الجزء 1 : إعداد الجهاز ميكروفلويديك عصبون <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> &quot;وتستخدم رقاقة السيليكون مع نمط مصنوعة من SU - 8 بواسطة ضوئيه الإدلاء (PDMS) Polydimethylsiloxane العفن ميكروفلويديك. نشير إلى SU - 8 رقاقة السيليكون منقوشة والقوالب الرئيسية ، أو&quot; A 3 سادة &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مختلطة مع وكيل PDMS علاج في فصيل عبد الواحد / ث نسبة 10:1 ، وهذا هو ، لمدة 10 غراما من PDMS ، يضاف 1 غرام من وكيل علاج لها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط PDMS ثم جيدا وسكب على ورقاقة السيليكون. يرد رقاقة السيليكون داخل صحن 10 سم بيتري البوليسترين. يستغرق حوالي 12 غرام إلى 15 غرام من PDMS لتغطية رئيسية مع سماكة 4 ملم تقريبا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم وضع الربان مع PDMS في فراغ dessicator مع الغطاء طبق بيتري ، ويتم تطبيق فراغ. يتم ذلك للمساعدة على إزالة فقاعات الهواء من PDMS التي تم تقديمها خلال اثارة للعامل في هذه المعالجة. يلزم لتكون إزالة ما يقرب من 15 دقيقة لفقاعات الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتم إزالة رئيسية مع PDMS من dessicator. يستخدم بندقية الهواء مع مرشح أم 0.45 لإزالة أي فقاعات المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم وضع الربان على صفيحة ساخنة 80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة من العلاج. </li></ol> ملاحظة : إذا dessicator فراغ غير متوفرة ، ويمكن ترك الرئيسي في درجة حرارة الغرفة لعدة ساعات. وسوف تتبدد فقاعات الهواء في النهاية من تلقاء نفسها. إذا طبق ساخن غير متوفرة ، فإن PDMS علاج في درجة حرارة الغرفة بعد 24 ساعة. ملاحظة : ومن المهم أيضا للتأكد من أن الربان هو مستوى خلال عملية المعالجة. الجزء 2 : الاستغناء عن جهاز ميكروفلويديك عصبون <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد أن يتم الشفاء من PDMS على الشريحة الرئيسية ، يتم التقاطها على غطاء محرك السيارة نظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام شفرة جراحية ، هو قطع دائرة حول محيط الأجهزة. عند واحد يدخل النصل في PDMS ، فمن المهم لاجراء اتصالات مع رقاقة السيليكون لكن لا تضع الكثير من الضغوط على الرقاقة ، وإلا سيكون سيد الكراك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع دائرة قطع كل الطريق حول الأجهزة (هناك 4 أجهزة في كل ماجستير 3 السيليكون &quot;) ، ورفع بعناية قبالة PDMS الرئيسي. يمكن بدء هذا اللف برفق شفرة الجراحية كما هو إدراجه في خفض السابقة . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل ، وخزانات لكمات في الجهاز باستخدام الأنسجة 8 ملم خزعة لكمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم إيواؤهم الأجهزة وقلص PDMS الزائدة بعيدا حتى أن الجهاز سوف ينطبق بدقة على كورنينج زجاج الغطاء (رقم 1) 24 ملم × 40 ملم. ويستخدم النيتروجين الجوي لتفجير بعيدا أي حطام الزائدة. ويمكن أيضا أن تكون إزالة الحطام العنيد باستخدام العلامة التجارية 3M سكوتش الشريط الفينيل 471. </li></ol> الجزء 3 : البلازما الرابطة الأجهزة زلات لتغطية الزجاج. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يستخدم لتنظيف البلازما السندات Harrick الأجهزة العصبية لتغطية زلات. لفترة وجيزة ، وتوضع الأجهزة في نظافة البلازما ، وتستخدم مضخة فراغ لاجلاء الهواء من الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الضغط من فراغ وصلت 300 milliTorr ، يتم تشغيل الطاقة إلى لفائف الكهربائية وتعيين إلى عالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفائف الكهربائية يخلق البلازما &quot;، وهو غاز مؤين جزئيا يتكون من الإلكترونات ، الأيونات والذرات أو الجزيئات المحايدة&quot; -- <a href="http://www.harrickplasma.com/plasma_physics.php">http://www.harrickplasma.com/plasma_physics.php</a> ، للخروج من جزيئات الهواء المتبقية غادرت في الغرفة. البلازما يخلق نوعا رد الفعل على أسطح من الزجاج والجهاز ، والتي عندما وضعت معا ستشكل سندا دائما. البلازما يتحول أيضا السطوح المائية ، مما يساعد على تسهيل إضافة السوائل. بالإضافة إلى ذلك ، نظافة البلازما يعقم الأجهزة. يوضع على سطح الجهاز PDMS الذي يحتوي على جهاز ميكروفلويديك في مواجهة نظافة البلازما مع الشرائح الزجاجية. ويتم تجميع السطوح البلازما المعالجة من الزجاج وجهاز ميكروفلويديك في اتصال مع بعضها البعض في مقعد نظيفة ، ثم توضع في أطباق العقيمة 60 ملم. والأسطح المعالجة تشكيل رابطة ضيقة لا رجعة فيه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في غضون 10 دقيقة من البلازما الرابطة الأجهزة على الزجاج ، إضافة بولي - L - يسين (PLL) إلى الجهاز. بعد 10 دقيقة ، سوف hydrophilicity الجهاز الانخفاض مما يجعل من الصعب للPLL لدخول الجهاز. ملاحظة : من المهم أن تحقق من وجود فقاعات الهواء في الجهاز بعد إضافة PLL. فقاعات الهواء في القناة الرئيسية هي غير مرغوب فيه ، لأنها أكسدة الخلايا. طريقة سهلة لإزالة أي فقاعات هواء الحالية هو استخدام الماصة P200 مليئة 150 UL السائل (في هذه الحالة PLL) ، ضع طرف مباشر في افتتاح القناة الرئيسية ، وكساد P200 بقوة. هذا قد تحتاج إلى تكرار عدة مرات ولكن في نهاية المطاف قوة من الماصة سيدفع فقاعات الخروج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويسمح للأجهزة التي تحتوي على PLL لاحتضان بين عشية وضحاها في نسيج الثقافة حاضنة قياسية بلغت 37 درجة مئوية مع نسبة 5 ٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي ، دييتم شطف الرذائل بسرعة مرتين مع dH2O تعقيمها. أثناء هذه العملية ، يتم أبدا إزالة السائل تماما من القنوات الرئيسية ، إلا من الخزانات. فإن إزالة السائل من القنوات الرئيسية أعرض الفقاعات. بعد 2 يشطف سريعة ، يتم ملء هذه الأجهزة مع dH2O تعقيمها ووضعها مرة أخرى في حاضنة لمدة لا تقل عن 3 ساعات ، أو بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي ، والأجهزة مرة أخرى تشطف 2 مرات بسرعة مع dH2O تعقيمها. ثم يتم إضافة وسائل الاعلام العصبية القاعدية ، التي تحتوي على ملاحق ضرورية B27 وزراعة الخلايا العصبية لglutamax الجرذان الأولية ، إلى الأجهزة. وضعت الأجهزة مرة أخرى في حاضنة لاستخدامها في المستقبل. الأجهزة هي الآن جاهزة للزرع الخلايا العصبية. </li></ol>

