Bu çalışma, bir araştırma hibe ve Hibe Yardım, Japonya Tarım, Orman ve Balıkçılık Bakanlığı Gıda Nanoteknoloji Projesi tarafından finanse edildi

1. Karaciğer, Perfüzyon <ol><li> Intraperitoneal sodyum pentobarbital bir çözüm (50 mg sodyum pentobarbital / kg vücut ağırlığı); yetişkin erkek Sprague-Dawley sıçan (vücut ağırlığı 150-200 gr hafta-10-15) anestezisi. </li><li> Paslanmaz bir tavada hayvan koyun ve% 70 etanol, karın ve göğüs üzerine püskürtün. </li><li> Açıklarındaki küçük bir kesim ve cilt soyma olun. Bir makas ile kesme karın açın. </li><li> Portal ven yerini onaylayın, portal ven ve gevşek bir tutam altında bir cerrahi iplik geçer. </li><li> Tutam inferior vena kava ve karaciğerde kanın geri kaçmasını önleyecek şekilde mezenterik ven distal parçası. Göğüs boşluğu diyafram makasla keserek açın ve kalp maruz. </li><li> Plastik bir kateter (2 mm çapında) ve portal ven içine yerleştirin ve kateter etrafında konu iyice sıkın. </li><li> 37 ° prewarmed ° C; yıkama solüsyonu (pH 7,2 Ca 2 +-Mg 2 + 0,5 mM EGTA, 10 mM HEPES ve 4.2 mM NaHCO 3 içeren ücretsiz HBSS) ile yüklenen bir perfüzyon sistemi kateter bağlayın </li><li> 10 ml / dak hızında in situ perfüzyon başlayın. Aynı zamanda, sağ atrium duvarında bir kesim olun. 10 dakika için perfüzyon devam edin. </li><li> Perfüzyon çözüm kollajenaz çözüm Anahtarı [Tipi ile desteklenmiş 10mM Hepes ve 4.2mm NaHCO 3 içeren HBSS kollajenaz (% 0.05) ve tripsin inhibitörü (50 mg / ml), pH 7.5] 10 ve serpmek hızında 20 dakika 10 ml / dak karaciğer biraz şişer ve seröz membran altında karaciğer yapısının dağılması için işareti gösterene kadar. </li></ol> 2. Parankimal Hepatosit zengin Hücre Kesir hazırlanması <ol><li> Çıkarın ve dikkatli bir şekilde steril bir behere 25 ml kollajenaz çözüm içeren karaciğer transferi. Makasla küçük parçalar halinde Kıyma. </li><li> Ortaya çıkan hücre süspansiyonu içine 75 ml soğuk MEM ekleyin. Nazik pipetleme sonra, süzüntü bir hücre süzgeç (100 mm) ile, bağ dokuları ve sindirilememiş doku parçaları kaldırmak için. </li><li> 4 ° C (fren kapalı) 1 dakika 50 xg&#39;de süzüntü 50 ml konik tüpler ve santrifüj içine aktarın. </li><li> Süpernatantı dikkatli atın. Soğuk MEM pelletini tekrar. </li><li> ) Üç kez 2.4 tekrarlayın. </li></ol> 3. Karaciğer Hücreleri Karma İlköğretim Kültür <ol><li> DMEM 100 mcM β-mercaptoethanol 10 mg / ml insülin, 100 mg / ml streptomisin ve 100 U / ml penisilin ve tohum ile desteklenmiş% 10 ısı inaktive FCS içeren oluşan besi 2.5 &#39;te elde edilen hücreler) Askıya Alma 6.7 x 10 4 hücre / cm 2 (orta 5 x 10 6 hücre / şişeyi / 12 -15 ml) yoğunluğu: 09:55 doku kültürü şişeleri (75 cm 2 yüzey alanı). </li><li> Inkübe kültür flasksat 37 ° C -% 5 CO 2 &#39;nin bir atmosfer% 95 hava. </li><li> Besi her 2 ila 3 gün aralıklarla değiştirin. </li></ol> 4. Makrofajlar, Seçici İzolasyon <ol><li> 12 gün sonra kültür, makrofaj hücre kağıda çoğalırlar. Bu hücreler, 80 kültür şişe sallayarak karşılıklı tarafından askıya alınır - 30 dakika için dakikada 120 vuruş 37 ° C </li><li> 100 mm olmayan doku kültürü dereceli plastik tabaklar kültür ortamı içine aktarın. Bir plastik tabak içine iki T75 şişeler orta Havuzu. Büyüme, orta ve Yedek kültür şişeler inkübatör onları geri. </li><li> 37 30 dakika inkübe plastik tabaklar ° C -% 5 CO2 atmosferi% 95 hava Makrofajlar kolayca diğer kirliliğe neden olan hücreleri yok ise, bu kuluçka süreci kapsamında olmayan doku kültürü notu plastik tabaklar eklemek. </li><li> Aspire orta ve PBS ile plastik yemek nazikçe yıkayın. Bu adımı üç kez tekrarlayın. </li><li> TrypLE Express çözümü 1 ml çanak içine ekleyin ve 37 o 10 dakika süreyle inkübe ° C -% 5 CO2 atmosferi% 95 hava. </li><li> Besi 9 ml ekleyin. Bir hücre kazıyıcı bağlı makrofaj hafifçe kazıyın. </li><li> Hücre süspansiyonu, ° C (fren) 5 dakika boyunca 25 180 xg 15 ml konik tüp ve santrifüj içine aktarın. </li><li> Süpernatantı atın ve besi 1 ml ekleyin. Dinç pipetleme tek hücre içine ayrıştırmaları. Hemasitometre sayma hücre sayısı numaralandırılamıyor. </li><li> İzolasyon adımları, 2-3 gün aralıklarla en fazla iki hafta boyunca aynı kültür şişeler tekrarlanmalıdır. </li><li> İzole makrofajlar 3.1 &#39;de açıklanan büyüme ortamında yetiştirilebilir. