وقد تم تمويل هذا العمل من خلال منحة البحث ومنحة في والمعونة. الأغذية من مشروع تقنية النانو في وزارة الزراعة والغابات ومصائد الأسماك في اليابان

1. نضح من الكبد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير أحد البالغين الذكور ، سبراغ داولي (10 إلى 15 أسبوعا من العمر ؛ وزن الجسم 150-200 ز) عن طريق الحقن داخل الصفاق من حل بنتوباربيتال الصوديوم (50 ملغ صوديوم بنتوباربيتال / كيلوغرام من وزن الجسم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الحيوانات في مقلاة غير القابل للصدأ ورذاذ الايثانول 70 ٪ على البطن والصدر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء قطع صغيرة وتقشر الجلد. فتح البطن التي قطعت مع زوج من مقص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكيد موقع الوريد البابي ، وتمرير الخيط الجراحي تحت الوريد البابي وتتجمع فضفاضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتجمع في الجزء البعيد من الوريد الأجوف السفلي والوريد المساريقي لمنع ارتجاع الدم الى الكبد. فتح التجويف الصدري عن طريق خفض الحجاب الحاجز مع مقص ، وفضح القلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ادخال قسطرة من البلاستيك (2 مم) في الوريد البابي وتشديد الخيط بقوة حول القسطرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيل قسطرة لنظام الارواء التي يتم تحميلها مع حل الغسيل (كا 2 + 2 + ملغ HBSS الحرة التي تحتوي على 0،5 EGTA ملم ، 10 ملم HEPES و 4.2 ملي NaHCO 3 ؛ الرقم الهيدروجيني 7.2) prewarmed عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يبدأ نضح في الموقع بمعدل 10 مل / دقيقة. في الوقت نفسه ، وجعل قطع في جدار الأذين الأيمن. يستمر لمدة 10 دقيقة الارواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل إلى الحل حل نضح كولاجيناز [HBSS تحتوي HEPES 10MM و4.2mM NaHCO 3 تستكمل مع النوع الأول كولاجيناز (0.05 ٪) ، ومثبط التربسين (50 ميكروغرام / مل) ؛ الرقم الهيدروجيني 7،5] ، ويروي لمدة 10 -- 20 دقيقة بمعدل من 10 مل / دقيقة حتى الكبد تتضخم قليلا ويظهر علامة للتفكك بنية الكبد تحت الغشاء المصلي. </li></ol> 2. إعداد جزء الخلية الكبدية متني الغنية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية ونقل الكبد في دورق العقيمة التي تحتوي على 25 مل من محلول كولاجيناز. اللحم المفروم إلى قطع صغيرة بواسطة مقص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 75 مل من MEM الباردة في تعليق الخلية الناتجة. بعد pipetting رقيقة ، والترشيح من خلال مصفاة الخلية (100 ميكرون) لإزالة الأنسجة الضامة وأنسجة شظايا عسر الهضم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل رشاحة في أنابيب مخروطية 50 مل و 50 في أجهزة الطرد المركزي لXG 1 دقيقة بمعدل 4 درجات مئوية (فرامل إيقاف). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل بعناية طاف. Resuspend الكرية مع MEM الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر 2.4) ثلاث مرات. </li></ol> 3. الثقافة الابتدائية المختلطة من خلايا الكبد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق الخلايا التي تم الحصول عليها في 2.5) في المتوسط ​​النمو تتألف من DMEM تحتوي على 10 ٪ FCS الحرارة المعطل ، على أن تستكمل مع 100 ميكرومتر β - المركابتويثانول ، 10 ميكروغرام / مل الانسولين ، و 100 ميكروغرام / مل و 100 الستربتوميسين البنسلين يو / لتر ، والبذور في 09:55 القوارير زراعة الأنسجة (مساحة : 75 سم 2) في مناطق ذات كثافة 6.7 X الخلايا 4 10 / سم 2 (5 × 10 6 خلية / قارورة / 12 -15 مل من المتوسط). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان ثقافة flasksat 37 درجة مئوية في جو من 5 ٪ CO 2-95 الهواء ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال المتوسطة النمو كل 2 إلى 3 أيام فاصلة. </li></ol> 4. عزل انتقائية تقوم البلاعم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 12 يوما من الثقافة والضامة تتكاثر الخلايا على ورقة. يتم تعليق هذه الخلايا عن طريق المصافحة المتبادلة للثقافة في قوارير 80-120 السكتات الدماغية في الدقيقة الواحدة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الثقافة في المتوسط ​​100 ملم غير نسيج الثقافة الأطباق البلاستيكية الصف. بركة المتوسطة من قوارير T75 اثنين الى صحن من البلاستيك واحد. قوارير الثقافة الملء مع متوسط ​​النمو وإعادتهم إلى الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الصحون البلاستيكية لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في جو من ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5 ٪ 2-95 ٪ الهواء. الضامة نعلق بسهولة لغير نسيج الثقافة الأطباق البلاستيكية الصف تحت حضانة هذه العملية ، في حين أن غيرها من الخلايا الملوثة لا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح على المديين المتوسط ​​والشطف بلطف طبق من البلاستيك مع برنامج تلفزيوني. