אנו מודים בייג&#39;ינג וו עבור השימוש בנתונים שלה. עבודה זו נתמכה על ידי בפרס קריירה NSF כדי JEK

1. הכנת ~ 50 ננומטר קוטר שלפוחית ​​Unilamellar קטנים (רכבי השטח) עבור קיפול חלבונים ממברנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון של 1,2-dimyristoyl-SN-glycero-3-phosphocholine (DMPC) שומנים כלורופורם הוא רכש aliquotted לתוך צלוחיות זכוכית נקי 20 מ&quot;ג כמויות בקבוקון לאחסון. שכבה של גז חנקן מתווסף בקבוקון אחד כדי למנוע חמצון של שומנים בדם, ואת צלוחיות חתומות עם כובעים parafilm. צלוחיות מאוחסנים מקפיא ° C -20 עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקבוקון אחד המכיל aliquot של שומנים 20 מ&quot;ג כלורופורם משמש עבור כל ניסוי. תוכנו של הבקבוקון הם יבשים באמצעות זרם של גז חנקן שעה 1 עד לא נשאר ממס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שומנים הם יבשים resuspended ב 1 מ&quot;ל של 20 mM אשלגן זרחתי חיץ (pH = 7.3) באמצעות אמבט מים sonicator עבור ~ 30 שניות. זה פתרון של השומנים מושעה יופיעו מעונן, והוא הועבר צינור פלסטיק 15 מ&quot;ל עם תחתית קונית. Aliquot עוד 1 מ&quot;ל של חיץ פוספט מתווסף בקבוקון זכוכית ריק שהכיל במקור שומנים בדם, ו sonication חוזר: פתרון נוסף לאחר מכן הצינור 15 מ&quot;ל אותו. תהליך זה חוזר בסך הכל 4 פעמים עד נפח סופי הצינור הוא 4 מ&quot;ל, וכתוצאה מכך ריכוז השומנים של 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​בפתרון זה שלפוחית ​​המניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נפח 4 מ&quot;ל של תמיסת שלפוחית ​​השומנים ממוקם חמה (~ 30 ° C) אמבט מים, sonicated באמצעות microtip ultrasonicator שעה 1 על מחזור של 50%. המטרה של מים באמבטיה היא כפולה. ראשית, הוא מונע את פתרון השומנים מלהפוך חם מדי כי התהליך sonication. שנית, אמבטיה חמה מבטיחה את הטמפרטורה של התמיסה מימית השומנים נשאר מעל טמפרטורת המעבר bilayer שלב במהלך sonication; עבור DMPC, טמפרטורת המעבר הזה הוא ~ 23 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון sonicated עובר דרך מזרק 0.22 מיקרומטר לסנן להסיר פסולת מקצה sonicator, וזה פתרון המסוננים equilibrated לילה בשעה 37 ° C. </li></ol> 2. לדוגמא הכנה Curve ראשוני השתלשלות פלואורסצנטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון המניות של אוריאה M 10 במאגר 20 מ&quot;מ פוספט (pH 7.3) הוא עשה. זה חיוני כי מים ניתן להוסיף מוצק (ולא להיפך), כי כמות גדולה של אוריאה תופסת נפח משמעותי לפתרון. פתרון זה אוריאה יכול להתבצע על ידי הוספת מומסים לבקבוק נקי וריק הוספת מים עד נפח סופי המיועד. פתרון זה עשוי לדרוש ההתחממות באמבט מים או על פלטה חשמלית עם בוחש לפזר את המומס. האוריאה הוא hygroscopic ולכן ריכוז בפועל של פתרון המניות אוריאה צריך להיקבע באמצעות מקדם השבירה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ מניות פתרון של פוספט 20 מ&quot;מ (pH 7.3) הוא עשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון המניות של פרש חלבון מוכן. זה פתרון חלבון המניות צריך ריכוז של חלבון ~ 200 מיקרומטר אוריאה M 8, 20 פוספט חוצץ מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות למחקרים הקרינה מוכנים באופן הבא. כמויות מתאימות של חלבונים המניות (סעיף 2.3), שומנים מניות פתרון (5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​שומנים בדם, סעיף 1), 10 מניות פתרון M אוריאה (סעיף 2.1), ואת פוספט למלאי (סעיף 2.2) הם חברו יחד כדי להפוך דגימות המכילות ~ 4 חלבון מיקרומטר, 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​השומנים, ו 0-8 אוריאה M ב 1 במרווחים ז. הנפח הכולל של כל דגימה היא 200 μL. גיליון דוגמא (טבלה 1) נכלל כי כרכים רשימות הנדרשים באמצעות מיקרומטר 200 מניות פתרון חלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות ריק נעשים כמתואר בסעיף 2.4, לעומת זאת, החלבון אינו הוסיף. במקום חלבון, 4 μL של פתרון M 8 אוריאה ניתן להוסיף כל כך ריכוזי מרכיבים אחרים זהים לאלה בסעיף 2.4. חללים אלה משמשים לחסר פיזור האות רקע אחר המופיע הספקטרום של חלבון פלואורסצנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות מן הסעיפים 2.4 ו -2.5 מותר לדגור על 37 מעלות צלזיוס לפחות 2 שעות לפני מדידת ספקטרום הקרינה כדי להבטיח איזון קיפול מלא. </li></ol> 3. מדידה של ספקטרה פלואורסצנטי הקרינה טריפטופן המדגם כל ריק נמדדת באמצעות fluorometer היציב. ספקטרום הקרינה צריכה להיות מוקלט עם אורך גל של 290 ננומטר עירור להימנע עירור של שאריות טירוזין, וסרקתי 305-500 ננומטר. הכניסה טיפוסיים bandpass היציאה 3 ננומטר. תוספת אורך הגל וזמן שילוב יכול להיות מותאם עבור יחס אות לרעש. ערכים טיפוסיים עבור תוספת אורך הגל וזמן אינטגרציה הם 1 ננומטר / צעד 0.5 שניות / צעד, בהתאמה. ממברנה חלבונים לקפל לתוך כלל שומנים סינתטי רק כאשר הטמפרטורה היא מעל הטמפרטורה bilayer שלב המעבר. לכן, במקרה זה של DMPC, הטמפרטורה של המדגם מתקיים קבוע ב 30 ° C. קובט סיליקה התמזגו microvolume עם קיבולת 160 μL מנוצל לשעבר הללוperiments. 