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Yetişkin sıçan karaciğer hücrelerinin karışık bir birincil kültürünün bir örneği Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. Parankimal hepatositler kültür birkaç gün içinde epitel hücre morfolojisi kaybedersiniz, yozlaşmış ya da fibroblast-benzeri hücreler haline dönüştürmek.Sonra, günde yaklaşık 6 ila 12, faz kontrast parlak, yuvarlak makrofaj benzeri hücreler vigourouly fibroblastik hücre kağıda çoğalırlar. Kültür şişe çalkalanarak, makrofajlar kültür ortama kolayca askıya alınır ve plastik tabaklar sonraki transfer ve inkübasyon makrofaj seçici yapışma (Şekil 3). Makrofaj-benzeri hücreler 8. günde olduğu kadar erken olarak hasat ve sayıları 12 ila 14 gün maksimum seviyelere ulaşmıştır. Fazla 10 6 hücre kültür şişesi (Şekil 3) 10 7 T75 her bir şişesi ortalama toplam hücre verimi sağlayan, en fazla iki hafta boyunca 2 ila 3 gün aralıklarla art arda T75 kültür şişelerinde hasat edilebilir . Izole makrofajların saflık ED-1 (Şekil 4), ED-3, OX-41 (Şekil 4) ve Iba1 9 gibi sıçan makrofaj-spesifik antikorların flowcytometry veya immünsitokimya tarafından değerlendirilir 95 ila% 99, izole hücreler polystylene boncuk aktif fagositoz (Şekil 5), rekombinant GM-CSF, LPS ile stimülasyon, ve çok çekirdekli dev hücreler 9 oluşumu üzerine inflamatuar / anti-inflamatuar sitokinlerin salgılanması proliferatif yanıt olarak makrofaj tipik özelliklerini gösterir. <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 sıçan karaciğer hücrelerinin karışık primer kültür makrofaj benzeri hücreler seçici izolasyonu ve saflaştırılması için bir şema. <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 sıçan karaciğer hücreleri ve makrofaj gibi hücrelerin çoğalması Primer kültür. Ok multinükleer dev hücreli gösterir. Ölçeği bar = 100 mikron. Elsevier izin İmmünolojik Yöntemleri Dergisi, Vol.360, 47-55 (2010) 9 yayımlanmaktadır. <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 sallayarak ve ek yöntemi makrofaj benzeri hücreler seçici izolasyon. Hücreler, matara sallayarak kültür ortamı içine askıya Daha sonra doku kültürü olmayan dereceli plastik tabaklar aktarılır ve 37 ° C&#39;de inkübe Kaplama gibi erken 10 dakika sonra, diğer bulaşıcı fibroblastik hücreler asılı kalırken, çanak yüzeye bağlı makrofaj benzeri hücreler. PBS ile iyice durulandıktan sonra, son derece saf bir makrofaj nüfus elde edildi. Bu hücreler kültür 40 dakika sonra tipik makrofaj morfolojisi kazanmıştır ve mitotik hücrelerin sık sık gözlenmiştir (oklar). Farklı kültür dönemlerde şişeler ele hücre sayıları daha sonra yapılan değişiklikler gösterilmiştir. Değerler üç beş şişeler ortalama ± SD. Deneyler, üç kez tekrarlandı ve veri farklı sembollerle gösterilir. Ölçeği bar = 100 mikron. Elsevier izin İmmünolojik Yöntemleri Dergisi, Vol.360, 47-55 (2010) 9 yayımlanmaktadır. <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4 sıçan makrofajlar karşı monoklonal antikorlar ile makrofaj benzeri hücreler İmmünositokimyasal boyama. <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig5.jpg" alt="Şekil 5" /> Şekil 5 makrofaj benzeri hücreler tarafından FITC etiketli mikro Fagositoz.