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من محلول اكسبريس TrypLE في الطبق ، واحتضان ل10min عند 37 درجة مئوية في جو من ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5 ٪ 2-95 ٪ الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 9 مل من متوسطة النمو. كشط بلطف قبالة الضامة التي توليها مكشطة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل تعليق خلية في أنبوب مخروطي 15 مل و 180 جهاز طرد مركزي في XG لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية (على الفرامل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف وإضافة 1 مل من المتوسط ​​النمو. فصل في الخلايا واحد عن طريق pipetting قوية. تعداد عدد الخلايا من قبل العد عدادة الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن تكرار الخطوات العزلة مع قوارير نفس الثقافة اليوم على فترات 2-3 لأكثر من أسبوعين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن تربيتها الضامة معزولة في وسط النمو وصفها في 3.1. </li></ol> 5. ممثل النتائج ويرد مثال للثقافة ابتدائية مختلطة من البالغين خلايا كبد الفئران في الشكل 2. تفقد خلايا الكبد متني مورفولوجيا الخلايا الظهارية في غضون بضعة أيام في الثقافة ، أو تتحول إلى تحويل الخلايا الليفية مثل الخلايا.ثم ، حول يوم 6 إلى 12 ، مرحلة التباين الساطع ، على مدار بلعم تشبه الخلايا تتكاثر vigourouly على الورقة خلية ليفية. التي تهز من القوارير والثقافة ، وتعلق بسهولة الضامة في مستنبت ، ونقل لاحقا وحضانة في أطباق بلاستيكية في نتيجة التصاق الانتقائي للالضامة (الشكل 3). يمكن حصاده خلايا البلاعم تشبه في اقرب وقت يوم 8 ، والأعداد وصلت إلى مستويات قصوى في أيام 12 إلى 14. يمكن حصاده أكثر من 10 6 خلايا من قارورة الثقافة T75 مرارا في فترات اليوم 2 إلى 3 لأكثر من أسبوعين ، مما يتيح تحقيق عائد إجمالي في الخلية القارورة من قارورة الثقافة في 10 7 T75 (الشكل 3). كانت درجات نقاء من الضامة معزولة 95-99 ٪ ، حسب تقييم flowcytometry أو كيمياء سيتولوجية مناعية مع الاجسام المضادة المحددة بلعم الفئران ، مثل ED - 1 (الشكل 4) ، ED - 3 ، OX - 41 (الشكل 4) و 9 Iba1. الخلايا معزولة تظهر الخصائص المميزة للالضامة ، مثل البلعمة نشطة من الخرز polystylene (الشكل 5) ، والاستجابة لالتكاثري المؤتلف GM - CSF ، إفراز التهاب / مضادة للالتهاب السيتوكينات على التحفيز مع LPS ، وتشكيل خلايا عملاقة multinucleated 9. <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. مخطط لعزل وتنقية انتقائية مثل خلايا البلاعم من الثقافة الابتدائية المختلطة للخلايا كبد الفئران. <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. الثقافة الأولية للخلايا كبد الفئران وانتشار بلعم تشبه الخلايا. يشير السهم خلية عملاقة متعدد النوى. مقياس بار = 100 ميكرومتر. نقلا عن مجلة طرق مناعية ، Vol.360 ، 47-55 (2010) 9 بإذن من السيفير. <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. العزل الانتقائي للخلايا البلاعم الشبيهة بها وأسلوب الهز المرفق. علقت الخلايا في مستنبت التي تهز قوارير أو نقلها لاحقا إلى أطباق ثقافة غير النسيج البلاستيكية الصف ، وحضنت في 37 درجة مئوية. اعتبارا من 10 دقيقة بعد الطلاء ، مثل خلايا البلاعم ، تعلق على سطح الطبق ، في حين أن غيرها خلايا ليفية تلويث ظلت معلقة. بعد الشطف مع برنامج تلفزيوني ، وكان حصل على السكان بلعم عالي النقاء. اكتسبت هذه الخلايا عادة البلاعم التشكل بعد 40 دقيقة من الثقافة ، وشوهدت في كثير من الأحيان الخلايا الإنقسامية (الأسهم). وتظهر التغييرات اللاحقة في أعداد الخلايا المستخرجة من القوارير في فترات ثقافة مختلفة. القيم هي في المتوسط ​​± SD 3-5 القوارير. تكررت التجارب ثلاث مرات وأشارت بيانات برموز مختلفة. مقياس بار = 100 ميكرومتر. نقلا عن مجلة طرق مناعية ، Vol.360 ، 47-55 (2010) 9 بإذن من السيفير. <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4. تلطيخ Immunocytochemical من مثل خلايا البلاعم مع الاجسام المضادة ضد الضامة الفئران. <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig5.jpg" alt="الشكل 5" /> الشكل 5. البلعمة من FITC المسمى microbeads التي تشبه خلايا البلاعم.

