نشكر وو بكين لاستخدام بيانات لها. وأيد هذا العمل من قبل على جائزة التوظيف لجبهة الخلاص الوطني JEK

1. إعداد الحويصلات ~ 50 نانومتر القطر Unilamellar الصغيرة (سيارات الدفع الرباعي) للطي البروتين غشاء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم شراء محلول من 1،2 - dimyristoyl - SN - glycero - phosphocholine - 3 (DMPC) الدهون في الكلوروفورم وaliquotted في قوارير زجاجية نظيفة في 20 ملغ في كميات فيال للتخزين. إضافة طبقة من غاز النيتروجين إلى كل قارورة لمنع أكسدة الدهون ، ويتم ختم القنينات مع القبعات وparafilm. يتم تخزين قوارير في الفريزر -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم استخدام قارورة واحدة تحتوي على قسامة من الدهون 20 ملغ في الكلوروفورم لكل تجربة. يتم تجفيفها محتويات القارورة باستخدام تيار من غاز النيتروجين لمدة 1 ساعة حتى لا يبقى المذيبات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معلق الدهون هي المجففة في 1 مل من 20 ملي البوتاسيوم العازلة الفوسفات (درجة الحموضة = 7.3) باستخدام sonicator حمام الماء ل30 ثانية ~. وهذا الحل يبدو من الدهون علقت غائم ، ويتم نقلها إلى أنبوب 15 مل من البلاستيك مع قاع مخروطي. وأضاف آخر قسامة مل 1 من العازلة الفوسفات إلى القارورة الزجاجية الفارغة التي ترد في الأصل الدهون ، ويتم تكرار صوتنة ؛ ثم يضاف إلى حل للأنبوب 15 مل نفسه. يتم تكرار هذه العملية ما مجموعه 4 مرات حتى الحجم النهائي في الأنبوب هو 4 مل ، مما أدى إلى تركيز الدهون من 5 ملغ / مل في حل هذا المخزون الحويصلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم وضع حجم مل 4 من المادة الدهنية في حل حويصلة دافئة (~ 30 درجة مئوية) حمام المياه ، واستخدام sonicated microtip ultrasonicator لمدة 1 ساعة في دورة عمل 50 ٪. ذو شقين الغرض من حمام الماء. الأولى ، فإنه يمنع الدهون من أن يصبح حل ساخنة جدا بسبب عملية صوتنة. الثانية ، حمام دافئ يضمن درجة حرارة حل الدهن المائي لا يزال أعلى من درجة الحرارة خلال المرحلة الانتقالية طبقة ثنائية صوتنة ؛ لDMPC ، وهذا الانتقال هو درجة الحرارة 23 درجة مئوية ~ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تمرير حل sonicated من خلال حقنة 0.22 ميكرون فلتر لإزالة الانقاض من طرف sonicator ، وهذا الحل هو تصفية المتوازنة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. </li></ol> 2. تحضير عينة من أجل بسط الأولية منحنى الإسفار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم حل المخزون من اليوريا 10 م في 20 ملي العازلة الفوسفات (7.3 درجة الحموضة). فمن الضروري أن يضاف الماء إلى صلب (وليس العكس) لأن كمية كبيرة من اليوريا تحتل حجما كبيرا في الحل. ويمكن إجراء هذا الحل عن طريق إضافة اليوريا المذابة إلى زجاجة نظيفة وفارغة وإضافة الماء يصل إلى حجم النهائي المقصود. قد يكون هذا الحل يتطلب ارتفاع درجات الحرارة في حمام مائي أو على طبق ساخن مع التحريك لإذابة المذاب. اليوريا هو استرطابي ، وبالتالي ، ينبغي تحديد تركيز اليوريا الفعلي للمحلول المخزون باستخدام معامل الانكسار. 1 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم حل المخزون الاحتياطي من الفوسفات 20 ملي (7.3 درجة الحموضة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكشفت حل مخزون مستعدة البروتين. هذا الحل يجب أن يكون البروتين الأسهم تركيز البروتين ميكرومتر ~ 200 في اليوريا M 8 و 20 ملي العازلة الفوسفات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم إعداد عينات للدراسات مضان على النحو التالي. يتم تجميع كميات مناسبة من البروتين الأسهم (القسم 2.3) ، منظر حل الدهون (5 ملغ / مل الدهون ، الفرع 1) ، منظر اليوريا حل M 10 (القسم 2.1) ، والمخزون الاحتياطي الفوسفات (القسم 2.2) لجعل عينات تحتوي على ~ 4 ميكرومتر بروتين ، 1 ملغ / مل الدهون ، و0-8 اليوريا M بزيادات M 1. إجمالي حجم العينة هو 200 لكل ميكرولتر. يتم تضمين جدول المثال (الجدول 1) الذي يسرد وحدات التخزين المطلوبة باستخدام مخزون 200 ميكرومتر حل البروتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مصنوعة عينات فارغة كما هو موضح في القسم 2.4 ، ومع ذلك ، لا يتم إضافة البروتين. في مكان من البروتين ، يمكن إضافة 4 ميكرولتر من محلول اليوريا 8 م حتى تركيزات المكونات الأخرى مماثلة لتلك الموجودة في القسم 2.4. وتستخدم هذه الفراغات للطرح نثر وغيرها من إشارة الخلفية التي تظهر في أطياف مضان من البروتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويسمح للعينات من المقاطع 2.4 و 2.5 لاحتضان على 37 درجة مئوية على الأقل 2 ساعة قبل قياس أطياف مضان لضمان موازنة كاملة وقابلة للطي. </li></ol> 3. قياس الأطياف الإسفار يقاس التربتوفان مضان من كل عينة فارغة وباستخدام مقياس التألق المستمر للدولة. يجب أن تسجل أطياف مضان مع الطول الموجي من 290 نانومتر الإثارة لتجنب الإثارة مخلفات التيروزين ، وتفحص 305-500 نانومتر. مدخل ممر الموجة نموذجية والخروج هو 3 نانومتر. يمكن أن يكون الأمثل لزيادة الطول الموجي والوقت التكامل للإشارة إلى نسبة الضوضاء. القيم النموذجية لزيادة الطول الموجي والوقت والتكامل 1 نانومتر / خطوة و 0.5 ثانية / الخطوة ، على التوالي. الغشاء أضعاف البروتينات عموما في الدهون الاصطناعية فقط عندما تكون درجة الحرارة أعلى من درجة حرارة طبقة ثنائية المرحلة الانتقالية. ولذلك ، في هذه الحالة من DMPC ، هو عقد درجة حرارة ثابتة عند 30 عينة درجة مئوية. وتستخدم وكفيت microvolume السيليكا تنصهر مع 160 ميكرولتر القدرات في هذه السابقينperiments. 