<ol>
	<li>Crispe, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+liver+as+a+lymphoid+organ.">The liver as a lymphoid organ.</a> Annu. Rev. Immunol. 27, 147-163 (2009).</li><li>Roberts, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+Kupffer+cell+in+mediating+hepatic+toxicity+and+carcinogenesis.">Role of the Kupffer cell in mediating hepatic toxicity and carcinogenesis.</a> Toxicol. Sci. 96, 2-15 (2007).</li><li>Gao, B., Jeong, W. I., Tian, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver:+An+organ+with+predominant+innate+immunity.">Liver: An organ with predominant innate immunity.</a> Hepatology. 47, 729-736 (2008).</li><li>Janousek, J., Strmen, E., Gervais, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+murine+Kupffer+cells+by+centrifugal+elutriation.">Purification of murine Kupffer cells by centrifugal elutriation.</a> J. Immunol. Methods. 164, 109-117 (1993).</li><li>Olynyk, J. K., Clarke, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+rat+Kupffer+cells.">Isolation and primary culture of rat Kupffer cells.</a> J. Gastroenterol. Hepatol. 13, 842-845 (1998).</li><li>Heuff, G., Meyer, S., Beelen, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+rat+and+human+Kupffer+cells+by+a+modified+enzymatic+assay.">Isolation of rat and human Kupffer cells by a modified enzymatic assay.</a> J. Immunol. Methods. 174, 61-65 (1994).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+isolated+rat+liver+cells.">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).</li><li>Yoshioka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+and+expression+of+cytokine+mRNAs+by+lipopolysaccharide+in+bovine+Kupffer+cells.">Primary culture and expression of cytokine mRNAs by lipopolysaccharide in bovine Kupffer cells.</a> Vet. Immunol. Immunopathol. 58, 155-163 (1997).</li><li>Kitani, H., Takenouchi, T., Sato, M., Yoshioka, M., Yamanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+isolation+method+for+macrophage-like+cells+from+mixed+primary+cultures+of+adult+rat+liver+cells.">A novel isolation method for macrophage-like cells from mixed primary cultures of adult rat liver cells.</a> J. Immunol. Methods. 360, 47-55 (2010).</li><li>Gorrell, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+fibrosis:+the+hepatocyte+revisited.">Liver fibrosis: the hepatocyte revisited.</a> Hepatology. 46, 1659-1661 (2007).</li></ol>

Tüm hayvanlar, hayvan deneyleri için Kurum Komitesi tarafından belirlenen kurallara ve düzenlemelere göre, Hayvan Sağlığı Ulusal Enstitüsü hayvan tesis tutulur ve ameliyat edildi.