<ol>
	<li>Crispe, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+liver+as+a+lymphoid+organ.">The liver as a lymphoid organ.</a> Annu. Rev. Immunol. 27, 147-163 (2009).</li><li>Roberts, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+Kupffer+cell+in+mediating+hepatic+toxicity+and+carcinogenesis.">Role of the Kupffer cell in mediating hepatic toxicity and carcinogenesis.</a> Toxicol. Sci. 96, 2-15 (2007).</li><li>Gao, B., Jeong, W. I., Tian, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver:+An+organ+with+predominant+innate+immunity.">Liver: An organ with predominant innate immunity.</a> Hepatology. 47, 729-736 (2008).</li><li>Janousek, J., Strmen, E., Gervais, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+murine+Kupffer+cells+by+centrifugal+elutriation.">Purification of murine Kupffer cells by centrifugal elutriation.</a> J. Immunol. Methods. 164, 109-117 (1993).</li><li>Olynyk, J. K., Clarke, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+rat+Kupffer+cells.">Isolation and primary culture of rat Kupffer cells.</a> J. Gastroenterol. Hepatol. 13, 842-845 (1998).</li><li>Heuff, G., Meyer, S., Beelen, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+rat+and+human+Kupffer+cells+by+a+modified+enzymatic+assay.">Isolation of rat and human Kupffer cells by a modified enzymatic assay.</a> J. Immunol. Methods. 174, 61-65 (1994).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+isolated+rat+liver+cells.">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).</li><li>Yoshioka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+and+expression+of+cytokine+mRNAs+by+lipopolysaccharide+in+bovine+Kupffer+cells.">Primary culture and expression of cytokine mRNAs by lipopolysaccharide in bovine Kupffer cells.</a> Vet. Immunol. Immunopathol. 58, 155-163 (1997).</li><li>Kitani, H., Takenouchi, T., Sato, M., Yoshioka, M., Yamanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+isolation+method+for+macrophage-like+cells+from+mixed+primary+cultures+of+adult+rat+liver+cells.">A novel isolation method for macrophage-like cells from mixed primary cultures of adult rat liver cells.</a> J. Immunol. Methods. 360, 47-55 (2010).</li><li>Gorrell, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+fibrosis:+the+hepatocyte+revisited.">Liver fibrosis: the hepatocyte revisited.</a> Hepatology. 46, 1659-1661 (2007).</li></ol>

وتظل جميع الحيوانات وتعمل في منشأة الحيوان في المعهد الوطني للصحة الحيوانية ، وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها اللجنة المؤسسة للتجارب على الحيوانات.