<ol>
	<li>Park, J. W., Vahidi, B., , A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research..">Microfluidic culture platform for neuroscience research..</a> Nat Protoc. 1, 2128-2136 (2006).</li><li>Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury,+regeneration+and+transport.">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nat Methods. 2, 599-605 (2005).</li></ol>

في هذا الفيديو أظهرنا كيفية جعل وإعداد جهاز ميكروفلويديك PDMS التي نستخدمها لثقافة فيها الخلايا العصبية والجهاز يسمح لنا بالحصول على جزء نقية محواري مفصولة microgrooves من مقصورة تحتوي على مزيج من الهيئات الخلية ، والتشعبات ، والمحاوير . هذه الأجهزة تسمح للباحث لدراسة آثار العلاجات المختلفة وكذلك توفير منصة لتنفيذ إصابات جسدية على المحاور ومراقبة ما آثار هذه العلاجات وعلى الخلايا العصبية. ويوفر الجهاز أيضا على مستوى من أجل استنبات الخلايا العصبية التي تساعد على تسهيل دراسات النقل. إضافة إلى ذلك ، microgrooves والتي تفصل بين الثقافة المقصورة الخلية من المقصورة محور عصبي ، ويسمح للعزلة fluidic بين القسمين مما يجعل من الممكن لمعالجة جانب واحد من الجهاز دون التأثير على الجانب الآخر من الجهاز مباشرة مع العلاج. هذه الخاصية تسمح للباحث لدراسة تأثيرات مثل نقل الإشارة والنقل التي تنتج عن العلاج.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>PDMS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sylgard 184 with curing agent