4. جيل الأولية منحنى بسط وتقدير للطاقة جيبس ​​الحرة للبروتين الغشاء بسط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تحميل أطياف مضان في شكل مجموعة البيانات XY في صناعة البرمجيات مثل ايغور برو ، ماتلاب ، المنشأ ، أو Excel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب أن تطرح الإشارة من الخلفية حويصلة اليوريا والدهون باستخدام الإجراء التالي : A = الطيف الطيف مضان من البروتين الخام في حضور حويصلات الدهنية وتركيز محدد من اليوريا. B = الطيف الطيف مضان الخام من عينة فارغة المطابقة التي تحتوي على الدهون والحويصلات نفس تركيز اليوريا كما أنه في الطيف ، ولا البروتين في عينات فارغة. الطيف الطيف تصحيح = A -- C * طيف B. C هو المساواة العددية عادة إلى 1.0. في بعض الحالات ، C أقل من أو أكبر من 1.0 لأن القضايا التي تسبب أكثر من نثر أو تحت الطرح بالقرب من المنطقة 305-320 نانومتر ~. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وجدولتها الطول الموجي للمضان الأقصى ، λ كحد أقصى ، من أطياف تصحيح لكل تركيز اليوريا. كشف قيمة نموذجية للبروتين الكامل هو 350 نانومتر الغشاء في حين أن البروتين هو مطوية ~ 330 نانومتر. يتم تحويل موجات جدولتها لكسر تكشفت من خلال تحويل مجموعة من القيم أقصى λ (~ 330 إلى 350 نانومتر ~) لمجموعة 0،0-1،0 لربط قيمة الحد الأقصى لλ جزء من السكان تكشفت. على سبيل المثال ، قيمة الحد الأقصى من 330 نانومتر λ يناظر 0،0 ، و 350 نانومتر يناظر 1.0 ، و 340 نانومتر إلى 0.5 يتوافق من حيث نسبة تكشفت. ثم يتم رسم جزء من هذا البروتين تكشفت ضد تركيز اليوريا. كما ذكر أعلاه ، ينبغي تحديد تركيز اليوريا تجريبيا من خلال قياس معامل الانكسار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نحن نفترض أن البروتين لا يمكن أن توجد في واحدة من دولتين : مطوية أو كشف. كشف مؤامرة من كسر ، و ، في مقابل تركيز يمكن احتواء اليوريا ، C ، للمعادلة : 2 <img src="/files/ftp_upload/2669/2669eq2.jpg" alt="المعادلة 2" /> م في معامل يتوافق مع معدل التغير في الطاقة الحرة فيما يتعلق بتركيز ممسخ وجيم متر يتوافق مع تركيز اليوريا في منتصف الطريق الذي مطوية السكان يساوي عدد سكان تكشفت. هذه القيم هي المتغيرات التي تم الحصول عليها من تركيب المربعات الصغرى المناسب بواسطة برنامج تحليل البيانات. R (0.001987 كيلو كالوري / مول • K) هو قانون ثابت الغاز ، و T هي درجة الحرارة (303 K). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتستخدم في معاملات الحصول عليها من يصلح لتحديد الخطوط جيبس ​​الطاقة (كيلو كالوري / مول) لتتكشف في غياب اليوريا : <img src="/files/ftp_upload/2669/2669eq3.jpg" alt="المعادلة 3"/> . </li></ol> 5. الأمثل بسط Curve للقياس أدق للطاقة جيبس ​​الحرة تتكشف. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منحنى تتكشف المذكورة أعلاه تكشف عن مجموعة من تركيزات اليوريا الذي يتسبب في أكبر تغيير في أقصى λ. هذا النطاق هو عادة صغيرة ، وغالبية تتكشف يحدث داخل هذه الطائفة الصغيرة. على وجه التحديد من أجل تحديد الطاقة خالية من تتكشف ، ويتم تحليل العينات إضافية في هذه المنطقة للحصول على قطعة يحتوي على العديد من نقاط البيانات اللازمة لتركيب المربعات الصغرى الأمثل. على سبيل المثال ، إذا كان البروتين تتكشف بين 2 و 4 M اليوريا ، يمكن إجراء العينات التي تحتوي على 2-4 M اليوريا بزيادات M 0.2 إلى أدق تكشف عن شكل هذه المنطقة الهامة في منحنى تتكشف. ليس من الضروري لقياس أطياف فارغة في كل تركيز اليوريا ، بل يكفي لقياس الطيف فارغة كل خطوة ~ M 0.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قد تتكشف للطاقة خالية من الحصول عليها من هذه المؤامرة تختلف قليلا عن تلك التي حصلت في منحنى الأصلي تتكشف ، ولكنه يعكس قيمة أكثر دقة. </li></ol> 6. ممثل النتائج : <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> عينة </td><td> نهائي [اليوريا] ، M </td><td> بروتين الأسهم (ميكرولتر) </td><td> المخزون الدهني (ميكرولتر) </td><td> الأسهم 10 M اليوريا (ميكرولتر) </td><td> المخزون الاحتياطي (ميكرولتر) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> ~ 0.16 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 0 </td><td> 156 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 1 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 20 </td><td> 136 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 40 </td><td> 116 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 60 </td><td> 96 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 80 </td><td> 76 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 5 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 100 </td><td> 56 </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 6 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 120 </td><td> 36 </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 7 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 140 </td><td> 16 </td></tr></tbody></table> الجدول 1. حجم المخزون من الحلول المطلوبة لجعل عينات مضان <img src="/files/ftp_upload/2669/2669fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. تريبتوفان مضان أطياف من البروتين 5 ميكرومتر ~ ممثل الغشاء الذي يحتوي على بقايا التربتوفان واحد. (A) أطياف مضان من البروتين الخام (A الطيف من 4.2) ، (B) أطياف مضان الخام من فارغة (B الطيف من 4.2) ، (C) التي تم تصحيحها من 4.2 الطيف. <img src="/files/ftp_upload/2669/2669fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> تصحيح الرقم 2. التربتوفان مضان أطياف من البروتين غشاء من الشكل رقم 1 لتركيزات اليوريا عديدة. <img src="/files/ftp_upload/2669/2669fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. بسط منحنى تم الحصول عليها من البيانات في الشكل 2 ، مع أن من المناسب في المعادلة 4.4. يتم حساب الطاقة الحرة جيبس ​​فقا للمادة 4.5.

