يمكن أن يكمل تعزيز الفلورية الناجم عن البروتين جزيء واحد قياسات FRET عند دراسة الملوثات الفرعية الهيكلية للبروتين والتواؤم ، خاصة في الحالات التي تبلغ فيها الخلايا الفرعية الهيكلية المتميزة عن الهياكل المحلية المستقرة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تلتقط مجموعات فرعية هيكلية متميزة خاصة بالموقع استنادا إلى محيط موقع وضع العلامات على الصبغة إلى أسطح البروتين. يمكن تطبيق تعزيز الفلورسينس أحادي الجزيء والبروتين على أي نظام حيوي جزيئي ذي أهمية للتحقيق في مجموعات فرعية هيكلية متميزة ومحلية.
تبدأ بإعداد 25 بيكومولار سولفو-Cy3 المسمى ألفا-سينوكلين في العازلة القياس في أنبوب ملزم منخفض البروتين. إضافة 100 ميكرولتر من ملليغرام واحد لكل ملليلتر BSA إلى الشريحة غطاء المجهر 18 غرفة واحتضان لمدة دقيقة واحدة، ثم، تجاهل BSA. إضافة 100 ميكرولتر من 25 بيكومولار سولفو-Cy3 المسمى ألفا-سينوكلين عينة في غرفة الشريحة زلة الغطاء.
بعد ذلك ، للحصول على البيانات ، أضف قطرة من المياه فائقة البرودة على الجزء العلوي من عدسة هدف الغمر بالماء ذات الفتحة العددية العالية ، وإصلاح شريحة زلة الغطاء في غرفة المسرح ، ثم تثبيت التجميع على الجزء العلوي من مرحلة المجهر. جلب العدسة الهدف صعودا حتى قطرة الماء على رأس مسحات العدسة الهدف في الجزء السفلي من الشريحة زلة الغطاء، وفتح مصراع الليزر. عندما تتحرك العدسة الموضوعية إلى الأعلى، تفقد نمط الحلقات الهوائية على كاميرا CCD.
الحلقة الأولى تمثل التركيز في واجهة الماء / الزجاج، والحلقة الثانية تمثل التركيز في واجهة بين الزجاج والحل عينة. زيادة ارتفاع العدسة الهدف من قبل 75 ميكرومتر لجعل تركيز الليزر عميق في الحل لتقليل autofluorescence من السطح الزجاجي للانزلاق الغطاء. ضبط قوة الليزر في عدسة الهدف ما يقرب من 100 ، ميكروواط.
بدء اكتساب فوتونات الكشف عن لفترة محددة مسبقا. افتح دفاتر Jupyter، ثم افتح نموذج دفتر الملاحظات. قم بتحميل ملف بيانات FRETBursts وPhoton-HDF5.
استخدم الرسم البياني للزهات بين الفوتون لحساب معدلات الخلفية لكل 30 ثانية من اكتساب البيانات. نقل إطار زمني من فوتون واحد في كل مرة لمدة 20 فوتون متتالية، وجمع بيانات الفوتون إذا كان معدل الفوتون الفوري F أكبر ب 11 مرة على الأقل من معدل الخلفية لتلك الفترة من اكتساب البيانات. حساب حجم انفجار وكمية الفوتونات في انفجار، ومدة انفجار، والفرق الزمني بين آخر وأول أوقات الكشف عن الفوتون في انفجار، وسطوع انفجار، وأكبر قيمة لمعدل الفوتون لحظية في انفجار، وانفجار الفصل، والفاصل الزمني بين رشقات نارية متتالية.
رسم الرسم البياني لقيم سطوع الاندفاع مع محور الأحداث في مقياس لوغاريتمي. حدد عتبة سطوع الاندفاع على أنها الحد الأدنى لقيمة سطوع الاندفاع التي يعرض منها الرسم البياني نمطا متحللا ، ويختار الرشقات بقيم سطوع أكبر من عتبة سطوع الاندفاع. بالنسبة للانفجار يعني قياس العمر الفلوري، رسم الرسم البياني للنانوتاين الفوتون لجميع الفوتونات في رشقات نارية مختارة مع محور العد الفوتون في مقياس لوغاريتمي.
حدد عتبة نانوتايم على أنها الحد الأدنى لقيمة نانوتايم التي يعرض منها الرسم البياني للفوتونات نانوتيم نمطا متحللا. حدد فقط تلك فوتونات مع nanotimes أكبر من عتبة نانوتايم. حساب المتوسط الجبري لجميع nanotimes فوتون مختارة.