4. דור Curve השתלשלות אמידה ראשונית של אנרגיה חופשית של גיבס חלבון ממברנה השתלשלות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספקטרום הקרינה בצורה של בסיס הנתונים xy נטענים לתוך התוכנה כגון איגור Pro, Matlab, מוצא, או Excel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אותות מרקע אוריאה השומנים שלפוחית ​​חייב להיות מופחתים באמצעות ההליך הבא: ספקטרום הקרינה = ספקטרום הגלם של החלבון בנוכחות שלפוחית ​​שומנים ריכוז מסוים של אוריאה. ספקטרום B = ספקטרום הקרינה הגלם של מדגם ריק המקביל שלפוחית ​​המכילה שומנים ריכוז אוריאה זהה לזה ספקטרום; חלבון אין בדגימות ריק. ספקטרום תוקן = קשת - C * קשת ב C הוא סקלר שווה בדרך כלל 1.0. במקרים מסוימים, C הוא פחות או יותר 1.0 בגלל בעיות פיזור שגורמים מעל או מתחת חיסור ליד האזור 305-320 ננומטר ~. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אורך הגל של הקרינה המרבית, λ max, הוא tabulated מן הספקטרום תיקן ריכוז כל אוריאה. ערך אופייני לגמרי פרש חלבון הממברנה הוא 350 ננומטר בעוד זה של חלבון מקופל הוא ~ 330 ננומטר. אורכי גל tabulated מומרים חלק נפרשו ידי המרת טווח הערכים λ max (~ 330 ל ~ 350 ננומטר) לטווח 0.0-1.0 לקשר בין ערך מקסימום λ לשבר של האוכלוסייה פרש. לדוגמה, ערך מרבי λ של 330 nm המתאים 0.0, 350 nm המתאים 1.0, ו - 340 nm המתאים 0.5 במונחים של חלק פרש. חלק זה של חלבון פרש אז הוא זמם נגד ריכוז אוריאה. כאמור לעיל, ריכוז אוריאה צריך להיקבע באופן ניסיוני על ידי מדידת מקדם השבירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו מניחים כי החלבון יכול להתקיים באחד משני מצבים: מקופלת או פרש. העלילה של שבריר פרש, F, לעומת ריכוז אוריאה, C, ניתן להתאים את המשוואה: 2 <img src="/files/ftp_upload/2669/2669eq2.jpg" alt="משוואה 2" /> מ מקדם מתאים שיעור השינוי של האנרגיה החופשית ביחס ריכוז denaturant, ו-C מ מתאים ריכוז אמצע אוריאה שבו האוכלוסייה מקופל שווה האוכלוסייה פרש. ערכים אלה הם המשתנים הולם המתקבל הפחות ריבועים הולם על ידי תוכנת ניתוח נתונים. R (0.001987 kcal / mol • K) הוא חוק גז קבוע, ו-T הוא הטמפרטורה (303 K). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקדמים המתקבלים מתאים מנוצלים כדי לקבוע את תשלום גיבס אנרגיה (קלוריות / mol) של התגלגלות בהעדר אוריאה: <img src="/files/ftp_upload/2669/2669eq3.jpg" alt="משוואה 3"/> . </li></ol> 5. אופטימליים השתלשלות Curve למדידה מדויקת יותר של אנרגיה חופשית של גיבס התגלגלות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקומת ההתפתחות שתוארו לעיל מגלה את טווח ריכוזי שתנן שגורם השינוי הגדול ביותר מקסימום λ. מגוון זה הוא קטן בדרך כלל, ורוב התגלגלות מתרחשת בטווח הקטן הזה. על מנת לקבוע במדויק את האנרגיה החופשית של התגלגלות, דוגמאות נוספות הם ניתחו באזור זה על מנת לקבל עלילה המכיל הרבה נקודות נתונים הדרושים הולם הפחות ריבועים אופטימיזציה. לדוגמה, אם החלבון מתרחשת בין 2 ל 4 אוריאה M, דוגמאות ניתן שמכילים 2-4 אוריאה M ב 0.2 M במרווחים באופן מדויק יותר לחשוף את הצורה של האזור הזה חשוב עקומת התגלגלות. אין צורך למדוד ספקטרום ריק בריכוז כל אוריאה, זה מספיק כדי למדוד ספקטרום ריק כל ~ 0.5 M צעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנרגיה חופשית של התגלגלות המתקבל עלילה זו עשויים להיות שונים במקצת מזה שהושג עקומת התגלגלות המקורי, אבל משקפת ערך מדויק יותר. </li></ol> 6. נציג תוצאות: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מדגם </td><td> סופי [דשן], M </td><td> חלבון מניות (μL) </td><td> מניות השומנים (μL) </td><td> המניה 10 M אוריאה (μL) </td><td> מניות חיץ (μL) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> ~ 0.16 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 0 </td><td> 156 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 1 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 20 </td><td> 136 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 40 </td><td> 116 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 60 </td><td> 96 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 80 </td><td> 76 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 5 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 100 </td><td> 56 </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 6 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 120 </td><td> 36 </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 7 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 140 </td><td> 16 </td></tr></tbody></table> טבלה 1. Volume של פתרונות המניות הנדרשת כדי להפוך דגימות פלואורסצנטי <img src="/files/ftp_upload/2669/2669fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. טריפטופן ספקטרום הקרינה של ~ 5 מיקרומטר חלבון נציג קרום המכיל שאריות טריפטופן יחיד. (א) ספקטרום הקרינה גלם של חלבון (ספקטרום מ 4.2) (ב) ספקטרום הקרינה גלם של ריק (ספקטרום B מ 4.2); (ג) תוקן ספקטרום מ 4.2. <img src="/files/ftp_upload/2669/2669fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. מתוקן טריפטופן ספקטרום הקרינה של חלבון הממברנה מ איור 1 עבור ריכוזי שתנן רבים. <img src="/files/ftp_upload/2669/2669fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. השתלשלות עקומת התקבל מנתונים באיור 2, עם לנכון משוואה 4.4. אנרגיה חופשית גיבס מחושב לפי סעיף 4.5.