هنا ، نحن تقرير طريقة بسيطة وفعالة للحصول على الضامة من ثقافات الابتدائية المختلطة الكبار خلايا الكبد الفئران. أسلوبنا يعتمد أولا على النشاط التكاثري رواية الضامة في ثقافة مختلطة من خلايا كبد الفئران ، ومن ثم عزل وتنقية لاحق من هذه الخلايا على أساس خصائصها البيولوجية والضامة 9. قد يكون من الممكن الضامة انتشرت في الثقافة الابتدائية المختلطة من خلايا الكبد الكبار قد نشأت من خلايا كوبفر أو ذات الصلة التي الملوثة في كسر خلايا الكبد متني. قد استجابت الضامة مع التغيرات البيئية الناجمة عن التحول معينة من الخلايا الكبدية متني 10 ليفية وغيرها من الثقافات الابتدائية المختلطة. في الختام ، اسلوبنا يوفر عزل خلايا البلاعم التي تشبه في عدد كاف من النقاء والثقافة الأساسي من الفئران الكبد cellswithout باستخدام معدات متطورة ومهارات فنية. بالإضافة ، يمكن تكرار إجراء العزل مع قارورة الثقافة نفسها لأكثر من أسبوعين. قد تكون هذه الطريقة تنطبق على الأنواع الأخرى من الثدييات.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليقات (اختياري) </th></tr><tr><td> الحل الصوديوم بنتوباربيتال </td><td> كيوريتسي Seiyaku </td><td> Somnopentyl حقن </td><td></td></tr><tr><td> هانك في محلول الملح المتوازن (HBSS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14185-052 </td><td></td></tr><tr><td> جلايكول الإثيلين tetraacetic حمض (EGTA) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> E - 4378 </td><td></td></tr><tr><td> كولاجيناز </td><td> واكو الصرفة للصناعات الكيماوية المحدودة </td><td> 032-10534 </td><td> خلية تفكك الصف (لوط الاختيار الحاجة) </td></tr><tr><td> مثبط التربسين </td><td> سيغما الدريخ </td><td> T - 9128 </td><td></td></tr><tr><td> النسر المتوسطة الأساسية الدنيا (MEM) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> M - 4655 </td><td></td></tr><tr><td> لتعديل Dulbecco نسر المتوسطة (DMEM) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> D - 6459 </td><td> ارتفاع السكر من النوع </td></tr><tr><td> الجنين مصل العجل (FCS) </td><td> HyClone </td><td> SH30070.03 </td><td> الحرارة المعطل عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. (لوط الاختيار الحاجة) </td></tr><tr><td> TrypLE اكسبرس </td><td> Invitrogen </td><td> 12605 </td><td></td></tr><tr><td> الفوسفات مخزنة في Dulbecco المالحة (PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td><td> CA - 2 + 2 + المغنيسيوم مجانا </td></tr><tr><td> β - المركابتويثانول </td><td> سيغما الدريخ </td><td> M - 7522 </td><td> الأسهم : 100 ملم في الماء المقطر </td></tr><tr><td> الأنسولين </td><td> سيغما الدريخ </td><td> I - 5500 </td><td> المخزون : 10 ملغ / مل في حمض الهيدروكلوريك 0.1N </td></tr><tr><td> البنسلين / الستربتوميسين </td><td> Invitrogen </td><td> 15070 </td><td></td></tr><tr><td> خلية مصفاة </td><td> العلوم البيولوجية دينار بحريني </td><td> 352360 </td><td> حجم فتحات الشباك : 100 ميكرومتر </td></tr><tr><td> نسيج الثقافة القارورة </td><td> الباكليت سوميتومو المحدودة </td><td> MS - 21250 </td><td> المساحة : 75 سم 2 </td></tr><tr><td> أطباق ثقافة غير الأنسجة البلاستيكية </td><td> العلوم البيولوجية دينار بحريني </td><td> 351005 </td><td></td></tr><tr><td> خلية مكشطة </td><td> شركة كورنينج </td><td> 3010 </td><td></td></tr><tr><td> متبادلة شاكر </td><td> TAITEC </td><td> NR - 1 </td><td></td></tr></tbody></table>

a simple and efficient method to isolate macrophages from mixed primary cultures of adult liver cells

