فإن الكتاب أود أن أشكر السيدة مايكه Schaffrinski لها المساعدة التقنية ممتازة دائما خلال السنوات القليلة الماضية. وقد تم تمويل هذا العمل من خلال مجلس البحوث الألمانية (DFG) ضمن مجموعة البحوث المشتركة 942 (FOR942) وبرنامج البحوث في كلية الطب، جورج-أغسطس جامعة غوتنغن.

1. إعداد العقيمة المصل AB الإنسان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع 4-5 أكياس من البلازما الطازجة المجمدة (FFP). مخزن الحقائب في -20 درجة مئوية حتى تم جمع ما يكفي من الحقائب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد الحقائب واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 56 درجة مئوية في حمام مائي لتعطيل مكملا وإزالة الفيبرين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطهير بدقة خارج الحقائب ونقل البلازما إلى 50 مل أنابيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للتخلص من الرواسب والصفائح الدموية المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع كل supernatants وتجاهل الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات مصل قسامة في 15 مل الأنابيب وتخزينها في -20 درجة مئوية. ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن استخدام المتاحة تجاريا الحرارة المعطل AB المصل البشري العادي. </li></ol> 2. عزل حيدات لتسهيل موازنة من أجهزة الطرد المركزي، فمن المستحسن لمعالجة اثنين من المعاطف الشهباء بشكل متواز. ومع ذلك، واتخاذ كاليفورنياإعادة استخدام مواد منفصلة لكل المانحة وعدم خلط الخلايا. في حالة لا يمكن الحصول عليها بسهولة المعاطف الشهباء، 400 مل من الدم المحيطي heparinized يمكن أن تستخدم بدلا من ذلك. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطهير بعناية الأكياس البلاستيكية التي تحتوي على المعاطف الشهباء ونقل محتويات كل معطف الشهباء لمدة 50 مل أنابيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل معطف الشهباء ملء ثلاثة أنابيب مع 50 مل 15 مل Ficoll الحل (1.077 جم / مل). وFicoll يجب أن يكون في درجة حرارة الغرفة لإعداد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طبقة 30-35 مل من الدم معطف الشهباء على أعلى من حل Ficoll لأول التدرج الكثافة. كن حذرا للقيام بذلك ببطء وبعناية من أجل منع خلط كل من طبقات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج بدون فرامل لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل التدرج جمع حلقة بيضاء من الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى (PBMCs) الذي يقع بين المرحلتين مع ماصة باستير البلاستيك ونقل إلى أنبوب 50 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء كل أنبوب مع PBS-EDTA (1 ملم) يصل إلى 40 مل في المجموع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة دون فرامل في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف ويغسل بيليه مرة أخرى مع 40 مل PBS-EDTA (1 ملم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل تجمع المانحة الكريات في 20 مل RPMI-1640 دون الفينول الحمراء + 10٪ FCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل Percoll-ISO الاسموزي للكثافة التدرج الثاني: للحصول على مزيج اثنين من المانحين 23.13 مل Percoll الحل (الكثافة: 1.131 جم / مل) في أنبوب 50 مل مع 1.87 مل 10 أضعاف PBS. ثم نقل 23 مل من هذا المحلول إلى أنبوب جديد 50 مل و 27 مل إضافة RPMI-1640 مع الفينول الحمراء + 10٪ FCS للحصول على 46٪ ايزو الاسموزي Percoll الحل. وPercoll يجب أن يكون في درجة حرارة الغرفة لإعداد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل المانحة نقل 25 مل من محلول Percoll استعداد لأنبوب 50 مل وطبقة الحل PBMC أعد 2.9) على رأس من الحل Percoll. كن حذرا للقيام بذلك ببطء شديد ود بعناية، كل من طبقات تميل إلى خلط بسهولة. إذا فعلت بشكل صحيح المرحلتين يمكن تمييز بسبب اختلاف في اللون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 550 x ج بدون فرامل لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل التدرج جمع حلقة بيضاء من حيدات الذي يقع بين المرحلتين مع ماصة باستير البلاستيك ونقل إلى أنبوب 50 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء كل أنبوب مع PBS-EDTA (1 ملم) إلى 50 مل في المجموع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة دون فرامل في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف و resuspend الكريات في 20 مل RPMI-1640 مع الفينول الحمراء + 10٪ FCS. </li></ol> 3. تمايز حيدات الضامة ل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد عدد حيدات معزولة في التخفيف 01:10 في التريبان الأزرق. عد فقط، خلايا كبيرة في كثير من الأحيان غير منتظمة الشكل، والتي هي وحيدات. لا تعول على خلايا مستديرة على شكل أصغر والتي هي الخلايا الليمفاوية. NOTE: أرقام الوحيدات لا يجب أن يتم تحديدها بدقة جدا لأنها تعطي تلميحا فقط حول كيفية العديد والتي المغلفة تفلون-FEP حقائب (صغيرة أو كبيرة) لا بد من استخدامها للتمايز الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ل1.0-1.5 × 10 8 حيدات من أحد المانحين، البذور الخلايا في FEP كبيرة تفلون المغلفة كيس ثقافة الخلية. لكل حقيبة إعداد مستنبت يتكون من 174 مل RPMI-1640، 2٪ مصل AB البشري (كما أعدت في القسم 1)، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين، و 2.5 نانوغرام / مل M-CSF (الحجم الإجمالي: 180 مل). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ل3.0-5.0 × 10 7 حيدات من أحد المانحين، البذور الخلايا في حقيبة صغيرة زراعة الخلايا المغلفة تفلون. لكل حقيبة إعداد مستنبت تتكون من 28.5 مل RPMI-1640، 2٪ مصل AB البشري (كما أعدت في القسم 1)، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين، و 2.5 نانوغرام / مل M-CSF (الحجم الإجمالي: 30 مل). ملاحظة: إذا كان على سبيل المثال، يتم الحصول على 8.0 × 10 7 حيدات، ونحن نوصي على البذور منها في TWس أكياس حجم أصغر مع 4.0 × 10 7 خلايا لكل منهما. بدلا من M-CSF، وحيدات يمكن بدلا من ذلك أن تكون متباينة مع محببة بلعم عامل تحفيز مستعمرة (GM-CSF) في نفس التركيز (2.5 نانوغرام / مل). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة تعليق خلية (20 مل) إلى متوسطة استعداد وتخلط بعناية. إذا تم إعداد كيسين من أحد المانحين، إضافة 20 مل RPMI-1640 لتعليق الخلية ثم قم بإضافة نصف لتعليق لكل إعداد المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياري: لتحديد ما إذا كان قد بقي إعداد الوحيدات عقيمة، المسيل للدموع قطرة واحدة من تعليق الخلية على طبق أجار الدم واحتضان أكثر من ليلة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشديد غمد من 50 مل حقنة perfusor على المكونات من محطة إثراء الوقود تفلون المغلفة كيس زراعة الخلايا وملء مع تعليق خلية استعداد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> افصل حقنة ودفع الهواء المتبقية للخروج من الحقيبة. إغلاق كيس مع مخروط الختام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الحقائب لمدة 6-7 أيام في 3776، C مع 5٪ CO 2. </li></ol> 4. بلعم الحصاد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أكياس زراعة الخلايا FEP تفلون المغلفة مع الضامة متباينة على الجليد لمدة 1 ساعة على الأقل لتسهيل مفرزة من الخلايا (على حضانة تصل إلى 3 ساعة هو ممكن). تأكد من أن السطح كله من كيس مغطى بالثلج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب الحقيبة مع الحد الأدنى من ضغط 10X على حافة مكتب / المجلس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطهير بعناية خارج الحقيبة وإزالة مخروط الختام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشديد حقنة 50 مل على المكونات من الحقيبة، وإزالة تعليق الخلية، وتحويلها إلى 50 مل أنابيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتدور باستمرار الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف وحشد من الكريات في كيس واحد 10 مل RPMI-1640 + 10٪ FCS في المجموع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد عدد الخلايا في عدادة الكريات (1: 4-1: 10 التخفيف باللون الأزرق التريبان). الاعتماد فقط الخلايا الجولة الكبيرة. ملاحظة: بعد التفريق الضامة في أكياس FEP تفلون المغلفة، يمكن أن يكون هناك خلايا المتبقية على سبيل المثال، الخلايا الليمفاوية، اعتمادا على الجهات المانحة وعلى نوعية من العزلة الوحيدات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة استخدام أكياس FEP تفلون المغلفة، غسلها مرتين مع 70٪ من الإيثانول لإزالة الخلايا المتبقية. ملئها 50 مل 70٪ من الإيثانول واحتضان بين عشية وضحاها. غسل أكياس 3X مع برنامج تلفزيوني العقيمة، والانتهاء منها في ورقة التعقيم، وتعقيم في الأوتوكلاف باستخدام إجراءات القياسية. ملاحظة: أكياس زراعة الخلايا يمكن إعادة استخدامها عدة مرات دون أي خسارة في عائدات البلاعم. ومع ذلك، قررنا التخلص من أكياس بعد 10 يستخدم قبل أن تبدأ في تسرب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاحقة الضامة الثقافة التجارب في RPMI-1640 + 10٪ FCS. إذا كانت هناك حاجة تركيزات مصل أقل، زراعة في RPMI-1640 مع 1٪ FCS هو ممكن أيضا. البذور والخلايا احتضان لمدة 3-4 ساعة. بعد هذه الفترة، علما بأن الضامة نعلق على سطح خلية ثقافة طبق حينأي تلويث الخلايا (أي الكريات الحمراء، الخلايا الليمفاوية، والخلايا الجذعية) البقاء في تعليق. غسل الخلايا مرتين على الأقل مع PBS لإزالة الخلايا غير ملتصقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفصل مثقف الضامة من الطبق ثقافة الخلية لمزيد من التجارب، وتتخلص منها بعناية من السطح. بدلا من ذلك، واحتضان الأطباق لمدة 20 دقيقة على الجليد، ونضح مستنبت، وإضافة 1 مل خالية من انزيم تفارق العازلة الخلية. بعد 5 دقائق الحضانة عند 37 درجة مئوية، إضافة 4 مل PBS، وفصل الخلايا عن طريق pipetting صعودا وهبوطا لمدة 3 دقائق على الأقل. </li></ol>