<ol>
	<li>Shirley, B. A., Shirley, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Folding and Stability. , 177-190 (1995).</li><li>Pace, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+and+Analysis+of+Urea+and+Guanidine+Hydrochloride+Denaturation+Curves.">Determination and Analysis of Urea and Guanidine Hydrochloride Denaturation Curves.</a> Methods Enzymol. 131, 266-279 (1986).</li><li>Lau, F. W., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+Assessing+the+Stability+of+a+Membrane+Protein.">A Method for Assessing the Stability of a Membrane Protein.</a> Biochemistry. 36, 5884-5892 (1997).</li><li>Burgess, N. K., Dao, T. P., Stanley, A. M., Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-Barrel+Proteins+that+Reside+in+the+Escherichia+coli+Outer+Membrane+in+Vivo+Demonstrate+Varied+Folding+Behavior+in+Vitro.">&#946;-Barrel Proteins that Reside in the Escherichia coli Outer Membrane in Vivo Demonstrate Varied Folding Behavior in Vitro.</a> J. Biol. Chem. 283, 26748-26758 (2008).</li><li>Booth, P. J., Curnow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+scene+investigation:+membrane+proteins.">Folding scene investigation: membrane proteins.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 19, 8-13 (2009).</li><li>Hong, H., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+coupling+of+integral+membrane+protein+stability+to+lipid+bilayer+forces.">Elastic coupling of integral membrane protein stability to lipid bilayer forces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4065-4070 (2004).</li><li>Sanchez, K. M., Gable, J. E., Schlamadinger, D. E., Kim, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Tryptophan+Microenvironment,+Soluble+Domain,+and+Vesicle+Size+on+the+Thermodynamics+of+Membrane+Protein+Folding:+Lessons+from+the+Transmembrane+Protein+OmpA.">Effects of Tryptophan Microenvironment, Soluble Domain, and Vesicle Size on the Thermodynamics of Membrane Protein Folding: Lessons from the Transmembrane Protein OmpA.</a> Biochemistry. 47, 12844-12852 (2008).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הדור של התגלגלות עקומות של הממברנה הקשורים חלבונים ופפטידים המכילים שאריות טריפטופן. כאן, ההנחה היא כי הקרינה טריפטופן משקף אם החלבון מקופל ונוסף שלפוחית ​​שומנים סינתטי, או פרש בתמיסה. הנחות נוספות, כגון קיפול של שתי מדינות ותלות ליניארית ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DMPC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti Polar Lipids</td>
<td>850345C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Urea</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biochemicals</td>
<td>04821527</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium Phosphate Dibasic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>P288</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>P285</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