خلايا كوبفر هي الضامة المقيمين الكبد محددة وتلعب دورا هاما في الوظائف الفسيولوجية والمرضية في الكبد 1-3. على الرغم من أن أساليب عزل الضامة الكبد وقد موصوفة وصفا جيدا 4-6 ، ومعظم هذه الطرق تحتاج إلى معدات متطورة ، مثل elutriator الطرد المركزي والمهارات التقنية. هنا ، ونحن نقدم طريقة جديدة للحصول على الضامة الكبد في عدد كاف من النقاء والثقافات الابتدائية المختلطة الكبار خلايا الكبد الفئران ، تخطيطي كما هو موضح في الشكل 1. بعد تفكك خلايا الكبد من قبل اثنين من خطوة طريقة الارواء 7،8 ، تعد جزءا تتألف في معظمها من خلايا الكبد متني والمصنفة في قوارير T75 زراعة الأنسجة مع مستنبت تتكون من خلايا الكبد وDMEM FCS.Parenchymal 10 ٪ تفقد مورفولوجيا الخلايا الظهارية في غضون بضعة أيام في الثقافة ، أو تتحول إلى تحويل الخلايا الليفية مثل (الشكل 2). كما العائدات والثقافة ، وحول يوم 6 ، المرحلة التباين الساطع ، على مدار بلعم شبيهة تبدأ الخلايا في التكاثر على الورقة خلية ليفية (الشكل 2). نمو خلايا البلاعم مثل الاستمرار والوصول إلى أقصى مستويات حول 12 ايام ، وتغطي الورقة على سطح الخلية القارورة. التي تهز من القوارير والثقافة ، وتعلق بسهولة الضامة في المتوسط ​​الثقافة. ونقل لاحقا في حضانة قصيرة نتيجة الصحون البلاستيكية في التصاق الانتقائي للالضامة (الشكل 3) ، حيث تظل معلقة وغيرها من الخلايا الملوثة. يشطف بعد عدة مع برنامج تلفزيوني ، ويتم حصاد الضامة المرفقة. يمكن حصاده أكثر من 10 6 خلايا مرارا وتكرارا من نفس الأنسجة T75 قارورة الثقافة اليوم على فترات 2-3 لأكثر من أسبوعين (الشكل 3). درجات نقاء من الضامة معزولة كان 95 الى 99 ٪ ، وتقييمها من قبل التدفق الخلوي أو كيمياء سيتولوجية مناعية مع الاجسام المضادة المحددة بلعم الفئران (الشكل 4). خلايا معزولة تظهر البلعمة نشطة من الخرز polystylene (الشكل 5) ، والاستجابة لالتكاثري المؤتلف GM - CSF ، إفراز التهاب / مضادة للالتهاب السيتوكينات على التحفيز مع LPS ، وتشكيل عملاق الخلايا multinucleated 9. في الختام ، ونحن نقدم طريقة بسيطة وفعالة للحصول على الضامة الكبد في عدد كاف والنقاء بدون معدات معقدة وskills.This طريقة يمكن تطبيقها على الأنواع الأخرى من الثدييات.

Watch this Scientific Journal Video about A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells at JoVE.com

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

تم وصف أسلوب الرواية للحصول على الضامة من الثقافة الأساسية للخلايا كبد الفئران. هذا الأسلوب يستخدم انتشار الضامة في الثقافة ، تليها اهتزاز قوارير الثقافة وتنقية عن طريق الحجز الانتقائي لأطباق بلاستيكية. هذا الأسلوب يوفر كفاءة الضامة الكبد بدون معدات معقدة والمهارات.

وهناك طريقة بسيطة وفعالة لعزل تقوم البلاعم من الثقافات الابتدائية المختلطة من خلايا الكبد الكبار

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

a-simple-efficient-method-to-isolate-macrophages-from-mixed-primary

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

37.9K Views.  National Institute of Agrobiological Sciences, Tsukuba, Japan. تم وصف أسلوب الرواية للحصول على الضامة من الثقافة الأساسية للخلايا كبد الفئران. هذا الأسلوب يستخدم انتشار الضامة في الثقافة ، تليها اهتزاز قوارير الثقافة وتنقية عن طريق الحجز الانتقائي لأطباق بلاستيكية. هذا الأسلوب يوفر كفاءة الضامة الكبد بدون معدات معقدة وال?...