<ol>
	<li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+biology+in+development,+homeostasis+and+disease.">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496, 445-455 (2013).</li><li>Iwasaki, A., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Adaptive+Immunity+by+the+Innate+Immune+System.">Regulation of Adaptive Immunity by the Innate Immune System.</a> Science. 327, 291-295 (2010).</li><li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+plasticity+and+polarization:+in+vivo+veritas.">Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> J Clin Invest. 122, 787-795 (2012).</li><li>Lionakis, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX(3)CR1-dependent+renal+macrophage+survival+promotes+Candida+control+and+host+survival.">CX(3)CR1-dependent renal macrophage survival promotes Candida control and host survival.</a> J Clin Invest. 123 (3), 5035-5051 (2013).</li><li>Blumenthal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wingless+homolog,+WNT5A+and+its+receptor+Frizzled-5+regulate+inflammatory+responses+of+human+mononuclear+cells+induced+by+microbial+stimulation.">The Wingless homolog, WNT5A and its receptor Frizzled-5 regulate inflammatory responses of human mononuclear cells induced by microbial stimulation.</a> Blood. 108, 965-973 (2006).</li><li>Lima, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammasome-derived+IL-1+beta+production+induces+nitric+oxide-mediated+resistance+to+Leishmania.">Inflammasome-derived IL-1 beta production induces nitric oxide-mediated resistance to Leishmania.</a> Nat Med. 19, 909-915 (2013).</li><li>Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-educated+macrophages+promote+tumour+progression+and+metastasis.">Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis.</a> Nat Rev Cancer. 4, 71-78 (2004).</li><li>Subramanian, V., Ferrante, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity,+inflammation,+and+macrophages.">Obesity, inflammation, and macrophages.</a> Nestle Nutrition workshop series. Paediatric programme. 63, 151-159 (2009).</li><li>Moore, K. J., Sheedy, F. J., Fisher, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+in+atherosclerosis:+a+dynamic+balance.">Macrophages in atherosclerosis: a dynamic balance.</a> Nat Rev Immunol. 13, 709-721 (2013).</li><li>Pradere, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+macrophages+but+not+dendritic+cells+contribute+to+liver+fibrosis+by+promoting+the+survival+of+activated+hepatic+stellate+cells+in+mice.">Hepatic macrophages but not dendritic cells contribute to liver fibrosis by promoting the survival of activated hepatic stellate cells in mice.</a> Hepatology. 58, 1461-1473 (2013).</li><li>Danciger, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+large+scale+isolation,+culture+and+cryopreservation+of+human+monocytes+suitable+for+chemotaxis,+cellular+adhesion+assays,+macrophage+and+dendritic+cell+differentiation.">Method for large scale isolation, culture and cryopreservation of human monocytes suitable for chemotaxis, cellular adhesion assays, macrophage and dendritic cell differentiation.</a> J Immunol Methods. 288, 123-134 (2004).</li><li>Reiling, N., Blumenthal, A., Flad, H. D., Ernst, M., Ehlers, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacteria-induced+TNF-alpha+and+IL-10+formation+by+human+macrophages+is+differentially+regulated+at+the+level+of+mitogen-activated+protein+kinase+activity.">Mycobacteria-induced TNF-alpha and IL-10 formation by human macrophages is differentially regulated at the level of mitogen-activated protein kinase activity.</a> J Immunol. 167, 3339-3345 (2001).</li><li>Andreesen, R., Picht, J., Lohr, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Cultures+of+Human+Blood-Borne+Macrophages+Grown+on+Hydrophobic+Teflon+Membranes.">Primary Cultures of Human Blood-Borne Macrophages Grown on Hydrophobic Teflon Membranes.</a> J Immunol Methods. 56, 295-304 (1983).</li><li>van der Meer, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+human+bone+marrow+in+the+teflon+culture+bag:+identification+of+the+human+monoblast.">Culture of human bone marrow in the teflon culture bag: identification of the human monoblast.</a> Journal of the Reticuloendothelial Society. 32, 355-369 (1982).</li><li>van der Meer, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+human+monocytes+cultured+in+the+Teflon+culture+bag.">Characteristics of human monocytes cultured in the Teflon culture bag.</a> Immunology. 47, 617-625 (1982).</li><li>Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+of+the+human+monocyte-to-macrophage+differentiation+and+polarization:+New+molecules+and+patterns+of+gene+expression.">Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression.</a> J Immunol. 177, 7303-7311 (2006).</li><li>Gordon, S., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+and+macrophage+heterogeneity.">Monocyte and macrophage heterogeneity.</a> Nat Rev Immunol. 5, 953-964 (2005).</li><li>Hashimoto, S., Yamada, M., Motoyoshi, K., Akagawa, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+macrophage+colony-stimulating+factor-induced+growth+and+differentiation+of+human+monocytes+by+interleukin-10.">Enhancement of macrophage colony-stimulating factor-induced growth and differentiation of human monocytes by interleukin-10.</a> Blood. 89, 315-321 (1997).</li><li>Tushinski, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+Mononuclear+Phagocytes+Depends+on+a+Lineage-Specific+Growth-Factor+That+the+Differentiated+Cells+Selectively+Destroy.">Survival of Mononuclear Phagocytes Depends on a Lineage-Specific Growth-Factor That the Differentiated Cells Selectively Destroy.</a> Cell. 28, 71-81 (1982).</li><li>Rietkotter, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zoledronic+acid+inhibits+macrophage/microglia-assisted+breast+cancer+cell+invasion.">Zoledronic acid inhibits macrophage/microglia-assisted breast cancer cell invasion.</a> Oncotarget. 4, 1449-1460 (2013).</li><li>Pilling, D., Fan, T., Huang, D., Kaul, B., Gomer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Markers+that+Distinguish+Monocyte-Derived+Fibrocytes+from+Monocytes,+Macrophages,+and+Fibroblasts.">Identification of Markers that Distinguish Monocyte-Derived Fibrocytes from Monocytes, Macrophages, and Fibroblasts.</a> Plos One. 4, E7475 (2009).</li><li>Rey-Giraud, F., Hafner, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+monocyte-derived+macrophages+under+serum-free+conditions+improves+their+tumor+promoting+functions.">In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions.</a> Plos One. 7, e42656 (2012).</li><li>Waldo, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+human+macrophages+in+culture+and+in+atherosclerotic+plaques.">Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques.</a> Am J Pathol. 172, 1112-1126 (2008).</li><li>Chernykh, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+and+properties+of+human+M2-like+macrophages:+potential+candidates+for+CNS+repair?.">The generation and properties of human M2-like macrophages: potential candidates for CNS repair?.</a> Cell Ther Transplant. 2, (2010).</li><li>Verreck, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+IL-23-producing+type+1+macrophages+promote+but+IL-10-producing+type+2+macrophages+subvert+immunity+to+(myco)bacteria.">Human IL-23-producing type 1 macrophages promote but IL-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4560-4565 (2004).</li><li>Pukrop, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+5a+signaling+is+critical+for+macrophage-induced+invasion+of+breast+cancer+cell+lines.">Wnt 5a signaling is critical for macrophage-induced invasion of breast cancer cell lines.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 5454-5459 (2006).</li><li>Hagemann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+induce+invasiveness+of+epithelial+cancer+cells+via+NF-kappa+B+and+JNK.">Macrophages induce invasiveness of epithelial cancer cells via NF-kappa B and JNK.</a> J Immunol. 175, 1197-1205 (2005).</li><li>Pereira, C., Schaer, D. J., Bachli, E. B., Kurrer, M. O., Schoedon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt5A/CaMKII+signaling+contributes+to+the+inflammatory+response+of+macrophages+and+is+a+target+for+the+antiinflammatory+action+of+activated+protein+C+and+interleukin-10.">Wnt5A/CaMKII signaling contributes to the inflammatory response of macrophages and is a target for the antiinflammatory action of activated protein C and interleukin-10.</a> Arterioscl Throm Vas. 28, 504-510 (2008).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما تكشف عن وجود أي تضارب في المصالح.