<ol>
	<li>Shirley, B. A., Shirley, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Folding and Stability. , 177-190 (1995).</li><li>Pace, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+and+Analysis+of+Urea+and+Guanidine+Hydrochloride+Denaturation+Curves.">Determination and Analysis of Urea and Guanidine Hydrochloride Denaturation Curves.</a> Methods Enzymol. 131, 266-279 (1986).</li><li>Lau, F. W., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+Assessing+the+Stability+of+a+Membrane+Protein.">A Method for Assessing the Stability of a Membrane Protein.</a> Biochemistry. 36, 5884-5892 (1997).</li><li>Burgess, N. K., Dao, T. P., Stanley, A. M., Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-Barrel+Proteins+that+Reside+in+the+Escherichia+coli+Outer+Membrane+in+Vivo+Demonstrate+Varied+Folding+Behavior+in+Vitro.">&#946;-Barrel Proteins that Reside in the Escherichia coli Outer Membrane in Vivo Demonstrate Varied Folding Behavior in Vitro.</a> J. Biol. Chem. 283, 26748-26758 (2008).</li><li>Booth, P. J., Curnow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+scene+investigation:+membrane+proteins.">Folding scene investigation: membrane proteins.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 19, 8-13 (2009).</li><li>Hong, H., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+coupling+of+integral+membrane+protein+stability+to+lipid+bilayer+forces.">Elastic coupling of integral membrane protein stability to lipid bilayer forces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4065-4070 (2004).</li><li>Sanchez, K. M., Gable, J. E., Schlamadinger, D. E., Kim, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Tryptophan+Microenvironment,+Soluble+Domain,+and+Vesicle+Size+on+the+Thermodynamics+of+Membrane+Protein+Folding:+Lessons+from+the+Transmembrane+Protein+OmpA.">Effects of Tryptophan Microenvironment, Soluble Domain, and Vesicle Size on the Thermodynamics of Membrane Protein Folding: Lessons from the Transmembrane Protein OmpA.</a> Biochemistry. 47, 12844-12852 (2008).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