Video: A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates epithelial differentiation. There are many uses for this system. For instance, the ability to grow three-dimensional organotypic raft cultures of keratinocytes has been an important milestone in the study of human papillomavirus (HPV)1. The life cycle of HPV is tightly linked to the differentiation of squamous epithelium2. Organotypic epithelial raft cultures as demonstrated here reproduce the entire papillomavirus life cycle, including virus production3,4,5. In addition, these raft cultures exhibit dysplastic lesions similar to those observed upon in vivo infection with HPV. Hence this system can also be used to study epithelial cell cancers, as well as the effect of drugs on epithelial cell differentiation in general. Originally developed by Asselineau and Prunieras6 and modified by Kopan et al.7, the organotypic epithelial raft culture system has matured into a general, relatively easy culture model, which involves the growth of cells on collagen plugs maintained at an air-liquid interface (Figure 1A). Over the course of 10-14 days, the cells stratify and differentiate, forming a full thickness epithelium that produces differentiation-specific cytokeratins. Harvested rafts can be examined histologically, as well as by standard molecular and biochemical techniques. In this article, we describe a method for the generation of raft cultures from primary human keratinocytes. The same technique can be used with established epithelial cell lines, and can easily be adapted for use with epithelial tissue from normal or diseased biopsies8. Many viruses target either the cutaneous or mucosal epithelium as part of their replicative life cycle. Over the past several years, the feasibility of using organotypic raft cultures as a method of studying virus-host cell interactions has been shown for several herpesviruses, as well as adenoviruses, parvoviruses, and poxviruses9. Organotypic raft cultures can thus be adapted to examine viral pathogenesis, and are the only means to test novel antiviral agents for those viruses that are not cultivable in permanent cell lines.

An in vitro method to mimic in vivo epithelial differentiation is described. Many viruses target epithelial cells as part of their viral life cycle, and this method provides a means of examining virus:host interactions that more closely resembles that which occurs in vivo. This technique can be used with primary keratinocytes, established cell lines, as well as normal or diseased biopsy tissue.

جيل من الثقافات الطوافة عضوي النمط من الخلايا الكيراتينية الإنسان الأساسية

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates ...

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

Microglia account for approximately 12% of the total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered the major cell types of the nervous system, microglia play a significant role in normal brain physiology by monitoring tissue for debris and pathogens and maintaining homeostasis in the parenchyma via phagocytic activity 1,2. Microglia are activated during a number of injury and disease conditions, including neurodegenerative disease, traumatic brain injury, and nervous system infection 3. Under these activating conditions, microglia increase their phagocytic activity, undergo morpohological and proliferative change, and actively secrete reactive oxygen and nitrogen species, pro-inflammatory chemokines and cytokines, often activating a paracrine or autocrine loop 4-6. As these microglial responses contribute to disease pathogenesis in neurological conditions, research focused on microglia is warranted.
	Due to the cellular heterogeneity of the brain, it is technically difficult to obtain sufficient microglial sample material with high purity during in vivo experiments. Current research on the neuroprotective and neurotoxic functions of microglia require a routine technical method to consistently generate pure and healthy microglia with sufficient yield for study. We present, in text and video, a protocol to isolate pure primary microglia from mixed glia cultures for a variety of downstream applications. Briefly, this technique utilizes dissociated brain tissue from neonatal rat pups to produce mixed glial cell cultures. After the mixed glial cultures reach confluency, primary microglia are mechanically isolated from the culture by a brief duration of shaking. The microglia are then plated at high purity for experimental study.
	The principle and protocol of this methodology have been described in the literature 7,8. Additionally, alternate methodologies to isolate primary microglia are well described 9-12. Homogenized brain tissue may be separated by density gradient centrifugation to yield primary microglia 12. However, the centrifugation is of moderate length (45 min) and may cause cellular damage and activation, as well as, cause enriched microglia and other cellular populations. Another protocol has been utilized to isolate primary microglia in a variety of organisms by prolonged (16 hr) shaking while in culture 9-11. After shaking, the media supernatant is centrifuged to isolate microglia. This longer two-step isolation method may also perturb microglial function and activation. We chiefly utilize the following microglia isolation protocol in our laboratory for a number of reasons: (1) primary microglia simulate in vivo biology more faithfully than immortalized rodent microglia cell lines, (2) nominal mechanical disruption minimizes potential cellular dysfunction or activation, and (3) sufficient yield can be obtained without passage of the mixed glial cell cultures.
	It is important to note that this protocol uses brain tissue from neonatal rat pups to isolate microglia and that using older rats to isolate microglia can significantly impact the yield, activation status, and functional properties of isolated microglia. There is evidence that aging is linked with microglia dysfunction, increased neuroinflammation and neurodegenerative pathologies, so previous studies have used ex vivo adult microglia to better understand the role of microglia in neurodegenerative diseases where aging is important parameter. However, ex vivo microglia cannot be kept in culture for prolonged periods of time. Therefore, while this protocol extends the life of primary microglia in culture, it should be noted that the microglia behave differently from adult microglia and in vitro studies should be carefully considered when translated to an in vivo setting.