الضامة هي خلايا المستجيب الهامة من نظام المناعة الفطري وعرض وظائف مهمة في تعديل مناعي، عرض المستضد وتوازن الأنسجة. بسبب اللدونة لها ملحوظة، فهي قادرة على الاستجابة للمؤثرات مختلفة مع التغيرات في النمط الظاهري بهم. ومع ذلك، يتم الحصول حتى الآن الكثير من البيانات المتعلقة بلعم الاستقطاب في النظام الفئران، وإن كانت هناك تقارير تبين أن حوالي 50٪ فقط من علامات الاستقطاب البلاعم يمكن ترجمتها مباشرة من الفأر إلى الإنسان 16. لذا، نقدم هنا طريقة للحصول على الضامة الإنسان الأولية في عدد ونقاء كافية دون الحاجة إلى المواد باهظة الثمن، على سبيل المثال، MACS حبات مغناطيسية أو معاكس جهاز تصويل الطرد المركزي. ويستند أسلوبنا على عزل حيدات من PBMCs والتمايز لاحقا إلى الضامة في محطة إثراء الوقود أكياس زراعة الخلايا تفلون المغلفة في حضور منخفضة بغية دراسته واقرارهntrations من M-CSF 11-13. بينما حيدات تشكل أقل من 5 إلى 10٪ من الكريات البيض الدموية المحيطية في البشر، على التحفيز وتجنيدهم إلى مواقع هامشية حيث التفريق الأنسجة الضامة إلى المقيمين أو الخلايا الجذعية 17. خلوى M-CSF مهم لبقاء الوحيدات ويقود التمايز لالضامة 18،19. حتى الآن، وتراوحت تركيزات M-CSF التي تم اختيارها لالوحيدات التمايز تصل إلى 100 ​​نانوغرام / مل، ولكن في بروتوكول لدينا ونحن قادرون على الحصول على أعداد كافية من الضامة ناضجة مع تركيز M-CSF فقط 2.5 نانوغرام / مل 12 20. بالإضافة إلى ذلك، الخلايا المستزرعة في محطة إثراء الوقود تفلون المغلفة أكياس ثقافة الخلية التي تسهل من عملية فصل الضامة والبذر في وقت لاحق في أعداد الخلايا المحددة. منذ أكياس يمكن إعادة استخدامها عدة مرات، وهذا يقلل كذلك تكاليف عملية العزلة. الضامة التي حصل عليها هذا الإجراءهي ايجابية للغاية لCD45، CD14، CD11b، وإظهار CD11c والتعبير عن مستقبلات المانوز CD206 التي تقول لسكان نقية، الضامة ناضجة 21،22. خاصة ارتفاع التعبير CD14 هو الحال بالنسبة للالضامة متباينة في وجود M-CSF 23. بعد زرع الخلايا، لأنها تكشف التقيد سريع على الأسطح البلاستيكية مع بعض الخلايا تظهر مثل مغزل مورفولوجيا نموذجية، والبعض الآخر يحمل النمط الظاهري البيض المقلي. هذا هو وفقا لملاحظات من مؤلفين آخرين 18،22،24. أفيد بأن التمايز الوحيدات في حضور M-CSF يؤدي إلى الاستقطاب-M2 الضامة 16،25. ومع ذلك، فإن الضامة معزولة بسبب بروتوكول لدينا ما زالت قادرة على الاستجابة لمجموعة واسعة من المحفزات بما في ذلك التعرض لورم microvesicles المشتقة من خلية وثقافة مشتركة مع الخلايا السرطانية 26،27 أو التعرض لLPS التي تتفاعل مع تحريض المؤيدة الجينات الالتهابية مثل IL-1 &amp;# 946؛، TNFα، Wnt5a، أو مختلف مصفوفة metalloproteinases التي تعتبر نموذجية لالضامة M1-الاستقطاب 3،5،28. في الختام، عزل مزدوج حيدات بواسطة الطرد المركزي كثافة التدرج والتمايز اللاحق نحو الضامة في محطة إثراء الوقود تفلون المغلفة زراعة الخلايا أكياس النتائج في أعداد كبيرة من الضامة دون الحاجة إلى إجراءات صعبة أو مكلفة من الناحية الفنية. ويمكن استخدام الضامة التي تم الحصول عليها لتحليلها لاحقا تتراوح بين الكلاسيكية من خلال تفعيل LPS إلى ثقافة التعاون مع الخلايا السرطانية.