البروتوكول الحالي يصف جيل من المنحنيات التي تتكشف للغشاء المرتبطة البروتينات والببتيدات التي تحتوي على بقايا التربتوفان. هنا ، يفترض أن مضان التربتوفان يعكس ما إذا كان يتم طي البروتين والدهون إدراجها في الحويصلات الاصطناعية ، أو كشف في الحل. يتم إجراء افتراضات إضاف...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DMPC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti Polar Lipids</td>
<td>850345C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Urea</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biochemicals</td>
<td>04821527</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium Phosphate Dibasic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>P288</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>P285</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

thermodynamics of membrane protein folding measured by fluorescence spectroscopy

غشاء لطي البروتين هو موضوع الناشئة ذات الأهمية الأساسية على حد سواء والصحية ذات الصلة. وفرة للبروتينات غشاء الخلايا في ترتكز على ضرورة إجراء دراسة شاملة لهذه الأسرة القابلة للطي من البروتينات في كل مكان. بالإضافة إلى ذلك ، بدافع التقدم في قدرتنا على توصيف الأمراض المرتبطة البروتينات تتجمع جهود كبيرة التجريبي والنظري في مجال لطي البروتين. للأسف إن ما يعرقل التقدم السريع في هذا المجال المهم من التحديات الكامنة يرتبط مع بروتينات الغشاء وتعقيد آلية قابلة للطي. هنا ، ونحن المخطط إجراء التجارب لقياس الخاصية الحرارية للطاقة جيبس الحرة للتتكشف في غياب ممسخ ، غ · Δ H 2 O ، لبروتين الغشاء لا يتجزأ من ممثل E. القولونية. ويركز هذا البروتوكول على تطبيق مضان الطيفي لتحديد السكان التوازن الدول مطوية وتكشفت كدالة للتركيز ممسخ. وتبرز الاعتبارات التجريبية لإعداد حويصلات الدهون الاصطناعية وكذلك الخطوات الرئيسية في إجراء تحليل البيانات. هذا الأسلوب هو تنوعا ، ويمكن متابعتها مع أنواع مختلفة من ممسخ ، بما في ذلك درجة الحرارة ودرجة الحموضة ، وكذلك في البيئات المختلفة للطي من الدهون والمذيلات. البروتوكول الحالي هو الوحيد الذي يمكن تعميمها على أي غشاء أو البروتين للذوبان التي تلبي مجموعة من المعايير التي تناقش أدناه.