Please consult Dow Corning to find a vendor near you</td>
</tr>
<tr>
<td>Plasam Cleaner</td>
<td>Tool</td>
<td>Harrick</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>http://www.harrickplasma.com/</td>
</tr>
<tr>
<td>Neural Basal Media</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>21103-049</td>
<td>Neural Basal Media is obtained by Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.</td>
</tr>
<tr>
<td>B27</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504-044</td>
<td>B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.</td>
</tr>
<tr>
<td>Glutamax</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>35050-061</td>
<td>Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents.</td>
</tr>
<tr>
<td>Cornig No. 1 Cover Glass</td>
<td>cover glass</td>
<td>Corning</td>
<td>Corning No. X2935 244</td>
<td>Available through Fisher Scientific, Fish Catalog number 12-531D</td>
</tr>
<tr>
<td>60 mm Petri Dish</td>
<td>Tool</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>08-757-13A</td>
<td>60 mm polystyrene sterile petri dishes are used to house the device bound to glass.</td>
</tr>
<tr>
<td>BD Falcon 50 ml Tube</td>
<td>Tool</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>Falcon No. 352098</td>
<td>Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-49A</td>
</tr>
<tr>
<td>BD Falcon 15 ml tube</td>
<td>Tool</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>Falcon No. 352097</td>
<td>Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-L-Lysine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-1274</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
			<div>
					</div>

fabrication of a microfluidic device for the compartmentalization of neuron soma and axons

في هذا الفيديو ، وندلل على تقنية الطباعة الحجرية الناعمة مع siloxane polydimethyl (PDMS) التي نستخدمها لصنع جهاز ميكروفلويديك لزراعة الخلايا العصبية. سابقا ، كانت منقوشة رقاقة السيليكون مع تصميم للجهاز باستخدام الخلايا العصبية ميكروفلويديك SU - 8 و ضوئيه لإنشاء القالب الرئيسي ، أو ما نشير ببساطة إلى أنه &quot;سيد&quot;. المقبل ، ونحن صب بوليمر السليكون PDMS على رأس الرئيسي الذي شفي بعد ذلك عن طريق تسخين PDMS إلى 80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. ويشكل PDMS العفن السلبية للجهاز. ومن ثم قطع بعناية PDMS ورفعت بعيدا عن الربان. واللكم الثقوب حيث سيتم الخزانات وقلص PDMS الزائدة بعيدا عن الجهاز. ويستخدم النيتروجين لتفجير بعيدا أي حطام الزائدة من الجهاز. عند هذه النقطة الأجهزة هي الآن جاهزة للاستخدام ، ويمكن المستعبدين إما لتغطية زجاج كورنينج رقم 1 مع البلازما التعقيم / نظافة أو يمكن أن تكون ملزمة عكسية على الزجاج تغطي ببساطة عن طريق وضع الجهاز على أعلى من الزجاج غطاء. وغطت الرابطة عكسها الجهاز على الزجاج في شريط فيديو منفصل ويتطلب أولا أن يتم تعقيم الجهاز إما مع الايثانول 70 ٪ أو التعقيم. البلازما علاج يعقم الأجهزة حتى لا مزيد من العلاج الضروري. هو عليه ، ومع ذلك ، من المهم ، عند البلازما معالجة الأجهزة ، إضافة إلى الأجهزة السائل في غضون 10 دقيقة من العلاج البلازما في حين لا تزال الأسطح المائية. الانتظار وقتا أطول من 10 دقائق لإضافة السائل إلى الجهاز يجعل من الصعب على السائل لدخول الجهاز. واضاف على الفور الأجهزة العصبية وعادة ما تكون البلازما محدد لتغطية الزجاج و 0.5 ملغ / مل بولي - L - يسين (PLL) في المخزن الرقم الهيدروجيني بورات 8.5 إلى الجهاز. بعد ما لا يقل عن 3 ساعات مع تفرخ PLL ، يتم غسلها بالماء الأجهزة dH2O ما لا يقل عن 3 مرات على الأقل 15 دقيقة بين كل غسل. المقبل ، يتم إزالة الماء ويضاف الطازجة وسائل الإعلام إلى الجهاز. عند هذه النقطة يكون الجهاز جاهزا للاستخدام. من المهم أن نتذكر في هذه المرحلة أن أبدا إزالة كافة وسائل الإعلام من الجهاز. دائما تترك وسائل الإعلام في القناة الرئيسية.