خلايا من سلالته الوحيدات والتي متباينة عضال مشتق - الضامة - تبدي مرونة لافتة في الصدد إلى وظائفها البيولوجية، مما يؤدي إلى مشاركتهم في هذه العمليات متنوعة والتنمية، وإصلاح الأنسجة، والحصانة 1. ومن المقرر أن أكلة وقدرتها العارضة للمستضد الذي يضع الضامة في مفترق الطرق بين الاستجابة المناعية الفطرية والتكيفية (2) والأخير. ومع ذلك، قدرتها على إفراز السيتوكينات، كيموكينات، عوامل النمو، والجزيئات الأخرى 1 يشير ليس فقط وظيفة تقوي المناعة تغييري ولكن أيضا بمثابة أساس لوظائف إضافية لهم. محاولات لتعكس هذه الخطوات تفعيل المتنوعة في سياق غير الميكروبية-الظروف بوساطة أدت في الفئات M1 و M2 3. في حين أن هذا التصنيف ليست كاملة، لأنها تتيح فهم أساسي من البلاعم علم الأحياء. بسبب هذه القدرات المتعددة الأوجه أنه لم يكن مفاجئا أن الضامة ترتبط مع العديد من الظروف التي في بعض الطريق تنطوي على إعادة عرض الأنسجة أو التهاب. بجانب دور أساسي في الاعتراف والتخليص غزو مسببات الأمراض 4-6، الضامة قد يأتي على نحو متزايد إلى التركيز في تصلب الشرايين، والتليف، والسمنة، والسرطان 7-10. وهناك طريقة استنساخه لتوليد الضامة الإنسان هو بالتالي حاسما لفهم هذه الأمراض. نحن هنا نقدم وسيلة تقوم على عزل حيدات الإنسان من الدم المحيطي من المتبرعين الأصحاء بواسطة تقنية التدرج الكثافة الطرد المركزي مزدوجة كما هو موضح سابقا 11. من أجل تسهيل التمايز نحو الضامة، يتم تحضين الخلايا الوحيدات المعزولة في وجود تركيزات منخفضة من M-CSF والمصل البشري العادي 12. لتخفيف مزيد من التعامل وحصاد الخلايا، ويتم التفريق في محطة إثراء الوقود الغاز قابلة للاختراقأكياس زراعة الخلايا المغلفة تفلون مع سطح مسعور 12-15. الضامة يستريح الناتجة يمكن أن تخضع لمجموعة واسعة من فحوصات لأنها لا تزال قادرة على الاستجابة في إما M1 أو M2 مثل الموضة. طرق بديلة لعزل الوحيدات والتمايز اللاحق مثل المغناطيسية تنشيط الخلايا الفرز (MACS) أو معاكس تصويل الطرد المركزي (CCE) لديها بعض القيود فيما يتعلق العائد والتكلفة والوقت المطلوب. بروتوكول الموصوفة هنا يوفر ميزة أنه يمكن تنفيذها مع المعدات المختبرية القياسية دون الحاجة للمواد الخاصة (على سبيل المثال، أجهزة ماكينتوش حبات مغناطيسية) أو أجهزة (على سبيل المثال، جهاز CCE) ويسمح لتجهيز كميات كبيرة من الخلايا.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>antibodies for immunophenotyping</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>for example: CD11c-PE (IM1760), CD45-FITC (7782), IgG1-PE isotype control (A07796), IgG1-FITC isotype control (A07795)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>BioLegends</td>
			<td></td>
			<td>for example: CD14-FITC (325603), CD206-PE (321105)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 200M microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcein-AM</td>
			<td>AnaSpec</td>
			<td>89201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>combi-stopper closing cones</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4495101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS, w/o Ca and Mg</td>
			<td>Pan biotech</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td>for PBS-EDTA (1 mM) add 1 ml 0,5 M EDTA per 500ml PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS, w/o Ca and Mg</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14200-067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Titriplex III)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1084211000</td>
			<td>prepare a 0,5 M solution in H2O, use a sterile filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell dissociation buffer (enzyme-free, PBS-based)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>13151-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10091148</td>
			<td>heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll (density 1.077g/ml)</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>L6115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCanto II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse FITC</td>
			<td>santa cruz</td>
			<td>sc-2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS from E.coli</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8274</td>
			<td>final conc: 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multifuge 3 L-R</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>A2213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll (density 1,131g/ml)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusor syringe 50ml</td>
			<td>Braun</td>
			<td>8728844F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-TRITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td>resuspend in methanol (c = 0,1 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Disposable Pasteur Pipettes</td>
			<td>LVL technologies</td>
			<td>2655181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rh M-CSF</td>
			<td>ImmunoTools</td>
			<td>11343117</td>
			<td>Resuspend in 500&#181;l sterile H2O (c = 100 ng/&#181;l), aliquot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 with Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 without Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterilization paper</td>
			<td>VP group</td>
			<td>3KFKFS230116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue stain (0,4% w/v)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEP Teflon-coated cell culture bag, small</td>
			<td>CellGenix</td>
			<td>72-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEP Teflon-coated cell culture bag, large</td>
			<td>CellGenix</td>
			<td>197-C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of human monocytes by double gradient centrifugation and their differentiation to macrophages in teflon-coated cell culture bags