Watch this Scientific Journal Video about Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy at JoVE.com

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

تفاصيل هذه المقالة الفيديو الإجراء التجريبي للحصول على الطاقة جيبس ​​خالية من طي البروتين الغشاء بواسطة مضان التربتوفان.

الديناميكا الحرارية من البروتين للطي غشاء المقاسة بواسطة التحليل الطيفي الإسفار

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

thermodynamics-membrane-protein-folding-measured-fluorescence

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Bioengineering

Thermodynamics

SCIENTISTS IN ACTION

18.2K Views.  University of California San Diego - UCSD. تفاصيل هذه المقالة الفيديو الإجراء التجريبي للحصول على الطاقة جيبس ​​خالية من طي البروتين الغشاء بواسطة مضان التربتوفان.

Video: Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

طرق الكشف عن منصات مضان الحبرية ميكروفلويديك

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason for this is that folding takes place over a wide range of timescales, from nanoseconds to seconds or longer, depending on the protein1. Conventional stopped-flow mixers have allowed measurement of folding kinetics starting at about 1 ms. We have recently developed a microfluidic mixer that dilutes denaturant ~100-fold in ~8 &mu;s2. Unlike a stopped-flow mixer, this mixer operates in the laminar flow regime in which turbulence does not occur. The absence of turbulence allows precise numeric simulation of all flows within the mixer with excellent agreement to experiment3-4.
Laminar flow is achieved for Reynolds numbers Re &le;100. For aqueous solutions, this requires micron scale geometries. We use a hard substrate, such as silicon or fused silica, to make channels 5-10 &mu;m wide and 10 &mu;m deep (See Figure 1). The smallest dimensions, at the entrance to the mixing region, are on the order of 1 &mu;m in size. The chip is sealed with a thin glass or fused silica coverslip for optical access. Typical total linear flow rates are ~1 m/s, yielding Re~10, but the protein consumption is only ~0.5 nL/s or 1.8 &mu;L/hr. Protein concentration depends on the detection method: For tryptophan fluorescence the typical concentration is 100 &mu;M (for 1 Trp/protein) and for FRET the typical concentration is ~100 nM.
The folding process is initiated by rapid dilution of denaturant from 6 M to 0.06 M guanidine hydrochloride. The protein in high denaturant flows down a central channel and is met on either side at the mixing region by buffer without denaturant moving ~100 times faster (see Figure 2). This geometry causes rapid constriction of the protein flow into a narrow jet ~100 nm wide. Diffusion of the light denaturant molecules is very rapid, while diffusion of the heavy protein molecules is much slower, diffusing less than 1 &mu;m in 1 ms. The difference in diffusion constant of the denaturant and the protein results in rapid dilution of the denaturant from the protein stream, reducing the effective concentration of the denaturant around the protein. The protein jet flows at a constant rate down the observation channel and fluorescence of the protein during folding can be observed using a scanning confocal microscope5.

In this work we explain the fabrication and use of a microfluidic mixer capable of mixing two solutions in ~8 &mu;s. We also demonstrate the use of these mixers with spectroscopic detection using UV fluorescence and fluorescence resonance energy transfer (FRET).

ميكروفلويديك الخلاطات لدراسة طي البروتين

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to identify and characterize their interactions are necessary5. To this end, we developed the Membrane Strep-protein interaction experiment, called Membrane-SPINE6. This technique combines in vivo cross-linking using the reversible cross-linker formaldehyde with affinity purification of a Strep-tagged membrane bait protein. During the procedure, cross-linked prey proteins are co-purified with the membrane bait protein and subsequently separated by boiling. Hence, two major tasks can be executed when analyzing protein-protein interactions (PPIs) of membrane proteins using Membrane-SPINE: first, the confirmation of a proposed interaction partner by immunoblotting, and second, the identification of new interaction partners by mass spectrometry analysis. Moreover, even low affinity, transient PPIs are detectable by this technique. Finally, Membrane-SPINE is adaptable to almost any cell type, making it applicable as a powerful screening tool to identify PPIs of membrane proteins.

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

A biochemical approach is described to identify in vivo protein-protein interactions (PPI) of membrane proteins. The method combines protein cross-linking, affinity purification and mass spectrometry, and is adaptable to almost any cell type or organism. With this approach, even the identification of transient PPIs becomes possible.

