الميتوكوندريا ضرورية لصحة الخلايا العصبية. في العديد من الأمراض التنكسية العصبية ، تكون الميتوكوندريا المحورية هي أول من يعاني ، ولكن ليس من الواضح ما الذي يجعل الميتوكوندريا المحورية مميزة للغاية. يسمح تدرج الضغط السائل في الغرف المستخدمة في هذا البروتوكول بالمعالجة الانتقائية لمحاور الميتوكوندريا.
هذا يترك عمليات جسم الخلية دون عائق ، ويسمح لنا بالتركيز على البيولوجيا المحورية. نعرض هنا إزالة استقطاب الميتوكوندريا باستخدام صبغة حساسة لإمكانات الغشاء ، ولكن يمكن تطبيق هذه الطريقة على العديد من أنواع الخلايا العصبية المختلفة ، وقراءات الفلورسنت. للبدء ، ضع ألواح الآبار الستة المشفرة في غطاء معقم ، واغسلها مرتين بالماء المقطر المزدوج المعقم.
اترك الأطباق تجف في وضع مائل لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. قم بإزالة الماء الزائد عن طريق الشفط الفراغي أو سحب العينات. ثم نقع غرفة الموائع الدقيقة في 80 ٪ من الإيثانول.
مرة أخرى ، قم بتجفيف غرفة الموائع الدقيقة لمدة ثلاث إلى خمس دقائق في وضع مائل ، وقم بإزالة الإيثانول الزائد بطرف ماصة. عندما تجف تماما ، ضع غرفة الموائع الدقيقة في وسط البئر واللوحة. اضغط برفق على غرفة الموائع الدقيقة عند حدودها وقسم microgroove في المنتصف للتثبيت المناسب باللوحة الزجاجية.
أولا ، اجمع العدد المطلوب من الخلايا العصبية الحصين المنفصلة في أنبوب تفاعل سعة 1.5 ملليلتر. جهاز طرد مركزي للأنبوب عند 1000 مرة G لمدة أربع دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في ثمانية ميكرولتر من الوسائط القاعدية العصبية B-27.
ثم قم بتوزيع محلول الخلية في مدخل قناة غرفة الموائع الدقيقة. اضغط على الجزء الخلفي من اللوحة للمساعدة في التدفق عبر القناة. باستخدام ماصة ، استنشاق أي تعليق خلوي متبقي عند مخرج القناة.
احتضان غرفة الموائع الدقيقة بالخلايا لمدة 15 إلى 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد ذلك ، املأ البئر المحوري العلوي ب 50 ميكرولترا من الوسائط العصبية القاعدية B-27 ، وانقر على الجزء الخلفي من اللوحة للمساعدة في التدفق. املأ كل بئر على جانب سوما ب 150 ميكرولتر من الوسائط العصبية القاعدية B-27 ، مما يخلق فقاعة توتر في الأعلى.
املأ أيضا كلا البئرين من الجانب المحوري ب 100 ميكرولتر من الوسائط العصبية القاعدية B-27 لكل منهما. بعد سبعة إلى ثمانية أيام من الزراعة في المختبر ، تأكد من أن المحاور قد نمت من خلال الأخاديد الدقيقة ، وامتدت إلى المقصورة المحورية. اغسل الجهاز عن طريق إزالة الوسط العصبي القاعدي B-27 ، وإضافة 100 ميكرولتر من وسيط التصوير الذي تم تسخينه مسبقا إلى الآبار العلوية لكل من القنوات المحورية وقنوات سوما.
دع الوسط يتدفق إلى الآبار السفلية. قم بإزالة الوسط من الآبار السفلية ، وأي وسط متبقي من الآبار العلوية ، وكرر ذلك باستخدام وسط جديد ، وترك الآبار فارغة في نهاية الغسيل. ثم أضف 100 ميكرولتر من تخفيف TMRE النانوي إلى كل من الآبار العلوية الجسدية والمحورية.
دع الوسط يتدفق عبر كلا المقصورتين ، حتى يكون هناك حجم متساو في جميع الآبار. املأ بوسط يحتوي على TMRE. حدد منطقة ذات أهمية في المقصورة الجسدية ، واتبعها من خلال الأخاديد الدقيقة في المقصورة المحورية.
تأكد من مطابقة الأخاديد الدقيقة المصورة في المقصورات الجسدية والمحورية مع بعضها البعض. بعد تغيير اسم الملف ، احصل على صور مضان حمراء باستخدام إثارة 561 نانومتر وأطوال موجية انبعاث 625 نانومتر. تأكد من وجود فرق في الحجم بين غرف سوما وغرف محورية عن طريق التحقق من وجود فقاعة شد على الجانب الجسدي.
ثم قم بإزالة وسيط التصوير من كلا البئرين في الجانب المحوري ، باستثناء الوسيط الموجود داخل القناة. للحث على إزالة استقطاب الميتوكوندريا ، أضف 160 ميكرولترا من 20 ميكرومولار أنتيمايسين A مخفف في وسط التصوير إلى البئر المحوري العلوي. دعها تتدفق عبر القناة حتى يكون هناك حجم متساو في كلا البئرين المحوريين.
كرر التصوير ، وتأكد من تصوير نفس المواضع كما هو الحال أثناء اكتساب خط الأساس ، من خلال تحديد الأخاديد الدقيقة. باستخدام هذا البروتوكول ، نمت الخلايا العصبية الحصين الأولية في أجهزة الموائع الدقيقة ، تليها تلطيخ الميتوكوندريا بصبغة حساسة للغشاء ، TMRE. لوحظ تلطيخ متجانس للميتوكوندريا على جانبي الأخاديد الدقيقة ، ولكن ليس في المنتصف.
عند إضافة antimycin A إلى الجانب المحوري ، احتفظت الميتوكوندريا السومية بإشارة TMRE ، في حين فقدت التألق من الميتوكوندريا المحورية تأكد من عدم ترك أي رطوبة في البئر أو على الجهاز قبل تجميع الجهاز. خلاف ذلك ، لن يتم إغلاق الغرف. باستخدام هذه الطريقة ، يمكننا دراسة تأثيرات فقدان وظيفة الميتوكوندريا في المحور العصبي والوظائف المحلية ، وكذلك تأثيرها على الإشارات الرجعية وبقاء الخلية العالمي.
كان يعتقد منذ فترة طويلة أن التكوين الحيوي للميتوكوندريا يحدث حصريا في جسم الخلية. سمحت لنا هذه الطريقة بالكشف عن أن تلف الميتوكوندريا المحورية يتطلب ترجمة محلية لنقص البروتين PINK1.