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons at JoVE.com

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

في هذا الفيديو نظهر تقنية الطباعة الحجرية الناعمة مع siloxane polydimethyl (PDMS) التي نستخدمها لfarbricate جهاز ميكروفلويديك لزراعة الخلايا العصبية.

تصنيع جهاز ميكروفلويديك للتجزئة سوما الخلية العصبية والمحاوير

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for ...

fabrication-microfluidic-device-for-compartmentalization-neuron-soma

Research

JoVE Journal

Biology

35.2K Views.  University of California, Irvine (UCI). في هذا الفيديو نظهر تقنية الطباعة الحجرية الناعمة مع siloxane polydimethyl (PDMS) التي نستخدمها لfarbricate جهاز ميكروفلويديك لزراعة الخلايا العصبية.

Video: Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

جهاز ميكروفلويديك مع أنماط Groove لدراسة السلوك الخليوي

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an enabling experimental tool, because it can precisely manipulate fluid flows, enable high-throughput experiments, and generate stable soluble concentration gradients.  Compared to conventional gradient generators, poly(dimethylsiloxane) (PDMS)-based  microfluidic devices can generate stable concentration gradients of growth factors with well-defined profiles.  Here, we developed simple gradient-generating microfluidic devices with three separate inlets.  Three microchannels combined into one microchannel to generate concentration gradients.  The stability and shape of growth factor gradients were confirmed by fluorescein isothyiocyanate (FITC)-dextran with a molecular weight similar to epidermal growth factor (EGF).  Using this microfluidic device, we demonstrated that fibroblasts exposed to concentration gradients of EGF migrated toward higher concentrations.  The directional orientation of cell migration and motility of migrating cells were quantitatively assessed by cell tracking analysis.  Thus, this gradient-generating microfluidic device might be useful for studying and analyzing the behavior of migrating cells.

We describe a protocol for the microfabrication of the gradient-generating microfluidic device that can generate spatial and temporal gradients in well-defined microenvironment. In this approach, the gradient-generating microfluidic device can be used to study directed cell migration, embryogenesis, wound healing, and cancer metastasis.

جهاز لتوليد التدرج ميكروفلويديك لبيولوجيا الخلية

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an ...

Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously dissected and prepared. The E18 cortex is, upon dissection, immediately dissociated into individual neurons. It is possible to store E18 cortex in Hibernate E buffer containing B27 at 4&deg;C for up to a week before the dissociation is performed. However, there will be a drop in cell viability. Typically we obtain our E18 Cortex fresh. It is transported to the lab in ice cold Calcium free Magnesium free dissection buffer (CMFM). Upon arrival, trypsin is added to the cortex to a final concentration of 0.125%. The cortex is then incubated at 37&deg;C for 8 minutes. DMEM containing 10% FBS is added to the cortex to stop the reaction. The cortex is then centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is removed and 2 ml of Neural Basal Media (NBM) containing 2% B27 (vol/vol) and 0.25% Glutamax (vol/vol) is added to the cortex which is then re-suspended by pipetting up and down. Next, the cortex is triturated with previously fire polished glass pipettes, each with a successive smaller opening. After triturating, the cortex is once again centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is then removed and the cortex pellet re-suspended with 2 ml of NBM containing B27 and Glutamax. The cell suspension is then passed through a 40 um nylon cell strainer. Next the cells are counted. The neurons are now ready for loading into the neuron microfluidic device.

In this video we demonstrate the preparation of E18 Cortical Rat Neurons.

إعداد E18 العصبونات القشرية للتجزئة الجرذ في جهاز ميكروفلويديك

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously ...