غشاء العمود الفقري: أداة كيميائية حيوية لتحديد البروتين البروتين التفاعلات للبروتينات الغشاء<em&gt; في فيفو</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D تتبع المداري في التعديل المجهر ثنائي الفوتون: دراسة تطبيقية على تتبع من بين الخلايا الحويصلات

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of visible light with thermally induced acoustic waves or phonons propagating at a speed of a few km/sec. Information on the elasticity and structure of the material is obtained in a nondestructive contactless manner, hence opening the way to in vivo applications and potential diagnosis of pathology. This work describes the application of Brillouin spectroscopy to the study of biomechanics in elastin and trypsin-digested type I collagen fibers of the extracellular matrix. Fibrous proteins of the extracellular matrix are the building blocks of biological tissues and investigating their mechanical and physical behavior is key to establishing structure-function relationships in normal tissues and the changes which occur in disease. The procedures of sample preparation followed by measurement of Brillouin spectra using a reflective substrate are presented together with details of the optical system and methods of spectral data analysis.

We present a protocol for the application of Brillouin light scattering spectroscopy to elastin and trypsin-purified type I collagen fibers of the extracellular matrix to extract their full elastic properties.

إعداد ألياف البروتين خارج الخلية مصفوفة لBrillouin الطيفي

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and engineered variants of the green fluorescent protein from Aequorea victoria (avGFP) as well as homologs from other species already cover large parts of the optical spectrum, a spectral gap remains in the near-infrared region, for which avGFP-based fluorophores are not available. Red-shifted fluorescent protein (FP) variants would substantially expand the toolkit for spectral unmixing of multiple molecular species, but the naturally occurring red-shifted FPs derived from corals or sea anemones have lower fluorescence quantum yield and inferior photo-stability compared to the avGFP variants. Further manipulation and possible expansion of the chromophore&#39;s conjugated system towards the far-red spectral region is also limited by the repertoire of 20 canonical amino acids prescribed by the genetic code. To overcome these limitations, synthetic biology can achieve further spectral red-shifting via insertion of non-canonical amino acids into the chromophore triad. We describe the application of SPI to engineer avGFP variants with novel spectral properties. Protein expression is performed in a tryptophan-auxotrophic E. coli strain and by supplementing growth media with suitable indole precursors. Inside the cells, these precursors are converted to the corresponding tryptophan analogs and incorporated into proteins by the ribosomal machinery in response to UGG codons. The replacement of Trp-66 in the enhanced &#34;cyan&#34; variant of avGFP (ECFP) by an electron-donating 4-aminotryptophan results in GdFP featuring a 108 nm Stokes shift and a strongly red-shifted emission maximum (574 nm), while being thermodynamically more stable than its predecessor ECFP. Residue-specific incorporation of the non-canonical amino acid is analyzed by mass spectrometry. The spectroscopic properties of GdFP are characterized by time-resolved fluorescence spectroscopy as one of the valuable applications of genetically encoded FPs in life sciences.

Engineering &#039;Golden&#039; Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Synthetic biology enables the engineering of proteins with unprecedented properties using the co-translational insertion of non-canonical amino acids. Here, we presented how a spectrally red-shifted variant of a GFP-type fluorophore with novel fluorescence spectroscopic properties, termed &#34;gold&#34; fluorescent protein (GdFP), is produced in E. coli via selective pressure incorporation (SPI).

هندسة Fluorescence 'الذهبي' بإدراج الضغط الانتقائي من الأحماض الأمينية غير المقبول وتحليل البروتين الكتلي والأسفار

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

كشف الذيفان في تركيبات النانو باستخدام فحوصات ليستي (ال) أموبوسيتي ليمولوس

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an attractive alternative to liposomes or fatty acid-based vesicles. Externally or within the vesicles, peptides can be easily expressed and simplify the synthesis of membrane precursors. Provided here is a protocol for the creation of vesicles with diameters of ~200 nm based on the amphiphilic elastin-like polypeptides (ELP) utilizing dehydration-rehydration from glass beads. Also presented are protocols for bacterial ELP expression and purification via inverse temperature cycling, as well as their covalent functionalization with fluorescent dyes. Furthermore, this report describes a protocol to enable the transcription of RNA aptamer dBroccoli inside ELP vesicles as a less complex example for a biochemical reaction. Finally, a protocol is provided, which allows in vesiculo expression of fluorescent proteins and the membrane peptide, whereas synthesis of the latter results in vesicle growth.