وتشارك الضامة الإنسان في عدد كبير من العمليات مرضية تتراوح من الأمراض المعدية إلى السرطان. وبالتالي فإنها تشكل أداة قيمة لفهم الآليات الكامنة وراء هذه الأمراض. لذا نقدم بروتوكول اضحة لعزل حيدات الإنسان من المعاطف الشهباء، يليها إجراء المفاضلة مما يؤدي إلى عوائد عالية البلاعم. وتعتمد هذه التقنية في الغالب على معدات المختبرات المتاحة عموما وبالتالي يوفر التكلفة والوقت فعالة طريقة للحصول على كميات كبيرة من الضامة الإنسان. باختصار، يتعرض المعاطف الشهباء من المتبرعين بالدم صحية إلى مضاعفة كثافة التدرج الطرد المركزي لحصاد حيدات من الدم المحيطي. هذه حيدات ثم يتم تربيتها في المفلورة الإثيلين البروبيلين (محطة إثراء الوقود) أكياس زراعة الخلايا المغلفة تفلون بحضور بلعم عامل تحفيز مستعمرة (M-CSF). الضامة متباينة يمكن حصادها بسهولة واستخدامها لدراسات لاحقة وظيفية ويقول. وسيتم تسليط الضوء طرق هامة لمراقبة الجودة والتحقق من العزلة والتمايز الخطوات ضمن البروتوكول. وباختصار، فإن بروتوكول الموصوفة هنا تمكن العلماء من عزل بشكل روتيني وبتكاثر الضامة الإنسان دون الحاجة إلى أدوات مكثفة التكلفة. وعلاوة على ذلك، ونماذج المرض يمكن دراستها في النظام البشري مسانج التحايل على استخدام الضامة الفئران.