طرح عتبة نانوتايم من المتوسط الجبري نانوتايم فوتون. القيمة التي تم الحصول عليها هي متوسط فوتون نانوتايم للانفجار ، يتناسب مباشرة مع متوسط عمر الفلورسينس. رسم الرسم البياني لجميع انفجار يعني العمر الفلوري.
قد تظهر الخلايا الفرعية الموزعة مركزيا لعمر الفلورسينس. تمثل الخلايا الفرعية ذات المتوسطات الأقل قيمة الأنواع الجزيئية مع Sulfo-Cy3 التي لم يتم عرقلتها بشكل نجمي ، في حين أن الاكتظاظ السكاني الفرعي بمتوسطات ذات قيمة أعلى يمثل أنواع الجزيئات مع S-Cy3 التي كانت أكثر عرقلة نجمية. لتقييم الديناميكيات البطيء بين الاندفاعات، قم برسم الرسم البياني لأوقات الفصل المتفجرة بمحور وقت الفصل في مقياس لوغاريتمي.
حدد لحفظ جميع أزواج من رشقات نارية متتالية التي يتم فصلها بأقل من وقت الفصل الأقصى الذي يحدد نفس الجزيء subpopulation. رسم رسم بياني أو مبعثر من متوسط العمر الفلوري من رشقات نارية الأولى والثانية لجميع أزواج من رشقات نارية التي تتكرر تحت عتبة زمنية معينة فصل. وأظهرت المدرجات التكرارية لمعنى العمر الفلوري لجزيء واحد يحمل علامة S-Cy3، ألفا-سينوكلين-56 أن أول اكتظاظ فرعي له عمر مفلور مميز يبلغ 1.6 نانو ثانية، ويمثل حالات تشكيل ألفا-سينوكلين مع عدد قليل من أسطح البروتين بالقرب من البقايا 56.
أما المجموعة الفرعية الثانية فقد كان عمرها الفلوري المميز 3.5 نانو ثانية وتمثل حالات تشكيل ألفا-سينوكلين مع المزيد من أسطح البروتين بالقرب من المخلفات 56. ومن المعروف أن الأجزاء المكونة بيتا غير الأميلويد من جزيئات ألفا-سينوكلين تعتمد هيكلا دمويا دبوس شعر عند الربط ب vesicles SDS، والذي تم تأكيده كسكان وحيدين مدى الحياة مع عمر مميز يبلغ حوالي ثلاثة نانو ثانية، وغياب السكان الفرعيين مع عمر مميز قدره 1.6 نانو ثانية. الرسم البياني لأوقات الفصل بين رشقات نارية متتالية، جزيء واحد تقارير جزيئات متكررة لأوقات الانفصال أسرع من 100 مللي ثانية، حيث رشقات نارية الأولى والثانية تنشأ من نفس الجزيء.
أظهر الرسم البياني المتوسط العمري الفلوري لجميع رشقات الجزيء المفردة ملء السكان بفترة حياة مميزة قصيرة ، وكذلك مع عمر مميز طويل ، مما يشير إلى أن الجزيئات الفردية يمكن أن تخضع لتحولات بين قيم متوسطة مختلفة مدى الحياة أبطأ من أوقات مدة الانفجار. في غضون أوقات فصل انفجار 100 مللي ثانية على الأكثر، كان هناك جزء صغير من الجزيئات التي بدأت كأول انفجار في السكان الفرعيين قصيرة العمر، وتكررت كما انفجار الثاني داخل السكان الفرعية طويلة العمر. في حين أن جزء من الجزيئات التي بدأت كأول انفجار في السكان الفرعيين لمدى الحياة الطويلة ، وتكررت كما انفجر الثاني داخل السكان قصيرة العمر ، يشير إلى التحولات بين السكان الفرعيين في غضون 10 إلى 100 مللي ثانية.
أهم شيء يجب تذكره عند تحليل النتائج التجريبية هو فصل إشارات الفلورسينس أحادية الجزيء بشكل صحيح عن الخلفية ، وتحليل رشقات نارية مع ما يكفي من النانوتات الفوتونية. مهد تطوير smPIFE الطريق للباحثين لاستكشاف تفاعلات بروتين الحمض النووي على مستوى الجزيء الواحد. هذا التقدم يضع الأساس لدراسة الديناميات الهيكلية المحلية داخل البروتينات.