thermodynamics of membrane protein folding measured by fluorescence spectroscopy

חלבון קיפול ממברנה הוא נושא המתעוררים עם משמעות הן היסוד הקשורים לבריאות. שפע של חלבונים בממברנה של תאים בבסיס הצורך במחקר מקיף של קיפול של משפחה זו נפוצה של חלבונים. בנוסף, ההתקדמות יכולתנו לאפיין מחלות הקשורות חלבונים misfolded יש מוטיבציה המאמצים ניסיונית תיאורטי משמעותי בתחום של קיפול חלבונים. ההתקדמות המהירה בתחום חשוב זה מתעכבת לצערי על ידי האתגרים הכרוכים הקשורים חלבונים בממברנה ואת המורכבות של מנגנון קיפול. כאן, אנו המתאר הליך הניסוי למדידת רכוש התרמודינמית של האנרגיה החופשית של גיבס התגלגלות בהעדר denaturant, Δ G ° H 2 O, חלבון קרום נציג בלתי נפרד מן ה coli. פרוטוקול זה מתמקד ביישום של ספקטרוסקופיה פלואורסצנציה לקבוע אוכלוסיות שיווי משקל של מדינות מקפלת כפונקציה של ריכוז denaturant. שיקולים ניסויית להכנת שלפוחית ​​שומנים סינתטי כמו גם שלבים עיקריים בהליך ניתוח נתונים מודגשים. טכניקה זו היא המגוונת ניתן רדף עם סוגים שונים של denaturant, כולל טמפרטורה ו-pH, כמו גם בסביבות קיפול שונים של שומנים micelles. הפרוטוקול הנוכחי הוא אחד כי ניתן להכליל את קרום או חלבון מסיס אשר עונה על סדרה של קריטריונים בהמשך.

Watch this Scientific Journal Video about Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy at JoVE.com

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

מאמר זה לפרטים וידאו הליך ניסיוני להשגת אנרגיה חופשית של גיבס קיפול חלבונים על ידי קרום טריפטופן פלואורסצנטי.