أول الطرد المركزي التدرج الكثافة باستخدام Ficoll غلة البيني الأبيض تحتوي على PBMCs (الشكل 1A) أي اللمفاويات وحيدات. ويمكن التأكد من ذلك من خلال تلطيخ مايو Gruenwald (الأرقام 1B و C) من الخلايا التي تم جمعها مما يدل على حد سواء نواة / نسبة عالية السيتوبلازم (نموذجي من الخلايا الليمفاوية) وbean- أو نوى على شكل حلقة (نموذجي من وحيدات). عندما يتم بعد ذلك تحميل هذه الخلايا على التدرج الكثافة الثاني باستخدام Percoll، يمكن أن يكون أبعد حيدات فصلها عن الخلايا الليمفاوية ومرة أخرى تبدو وكأنها الطور البيني الأبيض (أرقام 1D-F). لكل الغلالة الشهباء وصفها كثافة مزدوجة التدرج الطرد المركزي ينتج عادة 150 ± 40 × 10 6 حيدات التي يمكن أن تكون متباينة إلى 70 ± 30 × 10 6 الضامة (الشكل 2) في معطف الشهباء. العائد بلعم يعني منوكانت الاستعدادات مستقلة 20 47 ± 14٪ من إجمالي حيدات معزولة. بعد التدرج Percoll الطرد المركزي قد يكون لا يزال هناك بعض الخلايا غير الوحيدات المتبقية الحالية في إعداد التي تعتمد على المتبرعين بالدم وكذلك على دقة عملية العزلة. ومع ذلك، بعد مرحلة التمايز من 6-7 أيام، وإعداد يتكون أساسا من الضامة الناضجة (الشكل 3) الذي يمكن تخصيبه أكثر بسبب تمسكهم الأسطح البلاستيكية، وهي الميزة التي لا يتم مشاركتها من قبل الخلايا تلويث العشوائي (أرقام 4A وB). مرة واحدة مطلية، فإن غالبية الضامة تظهر الكلاسيكية &quot;البيض المقلي&quot; مورفولوجيا في حين أن هناك أيضا الخلايا مع تمدد مثل مغزل النمط الظاهري (الشكلان 4C و D). وينعكس ذلك من خلال توزيع F-الأكتين في غضون السيتوبلازم والتصاق المجموعات. خلايا متباينةتتميز التعبير عن CD45، CD14، CD16، CD206 (مستقبلات المانوز)، وCD11b CD11c والتي هي علامات نموذجية لالضامة الناضجة (الشكل 5). وجود CD11b يجادل ضد التمييز في الغالب شجيري الذي يدعمه حقيقة أن الخلايا هي سلبية على شجيري CD209 علامة الخلية (DC-SIGN). بعد عملية التمايز تبقى الخلايا نشطة وظيفيا وعملية الأيض لحوالي 5-7 أيام (الشكل 6) كما يمكن تصور بواسطة calcein AM تلطيخ وقدرتها على تناول الحويصلات خارج الخلية من تسليط الخلايا السرطانية. بالإضافة إلى ذلك، لا يزال يتم تفعيل الخلايا كما هو مبين على سبيل المثال، من أجل التحفيز مع عديد السكاريد الشحمي (LPS) الذي ينتج التعبير عن عدة جينات الموالية للالتهابات (الشكل 7). <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in"SRC = &quot;/ الملفات / ftp_upload / 51554 / 51554fig1highres.jpg&quot; العرض = &quot;500&quot; /&gt; الرقم 1. المظهر وتكوين PBMC- والوحيدات طبقة مزدوجة الكثافة بعد التدرج الطرد المركزي. صورة توضح (A) والموجات PBMC بعد التدرج Ficoll و (D) للمرحلة الوحيدات بعد متسق الضغط التناضحي Percoll الطرد المركزي. stainings مايو Gruenwald الاستعدادات cytospin من (B، C) PBMC جزء والباقي (E، F) وحيدات. شريط النطاق = 200 ميكرومتر في B و E، = 50 ميكرون في C و F. <img alt="الشكل 2" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig2highres.jpg" width="300" /> الشكل 2. العائد من وحيدات الضامة. فرزان خلية التمثيلية للحيدات معزولة والضامة من 20 معطف الشهباء العلاقات العامةeparations. <img alt="الرقم 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig3highres.jpg" width="600" /> الرقم 3. الميكروسكوب وقياسات حجم خلية وحيدات الضامة. المجهر النقيض المرحلة من تعليق خلية الوحيدات قبل (A) وبعد (B) بلعم التمايز. المقابلة رسوم بيانية حجم الخلية من حيدات (C) والضامة (D). مقياس بار = 100 ميكرون. <img alt="الرقم 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig4highres.jpg" width="600" /> الرقم 4. الصرف وتنظيم هيكل الخلية الضامة ملتصقة. المجهر النقيض من المرحلة الضامة ملتصقة قبل (A) وبعد (B) إزالة غير adheren-<html> خلايا تي. (C، D) Phalloidin-TRITC تلطيخ أكتين الخيطية في ملتصقة الضامة، غير حفز. مقياس بار = 100 ميكرون في AC، 20 ميكرون في D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig4highres.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig5highres.jpg" width="500" /> الشكل 5. نمط ظاهري مناعي الضامة متباينة. التدفق الخلوي تحليل الضامة بعد 6 أيام من التمايز في محطة إثراء الوقود تفلون المغلفة أكياس زراعة الخلايا (المشار إليها باللون الأحمر). وتظهر الضوابط نمط إسوي المقابلة في الرمادي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig5highres.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> تكفي ل= &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الرقم 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig6highres.jpg" width="600" /> الرقم 6. امتصاص microvesicles الخلايا السرطانية بواسطة الضامة. الميكروسكوب الضامة ملتصقة بعد المعرض لPKH26 المسمى (أحمر فلوري) ورم microvesicles المستمدة من الخلية. ويغطى الصور إلى المقابلة (A) brightfield أو (B) تلطيخ عصاري خلوي مع بقاء الصبغة calcein AM. أشرطة النطاق = 100 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig6highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig7highres.jpg" width="500" /> الرقم 7. Upregulation من IL-1 β، Wnt5a، TNFα، IL-6، MMP-2، MMP-7، وMT1-MMP بعد stimuوقد تم قياس lation الضامة مع LPS (100 نانوغرام / مل) لمدة 24 ساعة. التعبير الجيني بواسطة RT-PCR الكمي من مجموع عينات الحمض النووي الريبي (A) وتطبيع على HPRT1 وGNB2L1 التعبير. القيم المعروضة هي التغييرات أضعاف بالمقارنة مع السيطرة غير المعالجة (يعني ± SD، ن = 5، * P &lt;0.05، ** P &lt;0.01، *** P &lt;0.001). وأكد TNFα و IL-6 تحريض تحت التحفيز LPS مزيد من ELISA (B) (يعني ± SD، * P &lt;0.05).