PDMS Device Fabrication and Surface Modification

PDMS تصنيع الأجهزة وتعديل السطح

Cell Capture Using a Microfluidic Device

القبض على خلية باستخدام جهاز ميكروفلويديك

Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices

In this video, we demonstrate how to use the neuron microfluidic device without plasma bonding.  In some cases it may be desirable to reversibly bond devices to the Corning No. 1 cover glass.  This could be due, perhaps, to a plasma cleaner not being available.  In other instances, it may be desirable to remove the device from the glass after the culturing of neurons for certain types of microscopy or for immunostaining, though it is not necessary to remove the device for immunostaining since the neurons can be stained in the device.  Some researchers, however, still prefer to remove the device.  In this case, reversible bonding of the device to the cover glass makes that possible.  There are some disadvantages to non-plasma bonding of the devices in that not as tight of a seal is formed.  In some cases axons may grow under the grooves rather than through them.  Also, because the glass and PDMS are hydrophobic, liquids do not readily enter the device making it necessary at times to force media and other reagents into the device.  Liquids will enter the device via capillary action, but it takes significantly longer as compared to devices that have been plasma bonded.  The plasma cleaner creates temporary hydrophilic charges on the glass and device that facilitate the flow of liquids through the device after bonding within seconds.  For non-plasma bound devices, liquid flow through the devices takes several minutes.  It is also important to note that the devices to be used with non-plasma bonding need to be sterilized first, whereas plasma treated devices do not need to be sterilized prior to use because the plasma cleaner will sterilize them.

In this video we demonstrate how to use the neuron microfluidic device without plasma bonding.

غير البلازما من الربط PDMS للصناعات رخيصة من أجهزة ميكروفلويديك

In this video, we demonstrate how to use the neuron microfluidic device without plasma bonding.  In some cases it may be desirable to reversibly bond ...

Fabrication of the Thermoplastic Microfluidic Channels

In our lab, we have successfully isolated nucleic acids directly from microliter and submicroliter volumes of human blood, urine and stool using polymer/nanoparticle composite microscale lysis and solid phase extraction columns. The recovered samples are concentrated, small volume samples that are PCRable, without any additional cleanup. Here, we demonstrate how to fabricate thermoplastic microfluidic chips using hot embossing and heat sealing. Then, we demonstrate how to use in situ light directed surface grafting and polymerization through the sealed chip to form the composite solid phase columns. We demonstrate grafting and polymerization of a carbon nanotube/polymer composite column for bacterial cell lysis. We then show the lysis process followed by solid phase extraction of nucleic acids from the sample on chip using a silica/polymer composite column. The attached protocols contain detailed instructions on how to make both lysis and solid phase extraction columns.

Here we demonstrate how to fabricate thermoplastic microfluidic chips using hot embossing and heat sealing. Then we demonstrate how to use in situ light directed surface grafting and polymerization through the sealed chip to form the composite solid phase columns.

تلفيق القنوات ميكروفلويديك الحراري

In our lab, we have successfully isolated nucleic acids directly from microliter and submicroliter volumes of human blood, urine and stool using ...

Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is largely due to the difficulty with which one can create a cell-compatible and steady microenvironment using conventional microfabrication techniques and materials. We address this problem via the introduction of a novel microfabrication material, agarose gel, as the base material for the microfluidic device. Agarose gel is highly malleable, and permeable to gas and nutrients necessary for cell survival, and thus an ideal material for cell-based assays. We have shown previously that agarose gel based devices have been successful in studying bacterial and neutrophil cell migration2. In this report, three parallel microfluidic channels are patterned in an agarose gel membrane of about 1mm thickness. Constant flows with media/buffer are maintained in the two side channels using a peristaltic pump. Cells are maintained in the center channel for observation. Since the nutrients and chemicals in the side channels are constantly diffusing from the side to center channel, the chemical environment of the center channel is easily controlled via the flow along the side channels. Using this device, we demonstrate that the movement of neural stem cells can be monitored optically with ease under various chemical conditions, and the experimental results show that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells. Motility of neural stem cells is an important biomarker for assessing cells aggressiveness, thus tumorigenic factor3. Deciphering the mechanism underlying NSC motility will yield insight into both disorders of neural development and into brain cancer stem cell invasion.

We demonstrate that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells(NSCs) using a novel agarose gel based microfluidic device. This technology can be readily adaptable to other mammalian cell systems where cell sources are scarce, such as human neural stem cells, and the turn around time is critical.