Burada, yetişkin sıçan karaciğer hücrelerinin karışık primer kültürlerden gelen makrofajlar elde etmek için basit ve verimli bir yöntem raporu. Bizim sıçan karaciğer hücrelerinin karışık kültür yöntemi makrofajların roman proliferatif aktivite ilk güvenir ve daha sonra makrofajlar 9 olarak biyolojik özellikleri temelinde, bu hücrelerin sonraki izolasyonu ve saflaştırılması. Yetişkin karaciğer hücrelerinin karışık birincil kültür çoğaldı makrofajlar Kupffer veya parankimal hepatositler fraksiyonu kontamine ilişkili hücreler kaynaklanmış olabilir mümkün olabilir. Makrofajlar karışık birincil kültürlerde parankimal hepatosit 10 ve diğer fibroblastik hücreler dönüşüm neden olduğu çevresel değişikliklere yanıt olabilir . Sonuç olarak, yöntemi, gelişmiş donanım ve teknik becerileri kullanarak, sıçan karaciğer cellswithout birincil kültürünün yeterli sayıda ve saflık makrofaj gibi hücreleri izolasyonu sağlar. Buna ek olarak, yalıtım işlemi en fazla iki hafta boyunca aynı kültür şişesi ile tekrar edilebilir. Bu yöntem, diğer memeli türleri için geçerli olabilir.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> Sodyum pentobarbital çözüm </td><td> KYORITSU Seiyaku </td><td> Somnopentyl Enjeksiyon </td><td></td></tr><tr><td> Hank dengeli tuz solüsyonu (HBSS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14185-052 </td><td></td></tr><tr><td> Etilen glikol tetraasetik asit (EGTA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E-4378 </td><td></td></tr><tr><td> Kollajenaz </td><td> Wako Saf Chemical Industries, Ltd. </td><td> 032-10534 </td><td> Hücre disosiasyon derece (Lot kontrol gerekli) </td></tr><tr><td> Tripsin inhibitörü </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T-9128 </td><td></td></tr><tr><td> Eagle minimum esansiyel orta (MEM) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M-4655 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;nun değiştirilmiş bulunuyor Eagle orta (DMEM) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D-6459 </td><td> Yüksek glukoz-tipi </td></tr><tr><td> Fetal buzağı serumu (FCS) </td><td> HyClone </td><td> SH30070.03 </td><td> Isı 56 ° C de 30 dakika süreyle inaktive. (Lot kontrol gerekli) </td></tr><tr><td> TrypLE Express </td><td> Invitrogen </td><td> 12605 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;nun fosfat tamponlu salin (PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td><td> Ca 2 +-Mg 2 + ücretsiz </td></tr><tr><td> ß-mercaptoethanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M-7522 </td><td> Stok: distile su içinde 100 mM </td></tr><tr><td> İnsülin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I-5500 </td><td> Stok: 0,1 N HCl 10 mg / ml </td></tr><tr><td> Penisilin / streptomisin </td><td> Invitrogen </td><td> 15070 </td><td></td></tr><tr><td> Hücre süzgeç </td><td> BD Biosciences </td><td> 352360 </td><td> Mesh boyutu: 100 mikron </td></tr><tr><td> Doku kültürü şişesi </td><td> Sumitomo Bakalit Co, Ltd </td><td> MS-21250 </td><td> Yüzey alanı: 75 cm 2 </td></tr><tr><td> Sigara-doku kültürü plastik tabaklar </td><td> BD Biosciences </td><td> 351005 </td><td></td></tr><tr><td> Hücre kazıyıcı </td><td> Corning Inc. </td><td> 3010 </td><td></td></tr><tr><td> Karşılıklı çalkalayıcı </td><td> TAITEC </td><td> NR-1 </td><td></td></tr></tbody></table>

a simple and efficient method to isolate macrophages from mixed primary cultures of adult liver cells