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags at JoVE.com

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

نقدم بروتوكول بسيطة وفعالة لتوليد الضامة الإنسان. تتم معالجة الشهباء المعاطف بالنقر المزدوج كثافة التدرج الطرد المركزي ومن ثم يتم التمييز حيدات معزولة لالضامة في أكياس زراعة الخلايا المغلفة تفلون. هذا يعظم عوائد البلاعم ويسهل الحصاد خلية لتجارب لاحقة.

عزل حيدات الإنسان من مزدوجة التدرج الطرد المركزي والتمايز لالضامة في تفلون المغلفة حقائب خلية ثقافة

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

isolation-human-monocytes-double-gradient-centrifugation-their

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

69.4K Views.  University Medical Center Göttingen.  نقدم بروتوكول بسيطة وفعالة لتوليد الضامة الإنسان. تتم معالجة الشهباء المعاطف بالنقر المزدوج كثافة التدرج الطرد المركزي ومن ثم يتم التمييز حيدات معزولة لالضامة في أكياس زراعة الخلايا المغلفة تفلون. هذا يعظم عوائد البلاعم ويسهل الحصاد خلي?...

Video: Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. Transfection with siRNA and plasmid DNA is an efficient tool for studying their function, but transfection of macrophages is not a trivial matter. Although many different approaches for transfection of eukaryotic cells are available, only few allow reliable and efficient transfection of macrophages, but reduced cell vitality and severely altered cell behavior like diminished capability for differentiation or polarization are frequently observed. Therefore a transfection protocol is required that is capable of transferring siRNA and plasmid DNA into macrophages without causing serious side-effects thus allowing the investigation of the effect of the siRNA or plasmid in the context of normal cell behavior. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently transfecting human THP-1 macrophages and monocytes with high cell vitality, high transfection efficiency, and minimal effects on cell behavior. This approach is based on Nucleofection and the protocol has been optimized to maintain maximum capability for cell activation after transfection. The protocol is adequate for adherent cells after detachment as well as cells in suspension, and can be used for small to medium sample numbers. Thus, the method presented is useful for investigating gene regulatory effects during macrophage differentiation and polarization. Apart from presenting results characterizing macrophages transfected according to this protocol in comparison to an alternative chemical method, the impact of cell culture medium selection after transfection on cell behavior is also discussed. The presented data indicate the importance of validating the selection for different experimental settings.