تقييم العصبية على الحركة باستخدام الخلايا الجذعية جل المستندة Agarose الأجهزة ميكروفلويديك

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations at risk. In the process of attempting to identify novel genetic factors associated with PD, scientists have generated many lists of candidate genes, polymorphisms, and proteins that represent important advances, but these leads remain mechanistically undefined. Our work is aimed toward significantly narrowing such lists by exploiting the advantages of a simple animal model system. While humans have billions of neurons, the microscopic roundworm Caenorhabditis elegans has precisely 302, of which only eight produce dopamine (DA) in hemaphrodites. Expression of a human gene encoding the PD-associated protein, alpha-synuclein, in C. elegans DA neurons results in dosage and age-dependent neurodegeneration.
Worms expressing human alpha-synuclein in DA neurons are isogenic and express both GFP and human alpha-synuclein under the DA transporter promoter (Pdat-1). The presence of GFP serves as a readily visualized marker for following DA neurodegeneration in these animals. We initially demonstrated that alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration could be rescued in these animals by torsinA, a protein with molecular chaperone activity 1. Further, candidate PD-related genes identified in our lab via large-scale RNAi screening efforts using an alpha-synuclein misfolding assay were then over-expressed in C. elegans DA neurons. We determined that five of seven genes tested represented significant candidate modulators of PD as they rescued alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration 2. Additionally, the Lindquist Lab (this issue of JoVE) has performed yeast screens whereby alpha-synuclein-dependent toxicity is used as a readout for genes that can enhance or suppress cytotoxicity. We subsequently examined the yeast candidate genes in our C. elegans alpha-synuclein-induced neurodegeneration assay and successfully validated many of these targets 3, 4.
Our methodology involves generation of a C. elegans DA neuron-specific expression vector using recombinational cloning of candidate gene cDNAs under control of the Pdat-1 promoter. These plasmids are then microinjected in wild-type (N2) worms, along with a selectable marker for successful transformation. Multiple stable transgenic lines producing the candidate protein in DA neurons are obtained and then independently crossed into the alpha-synuclein degenerative strain and assessed for neurodegeneration, at both the animal and individual neuron level, over the course of aging.

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson&#039;s Disease Genes

This video demonstrates how to use C. elegans to assess dopaminergic neuron neurodegeneration as a model for Parkinson's disease. Furthermore, genetic screens are used to identify factors that either enhance degeneration or are neuroprotective.

تطبيق الفحص جيم ايليجانس الدوبامين العصبية للتحلل من التحقق من صحة جينات مرض باركنسون المحتملة

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to six independent experiments in parallel for higher-throughput. We developed a new fabrication method to create microfluidic devices having both micro and macro scale structures within the same device through a single soft-lithography process, enabling mass fabrication with good repeatability.
The multi-compartment microfluidic co-culture platform is composed of one soma compartment for neurons and six axon/glia compartments for oligodendrocytes (OLs). The soma compartment and axon/glia compartments are connected by arrays of axon-guiding microchannels that function as physical barriers to confine neuronal soma in the soma compartment, while allowing axons to grow into axon/glia compartments. OLs loaded into axon/glia compartments can interact only with axons but not with neuronal soma or dendrites, enabling localized axon-glia interaction studies. The microchannels also enabled fluidic isolation between compartments, allowing six independent experiments to be conducted on a single device for higher throughput.
Soft-lithography using poly(dimethylsiloxane) (PDMS) is a commonly used technique in biomedical microdevices. Reservoirs on these devices are commonly defined by manual punching. Although simple, poor alignment and time consuming nature of the process makes this process not suitable when large numbers of reservoirs have to be repeatedly created. The newly developed method did not require manual punching of reservoirs, overcoming such limitations. First, seven reservoirs (depth: 3.5 mm) were made on a poly(methyl methacrylate) (PMMA) block using a micro-milling machine. Then, arrays of ridge microstructures, fabricated on a glass substrate, were hot-embossed against the PMMA block to define microchannels that connect the soma and axon/glia compartments. This process resulted in macro-scale reservoirs (3.5 mm) and micro-scale channels (2.5 &mu;m) to coincide within a single PMMA master. A PDMS replica that served as a mold master was obtained using soft-lithography and the final PDMS device was replicated from this master.
Primary neurons from E16-18 rats were loaded to the soma compartment and cultured for two weeks. After one week of cell culture, axons crossed microchannels and formed axonal only network layer inside axon/glia compartments. Axons grew uniformly throughout six axon/glia compartments and OLs from P1-2 rats were added to axon/glia compartments at 14 days in vitro for co-culture.

We developed a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research. The platform is capable of conducting up to six independent experiments in parallel and was fabricated using a newly developed macro/micro hybrid fabrication method.

حجرة متعددة الخلية العصبية الجهاز العصبي المركزي ، الدبقية منهاج ميكروفلويديك المشارك الثقافة

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to ...