Isolating primary microglia from the cellular heterogeneity of the brain is essential to investigate their role in both physiological and pathological conditions. This protocol describes a mechanical isolation and mixed cell culture technique that provides high yield and high purity, viable primary microglial cells for in vitro study and downstream applications.

عزل الخلايا الدبقية الصغيرة الابتدائية المختلطة من زراعات الخلايا الغروية من المواليد الجدد الجرذ أنسجة المخ

Microglia account for approximately 12% of the  total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered  the major ...

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

Neutrophils are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first to appear at sites of inflammation and infection, thus becoming the first line of defense against invading microorganisms. Neutrophils possess important antimicrobial functions such as phagocytosis, release of lytic enzymes, and production of reactive oxygen species. In addition to these important defense functions, neutrophils perform other tasks in response to infection such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. Cytokines recruit other leukocytes that help clear the infection, and inhibition of apoptosis allows the neutrophil to live longer at the site of infection. These functions are regulated at the level of transcription. However, because neutrophils are short-lived cells, the study of transcriptionally regulated responses in these cells cannot be performed with conventional reporter gene methods since there are no efficient techniques for neutrophil transfection. Here, we present a simple and efficient method that allows detection and quantification of nuclear factors in isolated and immunolabeled nuclei by flow cytometry. We describe techniques to isolate pure neutrophils from human peripheral blood, stimulate these cells with anti-receptor antibodies, isolate and immunolabel nuclei, and analyze nuclei by flow cytometry. The method has been successfully used to detect NF-&kappa;B and Elk-1 nuclear factors in nuclei from neutrophils and other cell types. Thus, this method represents an option for analyzing activation of transcription factors in isolated nuclei from a variety of cell types.

Neutrophils are the most abundant leukocytes in blood. Neutrophils possess transcriptionally regulated functions such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. These functions can be studied with the method presented here, which allows detection and quantification of nuclear factors by flow cytometry in isolated nuclei

طريقة بسيطة وفعالة لكشف النووية في تفعيل عامل العدلات الإنسان من قياس التدفق الخلوي

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. Transfection with siRNA and plasmid DNA is an efficient tool for studying their function, but transfection of macrophages is not a trivial matter. Although many different approaches for transfection of eukaryotic cells are available, only few allow reliable and efficient transfection of macrophages, but reduced cell vitality and severely altered cell behavior like diminished capability for differentiation or polarization are frequently observed. Therefore a transfection protocol is required that is capable of transferring siRNA and plasmid DNA into macrophages without causing serious side-effects thus allowing the investigation of the effect of the siRNA or plasmid in the context of normal cell behavior. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently transfecting human THP-1 macrophages and monocytes with high cell vitality, high transfection efficiency, and minimal effects on cell behavior. This approach is based on Nucleofection and the protocol has been optimized to maintain maximum capability for cell activation after transfection. The protocol is adequate for adherent cells after detachment as well as cells in suspension, and can be used for small to medium sample numbers. Thus, the method presented is useful for investigating gene regulatory effects during macrophage differentiation and polarization. Apart from presenting results characterizing macrophages transfected according to this protocol in comparison to an alternative chemical method, the impact of cell culture medium selection after transfection on cell behavior is also discussed. The presented data indicate the importance of validating the selection for different experimental settings.

This protocol presents an efficient and reliable method to transfect human THP-1 macrophages with siRNA or plasmid DNA by electroporation with high transfection efficiency while maintaining high cell vitality and full macrophage capacity for differentiation and polarization.