This protocol presents an efficient and reliable method to transfect human THP-1 macrophages with siRNA or plasmid DNA by electroporation with high transfection efficiency while maintaining high cell vitality and full macrophage capacity for differentiation and polarization.

ترنسفكأيشن كفاءة عالية من الإنسان THP-1 الضامة بواسطة Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

عزل وتحليل العدلة لتحديد ما دورها في الغدد اللمفاوية حساسية الخلية وكلاء العلاجية

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

في المختبر التفكيك من الأنفلونزا من الفيروسات Capsids بواسطة الطرد المركزي التدرج

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

ثقافة الضامة الوحيدات المستمدة-بلعم مستعمرة تحفيز عامل متباينة الإنسان

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases. 
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays. 
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Here, we describe the purification of Legionella pneumophila (L. pneumophila) outer membrane vesicles (OMVs) from liquid cultures. These purified vesicles are then used for the treatment of macrophages to analyze their pro-inflammatory potential.

البكتيريا المستروحة الخارجي غشاء الحويصلات: عزل وتحليل إمكاناتهم الموالية للالتهابات في الضامة

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research investigating immunological responses against A. fumigatus has been limited by the lack of consistent and reliable assays for measuring the antifungal activity of specific immune cells in vitro. A new method is described to assess the antifungal activity of primary monocytes and neutrophils from human donors against A. fumigatus using FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE) conidia. These conidia contain a genetically encoded dsRed reporter, which is constitutively expressed by live FLARE conidia, and are externally labeled with Alexa Fluor 633, which is resistant to degradation within the phagolysosome, thus allowing a distinction between live and dead A. fumigatus conidia. Video microscopy and flow cytometry are subsequently used to visualize the interaction between conidia and innate immune cells, assessing fungicidal activity whilst also providing a wealth of information on phagocyte migration, phagocytosis and the inhibition of fungal growth. This novel technique has already provided exciting new insights into the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus. It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.
It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Here, we describe a protocol to assess antifungal activity of primary human immune cells in real-time using fluorescent Aspergillus reporter conidia in conjunction with live-cell video microscopy and flow cytometry. Generated data provide insight into host cell-Aspergillus interactions such as fungicidal activity, phagocytosis, cell migration and inhibition of fungal growth.

التصوير المباشر لآخر مضاد من قبل العدلات الإنسان الأساسية وحيدات في الاستجابة لل<em&gt; A. فوميجاتوس</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

عزل السالمونيلا تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس من الضامة

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

العزلة والثقافة في المختبر من البلاعم السنخية مورين والبشرية

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Induced Differentiation of M Cell-like Cells in Human Stem Cell-derived Ileal Enteroid Monolayers

M (microfold) cells of the intestine function to transport antigen from the apical lumen to the underlying Peyer&#8217;s patches and lamina propria where immune cells reside and therefore contribute to mucosal immunity in the intestine. A complete understanding of how M cells differentiate in the intestine as well as the molecular mechanisms of antigen uptake by M cells is lacking. This is because M cells are a rare population of cells in the intestine and because in vitro models for M cells are not robust. The discovery of a self-renewing stem cell culture system of the intestine, termed enteroids, has provided new possibilities for culturing M cells. Enteroids are advantageous over standard cultured cell lines because they can be differentiated into several major cell types found in the intestine, including goblet cells, Paneth cells, enteroendocrine cells and enterocytes. The cytokine RANKL is essential in M cell development, and addition of RANKL and TNF-&#945; to culture media promotes a subset of cells from ileal enteroids to differentiate into M cells. The following protocol describes a method for the differentiation of M cells in a transwell epithelial polarized monolayer system of the intestine using human ileal enteroids. This method can be applied to the study of M cell development and function.

This protocol describes how to induce the differentiation of M cells in human stem cell-derived ileal monolayers and methods to assess their development.

التمايز المستحث للخلايا الشبيهة بالخلايا M في الطبقات الأحادية المعوية اللفائفية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية

M (microfold) cells of the intestine function to transport antigen from the apical lumen to the underlying Peyer&#8217;s patches and lamina propria where ...

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. While antiretroviral therapy efficiently lowers systemic viral load and restores normal CD4+ T cell counts, it does not reconstitute a completely functional immune system. A dysfunctional immune system in HIV-infected individuals undergoing cART may be characterized by immune activation, early aging of immune cells, or persistent inflammation. These conditions, along with comorbid factors associated with HIV infection, add complexity to the disease, which cannot be easily reproduced in cellular and animal models. To investigate the molecular events underlying immune dysfunction in these patients, a system to culture and manipulate human primary monocytes in vitro is presented here. Specifically, the protocol allows for the culture and transfection of primary CD14+ monocytes obtained from HIV-infected individuals undergoing cART as well as from HIV-negative controls. The method involves isolation, culture, and transfection of monocytes and monocyte-derived macrophages. While commercially available kits and reagents are employed, the protocol provides important tips and optimized conditions for successful adherence and transfection of monocytes with miRNA mimics and inhibitors as well as with siRNAs.

Presented here is an optimized protocol for isolating, culturing, transfecting, and differentiating human primary monocytes from HIV-infected individuals and healthy controls.

العزلة ، الانتقال ، وثقافة الخلايا البشرية الاوليه

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...