תרמודינמיקה של קיפול חלבונים ממברנה נמדד על ידי הקרינה ספקטרוסקופיה

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

thermodynamics-membrane-protein-folding-measured-fluorescence

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Bioengineering

Thermodynamics

SCIENTISTS IN ACTION

18.2K Views.  University of California San Diego - UCSD. מאמר זה לפרטים וידאו הליך ניסיוני להשגת אנרגיה חופשית של גיבס קיפול חלבונים על ידי קרום טריפטופן פלואורסצנטי.

Video: Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

שיטות גילוי הקרינה לפלטפורמות אגל microfluidic

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason for this is that folding takes place over a wide range of timescales, from nanoseconds to seconds or longer, depending on the protein1. Conventional stopped-flow mixers have allowed measurement of folding kinetics starting at about 1 ms. We have recently developed a microfluidic mixer that dilutes denaturant ~100-fold in ~8 &mu;s2. Unlike a stopped-flow mixer, this mixer operates in the laminar flow regime in which turbulence does not occur. The absence of turbulence allows precise numeric simulation of all flows within the mixer with excellent agreement to experiment3-4.
Laminar flow is achieved for Reynolds numbers Re &le;100. For aqueous solutions, this requires micron scale geometries. We use a hard substrate, such as silicon or fused silica, to make channels 5-10 &mu;m wide and 10 &mu;m deep (See Figure 1). The smallest dimensions, at the entrance to the mixing region, are on the order of 1 &mu;m in size. The chip is sealed with a thin glass or fused silica coverslip for optical access. Typical total linear flow rates are ~1 m/s, yielding Re~10, but the protein consumption is only ~0.5 nL/s or 1.8 &mu;L/hr. Protein concentration depends on the detection method: For tryptophan fluorescence the typical concentration is 100 &mu;M (for 1 Trp/protein) and for FRET the typical concentration is ~100 nM.
The folding process is initiated by rapid dilution of denaturant from 6 M to 0.06 M guanidine hydrochloride. The protein in high denaturant flows down a central channel and is met on either side at the mixing region by buffer without denaturant moving ~100 times faster (see Figure 2). This geometry causes rapid constriction of the protein flow into a narrow jet ~100 nm wide. Diffusion of the light denaturant molecules is very rapid, while diffusion of the heavy protein molecules is much slower, diffusing less than 1 &mu;m in 1 ms. The difference in diffusion constant of the denaturant and the protein results in rapid dilution of the denaturant from the protein stream, reducing the effective concentration of the denaturant around the protein. The protein jet flows at a constant rate down the observation channel and fluorescence of the protein during folding can be observed using a scanning confocal microscope5.

In this work we explain the fabrication and use of a microfluidic mixer capable of mixing two solutions in ~8 &mu;s. We also demonstrate the use of these mixers with spectroscopic detection using UV fluorescence and fluorescence resonance energy transfer (FRET).

מערבלים microfluidic ללימוד קיפול חלבונים

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to identify and characterize their interactions are necessary5. To this end, we developed the Membrane Strep-protein interaction experiment, called Membrane-SPINE6. This technique combines in vivo cross-linking using the reversible cross-linker formaldehyde with affinity purification of a Strep-tagged membrane bait protein. During the procedure, cross-linked prey proteins are co-purified with the membrane bait protein and subsequently separated by boiling. Hence, two major tasks can be executed when analyzing protein-protein interactions (PPIs) of membrane proteins using Membrane-SPINE: first, the confirmation of a proposed interaction partner by immunoblotting, and second, the identification of new interaction partners by mass spectrometry analysis. Moreover, even low affinity, transient PPIs are detectable by this technique. Finally, Membrane-SPINE is adaptable to almost any cell type, making it applicable as a powerful screening tool to identify PPIs of membrane proteins.

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

A biochemical approach is described to identify in vivo protein-protein interactions (PPI) of membrane proteins. The method combines protein cross-linking, affinity purification and mass spectrometry, and is adaptable to almost any cell type or organism. With this approach, even the identification of transient PPIs becomes possible.