ترنسفكأيشن كفاءة عالية من الإنسان THP-1 الضامة بواسطة Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

على طريقة العائد فعالة وعالية لعزل مجموعات فرعية خلية الفأر الجذعية

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

مقاربة بسيطة وفعالة لبناء ناقلات الفيروسات المسخ الوقس

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. However, they are difficult to isolate in sufficient numbers to study them in detail, therefore, in vitro models have been developed. In vitro cultures of bone marrow-derived macrophages and dendritic cells are well-established and valuable methods for immunological studies. Here, a method for culturing and identifying both DCs and macrophages from a single culture of primary mouse bone marrow cells using the cytokine granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) is described. This protocol is based on the established procedure first developed by Lutz et al. in 1999 for bone marrow-derived DCs. The culture is heterogeneous, and MHCII and fluoresceinated hyaluronan (FL-HA) are used to distinguish macrophages from immature and mature DCs. These GM-CSF derived macrophages provide a convenient source of in vitro derived macrophages that closely resemble alveolar macrophages in both phenotype and function.

Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.

جيل وتحديد GM-CSF المشتقة مثل السنخية الضامة والخلايا الجذعية من الفأر نخاع العظم

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the uremic milieu, oxidative stress, endotoxemia and the decreased clearance of circulating proinflammatory cytokines by producing a large number of acute-phase reactants. Experimental tools to study inflammation and the underlying role of hepatocytes are crucial to understand the regulation and contribution of hepatic cytokines to a systemic acute phase response and a prolonged pro-inflammatory scenario, especially in an intricate setting such as chronic kidney disease. Since studying complex mechanisms of inflammation in vivo remains challenging, resource-intensive and usually requires the usage of transgenic animals, primary isolated hepatocytes provide a robust tool to gain mechanistic insights into the hepatic acute-phase response. Since this in vitro technique features moderate costs, high reproducibility and common technical knowledge, primary isolated hepatocytes can also be easily used as a screening approach. Here, we describe an enzymatic-based method to isolate primary murine hepatocytes, and we describe the assessment of an inflammatory response in these cells using ELISA and quantitative real-time PCR.

Here, we show an enzymatic approach to isolate primary hepatocytes from adult mice, and we describe the quantification of an inflammatory response using ELISA and real-time PCR.

تحريض استجابة التهابية في الثقافات الابتدائية الكبدية من الفئران

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is that they may induce traumatic lesions on the surface of the eye, which can progress to scarring, eyelid deformity, limbal stem cell deficiency and in some cases, cause great discomfort to the subject. To avoid these clinical problems, impression cytology (IC) was developed to diagnose dry eye disease and later neoplasia, atopic disease, vernal keratoconjunctivitis and keratoconjunctivitis sicca. Typically, clinicians manually cut filter papers into required shapes and apply these to the ocular surface. Here, we describe how to perform IC using a commercially available medical device. This technique is explained here followed by immunophenotyping by flow cytometry. This technique requires less manual handling and causes less injury to the ocular surface.

The exposed normal ocular surface consists of cornea and conjunctiva. Epithelial cells, goblet cells and immune cells are present in the conjunctiva. Here, a non-invasive, technique of impression cytology is described using an impression cytology device and flow cytometry to analyze immune cells in the conjunctiva.

وهناك طريقة غير الغازية لعزل والنمط الظاهري الخلايا من الملتحمة

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed feeder cells, purified NK or T cells with as much as 10 mL of blood, or a high-dose of IL-2. This study presents a new method with a powerful and simple strategy to establish NK and T cell lines by culturing the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) with the addition of recombinant human IL-2 (rhIL-2), and uses as little as 2 mL of whole blood. The cells can proliferate quickly in two weeks and be maintained for more than 3 months. With this method, 7 NK or T cell lines have been established with a high success rate. This method is simple, reliable, and applicable to establishing cell lines from more cases of CAEBV or NK/T cell lymphoma.

A simple method for obtaining NK and T cell clones from CAEBV patients was developed with high efficiency, a small amount of peripheral blood, and a low-dose of IL-2.

طريقة فعالة وبسيطة وضع ناغورني كاراباخ وخطوط الخلايا T من المرضى المصابين بالعدوى المزمنة النشطة فيروس ابشتاين-بار

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...