection needles. The injection system is also adaptable for other intraocular administration routes such as intrastromal, intracameral, intravitreal, and subretinal injections in small animals. Although the delivery of adeno-associated viral vectors for ocular gene therapy studies is described, the protocol herein can also be adapted for a variety of ophthalmic solutions in small animal models. The key practical steps in the administration route, setup for the injection platform, preparation of the injection, and tips from direct experience will be discussed in detail. In addition, common validation techniques for AAV delivery confirmation to the desired tissues will also be briefly discussed.

In this manuscript, subconjunctival injection is demonstrated as a valid vector delivery method for ocular tissues in mice using an injection system consisting of an infusion/withdrawal syringe pump and a gastight removable syringe coupled with microinjection needles. This injection system is also adaptable for other intraocular administration routes.

الإعطاء تحت الملتحمة لنواقل الفيروسات المرتبطة بالغدة في نماذج الحيوانات الصغيرة

Ocular diseases include a wide range of inherited genetic and acquired disorders that are appealing targets for local drug delivery due to their relative ...

عزل AAV بواسطة الطرد المركزي المتدرج لكثافة اليوديكسانول المزدوج

Suspension Culture Production and Purification of Adeno-Associated Virus by Iodixanol Density Gradient Centrifugation for In Vivo Applications

This protocol describes recombinant adeno-associated virus (rAAV) production and purification by iodixanol density gradient centrifugation, a serotype-agnostic method of purifying AAV first described in 1999. rAAV vectors are widely used in gene therapy applications to deliver transgenes to various human cell types. In this work, the recombinant virus is produced by transfection of Expi293 cells in suspension culture with plasmids encoding the transgene, vector capsid, and adenoviral helper genes. Iodixanol density gradient centrifugation purifies full AAV particles based on particle density. Additionally, three steps are included in this now-ubiquitous methodology in order to increase total virus yield, decrease the risk of precipitation due to contaminating proteins, and further concentrate the final virus product, respectively: precipitation of viral particles from cell media using a solution of polyethylene glycol (PEG) and sodium chloride, the introduction of a second round of iodixanol density gradient centrifugation, and buffer exchange via a centrifugal filter. Using this method, it is possible to consistently achieve titers in the range of 1012 viral particles/mL of exceptional purity for in vivo use.

تسليط الضوء على المؤلف: عزل فعال للفيروسات المرتبطة بالغدي للتطبيقات قبل السريرية

Adeno-associated virus is produced in suspension cell culture and purified by double iodixanol density gradient centrifugation. Steps are included to increase total virus yield, decrease the risk of virus precipitation, and further concentrate the final virus product. Expected final titers reach 1012 viral particles/mL and are suitable for pre-clinical in vivo use.