קרום עמוד שדרה: ביוכימית כלי לזיהוי חלבונים אינטראקציות של חלבונים בממברנה<em&gt; בVivo</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D Orbital מעקב במיקרוסקופ שני פוטונים השתנה: בקשה למעקב של תאיים שלפוחית

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of visible light with thermally induced acoustic waves or phonons propagating at a speed of a few km/sec. Information on the elasticity and structure of the material is obtained in a nondestructive contactless manner, hence opening the way to in vivo applications and potential diagnosis of pathology. This work describes the application of Brillouin spectroscopy to the study of biomechanics in elastin and trypsin-digested type I collagen fibers of the extracellular matrix. Fibrous proteins of the extracellular matrix are the building blocks of biological tissues and investigating their mechanical and physical behavior is key to establishing structure-function relationships in normal tissues and the changes which occur in disease. The procedures of sample preparation followed by measurement of Brillouin spectra using a reflective substrate are presented together with details of the optical system and methods of spectral data analysis.

We present a protocol for the application of Brillouin light scattering spectroscopy to elastin and trypsin-purified type I collagen fibers of the extracellular matrix to extract their full elastic properties.

הכנת סיבי חלבון תאי מטריקס עבור ספקטרוסקופיה ברילואן

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and engineered variants of the green fluorescent protein from Aequorea victoria (avGFP) as well as homologs from other species already cover large parts of the optical spectrum, a spectral gap remains in the near-infrared region, for which avGFP-based fluorophores are not available. Red-shifted fluorescent protein (FP) variants would substantially expand the toolkit for spectral unmixing of multiple molecular species, but the naturally occurring red-shifted FPs derived from corals or sea anemones have lower fluorescence quantum yield and inferior photo-stability compared to the avGFP variants. Further manipulation and possible expansion of the chromophore&#39;s conjugated system towards the far-red spectral region is also limited by the repertoire of 20 canonical amino acids prescribed by the genetic code. To overcome these limitations, synthetic biology can achieve further spectral red-shifting via insertion of non-canonical amino acids into the chromophore triad. We describe the application of SPI to engineer avGFP variants with novel spectral properties. Protein expression is performed in a tryptophan-auxotrophic E. coli strain and by supplementing growth media with suitable indole precursors. Inside the cells, these precursors are converted to the corresponding tryptophan analogs and incorporated into proteins by the ribosomal machinery in response to UGG codons. The replacement of Trp-66 in the enhanced &#34;cyan&#34; variant of avGFP (ECFP) by an electron-donating 4-aminotryptophan results in GdFP featuring a 108 nm Stokes shift and a strongly red-shifted emission maximum (574 nm), while being thermodynamically more stable than its predecessor ECFP. Residue-specific incorporation of the non-canonical amino acid is analyzed by mass spectrometry. The spectroscopic properties of GdFP are characterized by time-resolved fluorescence spectroscopy as one of the valuable applications of genetically encoded FPs in life sciences.

Engineering &#039;Golden&#039; Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Synthetic biology enables the engineering of proteins with unprecedented properties using the co-translational insertion of non-canonical amino acids. Here, we presented how a spectrally red-shifted variant of a GFP-type fluorophore with novel fluorescence spectroscopic properties, termed &#34;gold&#34; fluorescent protein (GdFP), is produced in E. coli via selective pressure incorporation (SPI).

הנדסת קרינה פלואורסצנטית 'הזהב' על-ידי הלחץ הסלקטיבי התאגדות של חומצות אמינו קאנונית, אנליזת חלבונים באמצעות ספקטרומטר מסה, קרינה פלואורסצנטית

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

זיהוי של אנדוטוקסין ניסוחים-Nano באמצעות מבחני Lysate (LAL) Amoebocyte Limulus

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an attractive alternative to liposomes or fatty acid-based vesicles. Externally or within the vesicles, peptides can be easily expressed and simplify the synthesis of membrane precursors. Provided here is a protocol for the creation of vesicles with diameters of ~200 nm based on the amphiphilic elastin-like polypeptides (ELP) utilizing dehydration-rehydration from glass beads. Also presented are protocols for bacterial ELP expression and purification via inverse temperature cycling, as well as their covalent functionalization with fluorescent dyes. Furthermore, this report describes a protocol to enable the transcription of RNA aptamer dBroccoli inside ELP vesicles as a less complex example for a biochemical reaction. Finally, a protocol is provided, which allows in vesiculo expression of fluorescent proteins and the membrane peptide, whereas synthesis of the latter results in vesicle growth.