Presented here are protocols for the creation of peptide-based small unilamellar vesicles capable of growth. To facilitate in vesiculo production of the membrane peptide, these vesicles are equipped with a transcription-translation system and the peptide-encoding plasmid.

في فيسيكولو التوليف من السلائف غشاء الببتيد لنمو الحويصلة المستقلة

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

Molecular Spring Constant Analysis by Biomembrane Force Probe Spectroscopy

A biomembrane force probe (BFP) has recently emerged as a native-cell-surface or in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool that can measure single-molecular binding kinetics, assess mechanical properties of ligand-receptor interactions, visualize protein dynamic conformational changes and more excitingly elucidate receptor mediated cell mechanosensing mechanisms. More recently, BFP has been used to measure the spring constant of molecular bonds. This protocol describes the step-by-step procedure to perform molecular spring constant DFS analysis. Specifically, two BFP operation modes are discussed, namely the Bead-Cell and Bead-Bead modes. This protocol focuses on deriving spring constants of the molecular bond and cell from DFS raw data.

A biomembrane force probe (BFP) is an in situ dynamic force spectroscopy (DFS) technique. BFP can be used to measure the spring constant of molecular interactions on living cells. This protocol presents spring constant analysis for molecular bonds detected by BFP.

الجزيئية الربيع التحليل المستمر من قبل التحليل الطيفي قوة قوة Biomembrane

A biomembrane force probe (BFP) has recently emerged as a native-cell-surface or in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool that can measure ...

Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability

Replacement of proline (Pro) residues in proteins by the traditional site-directed mutagenesis by any of the remaining 19 canonical amino acids is often detrimental to protein folding and, in particular, chromophore maturation in green fluorescent proteins and related variants. A reasonable alternative is to manipulate the translation of the protein so that all Pro residues are replaced residue-specifically by analogs, a method known as selective pressure incorporation (SPI). The built-in chemical modifications can be used as a kind of &#34;molecular surgery&#34; to finely dissect measurable changes or even rationally manipulate different protein properties. Here, the study demonstrates the usefulness of the SPI method to study the role of prolines in the organization of the typical &#946;-barrel structure of spectral variants of the green fluorescent protein (GFP) with 10-15 prolines in their sequence: enhanced green fluorescent protein (EGFP), NowGFP, and KillerOrange. Pro residues are present in connecting sections between individual &#946;-strands and constitute the closing lids of the barrel scaffold, thus being responsible for insulation of the chromophore from water, i.e., fluorescence properties. Selective pressure incorporation experiments with (4R)-fluoroproline (R-Flp), (4S)-fluoroproline (S-Flp), 4,4-difluoroproline (Dfp), and 3,4-dehydroproline (Dhp) were performed using a proline-auxotrophic E. coli strain as expression host. We found that fluorescent proteins with S-Flp and Dhp are active (i.e., fluorescent), while the other two analogs (Dfp and R-Flp) produced dysfunctional, misfolded proteins. Inspection of UV-Vis absorption and fluorescence emission profiles showed few characteristic alterations in the proteins containing Pro analogs. Examination of the folding kinetic profiles in EGFP variants showed an accelerated refolding process in the presence of S-Flp, while the process was similar to wild-type in the protein containing Dhp. This study showcases the capacity of the SPI method to produce subtle modifications of protein residues at an atomic level (&#34;molecular surgery&#34;), which can be adopted for the study of other proteins of interest. It illustrates the outcomes of proline replacements with close chemical analogs on the folding and spectroscopic properties in the class of &#946;-barrel fluorescent proteins.

Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How &quot;Molecular Surgery&quot; of the Backbone Affects Folding and Stability

To overcome the limitations of classical site-directed mutagenesis, proline analogs with specific modifications were incorporated into several fluorescent proteins. We show how the replacement of hydrogen by fluorine or of the single by double bonds in proline residues ("molecular surgery") affects fundamental protein properties, including their folding and interaction with light.

التبادل الخاص بالبقايا للبرولين بواسطة نظائر البرولين في البروتينات الفلورية: كيف تؤثر "الجراحة الجزيئية" للعمود الفقري على الطي والاستقرار

Replacement of proline (Pro) residues in proteins by the traditional site-directed mutagenesis by any of the remaining 19 canonical amino acids is often ...