Presented here are protocols for the creation of peptide-based small unilamellar vesicles capable of growth. To facilitate in vesiculo production of the membrane peptide, these vesicles are equipped with a transcription-translation system and the peptide-encoding plasmid.

ב והשרירים סינתזה של ממברנות פפטיד הפרה עבור הצמיחה שלפוחית אוטונומית

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

Molecular Spring Constant Analysis by Biomembrane Force Probe Spectroscopy

A biomembrane force probe (BFP) has recently emerged as a native-cell-surface or in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool that can measure single-molecular binding kinetics, assess mechanical properties of ligand-receptor interactions, visualize protein dynamic conformational changes and more excitingly elucidate receptor mediated cell mechanosensing mechanisms. More recently, BFP has been used to measure the spring constant of molecular bonds. This protocol describes the step-by-step procedure to perform molecular spring constant DFS analysis. Specifically, two BFP operation modes are discussed, namely the Bead-Cell and Bead-Bead modes. This protocol focuses on deriving spring constants of the molecular bond and cell from DFS raw data.

A biomembrane force probe (BFP) is an in situ dynamic force spectroscopy (DFS) technique. BFP can be used to measure the spring constant of molecular interactions on living cells. This protocol presents spring constant analysis for molecular bonds detected by BFP.

ניתוח מתמיד של האביב המולקולרי על ידי ספקטרוסקופיית בדיקה כוח Biomembrane

A biomembrane force probe (BFP) has recently emerged as a native-cell-surface or in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool that can measure ...

Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability

Replacement of proline (Pro) residues in proteins by the traditional site-directed mutagenesis by any of the remaining 19 canonical amino acids is often detrimental to protein folding and, in particular, chromophore maturation in green fluorescent proteins and related variants. A reasonable alternative is to manipulate the translation of the protein so that all Pro residues are replaced residue-specifically by analogs, a method known as selective pressure incorporation (SPI). The built-in chemical modifications can be used as a kind of &#34;molecular surgery&#34; to finely dissect measurable changes or even rationally manipulate different protein properties. Here, the study demonstrates the usefulness of the SPI method to study the role of prolines in the organization of the typical &#946;-barrel structure of spectral variants of the green fluorescent protein (GFP) with 10-15 prolines in their sequence: enhanced green fluorescent protein (EGFP), NowGFP, and KillerOrange. Pro residues are present in connecting sections between individual &#946;-strands and constitute the closing lids of the barrel scaffold, thus being responsible for insulation of the chromophore from water, i.e., fluorescence properties. Selective pressure incorporation experiments with (4R)-fluoroproline (R-Flp), (4S)-fluoroproline (S-Flp), 4,4-difluoroproline (Dfp), and 3,4-dehydroproline (Dhp) were performed using a proline-auxotrophic E. coli strain as expression host. We found that fluorescent proteins with S-Flp and Dhp are active (i.e., fluorescent), while the other two analogs (Dfp and R-Flp) produced dysfunctional, misfolded proteins. Inspection of UV-Vis absorption and fluorescence emission profiles showed few characteristic alterations in the proteins containing Pro analogs. Examination of the folding kinetic profiles in EGFP variants showed an accelerated refolding process in the presence of S-Flp, while the process was similar to wild-type in the protein containing Dhp. This study showcases the capacity of the SPI method to produce subtle modifications of protein residues at an atomic level (&#34;molecular surgery&#34;), which can be adopted for the study of other proteins of interest. It illustrates the outcomes of proline replacements with close chemical analogs on the folding and spectroscopic properties in the class of &#946;-barrel fluorescent proteins.

Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How &quot;Molecular Surgery&quot; of the Backbone Affects Folding and Stability

To overcome the limitations of classical site-directed mutagenesis, proline analogs with specific modifications were incorporated into several fluorescent proteins. We show how the replacement of hydrogen by fluorine or of the single by double bonds in proline residues ("molecular surgery") affects fundamental protein properties, including their folding and interaction with light.

חילופי פרולין ספציפיים לשאריות על ידי אנלוגים פרולין בחלבונים פלואורסצנטיים: כיצד "ניתוח מולקולרי" של עמוד השדרה משפיע על קיפול ויציבות

Replacement of proline (Pro) residues in proteins by the traditional site-directed mutagenesis by any of the remaining 19 canonical amino acids is often ...