Kupffer hücreleri karaciğer özel ikamet eden makrofaj ve karaciğer 1-3 fizyolojik ve patolojik fonksiyonları önemli bir rol oynamaktadır. Karaciğer makrofajların izolasyon yöntemleri 4-6 iyi tanımlanmış olmasına rağmen, bu yöntemlerin çoğu böyle bir santrifüj elutriator ve teknik beceri olarak gelişmiş donanım gerektirir. Burada, karaciğer makrofajlar şematik olarak Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi yetişkin sıçan karaciğer hücrelerinin karışık birincil kültürleri, yeterli sayıda ve saflık elde etmek için yeni bir yöntem sağlar. Iki adım perfüzyon yöntemi 7,8 karaciğer hücrelerinin disosiasyon sonra, çoğunlukla parankimal hepatositlerde oluşan bir kısmını hazırlanan ve T75 DMEM ve% 10 FCS.Parenchymal hepatositlerde oluşan kültür ortamı ile doku kültürü şişeleri içine numaralı seribaşı epitel hücre morfolojisi kaybedersiniz birkaç gün içinde bir kültür, yozlaşmış ya da fibroblast benzeri hücreler (Şekil 2) haline dönüştürmek. Kültür, yaklaşık 6 gün ilerledikçe, faz kontrast parlak, yuvarlak makrofaj benzeri hücreler (Şekil 2) fibroblastik hücre kağıda prolifere başlar. Gibi Makrofaj gibi hücrelerin büyümesini devam şişeyi yüzeyinde hücre sayfasını kapsayan ve yaklaşık 12 gün maksimum seviyelere ulaşmak. Kültür şişe çalkalanarak, makrofajlar kolaylıkla kültür ortamı içine askıya alınır. Gibi diğer kirlenmesine neden olan hücreleri askıda kalır makrofajlar seçici yapışma plastik tabaklar sonucu sonraki transfer ve kısa inkübasyon (Şekil 3). PBS ile birkaç durular sonra, ekli makrofajlar hasat edilir. 10&#39;dan fazla 6 hücre, iki haftadan daha uzun (Şekil 3), 2-3 gün aralıklarla aynı T75 doku kültürü şişesi sürekli hasat veya flow sitometri tarafından değerlendirilir olarak izole makrofajların saflık, 95 % 99 sıçan makrofaj-spesifik antikorların (Şekil 4) ile immünsitokimya izole hücrelerinin LPS ile uyarılması ve oluşumu üzerine polystylene boncuk aktif fagositoz (Şekil 5), GM-CSF rekombinant proliferatif yanıt, inflamatuar / anti-inflamatuar sitokinlerin salgılanması multinükleer dev hücreler 9. Sonuç olarak, bu yöntemi diğer memeli türleri için geçerli olabilir, karmaşık ekipman ve skills.This olmadan, yeterli sayıda ve saflık karaciğer makrofajlar elde etmek için basit ve etkili bir yöntem sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells at JoVE.com

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Makrofajlar sıçan karaciğer hücrelerinin primer kültür elde etmek için yeni bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, plastik tabaklar, seçici eklenti kültür matara ve arıtma sallayarak kültürün yayılması, makrofajlar kullanır. Bu teknik, karmaşık ekipman ve becerileri verimli olmadan karaciğer makrofajlar sağlar.

Yetişkin Karaciğer Hücrelerinin Karma İlköğretim Kültürler Makrofajlar yalıtın Basit ve Etkin Yöntem

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

a-simple-efficient-method-to-isolate-macrophages-from-mixed-primary

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

38.1K Görüntüleme.  National Institute of Agrobiological Sciences, Tsukuba, Japan. Makrofajlar sıçan karaciğer hücrelerinin primer kültür elde etmek için yeni bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, plastik tabaklar, seçici eklenti kültür matara ve arıtma sallayarak kültürün yayılması, makrofajlar kullanır. Bu teknik, karmaşık ekipman ve becerileri verimli olmadan karaciğer makrofajlar sağlar.

Video: A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Isolation and Enrichment of Liver Progenitor Subsets Identified by a Novel Surface Marker Combination

During chronic liver injuries, progenitor cells expand in a process called ductular reaction, which also entails the appearance of inflammatory cellular infiltrate and epithelial cell activation. The progenitor cell population during such inflammatory reactions has mostly been investigated using single surface markers, either by histological analysis or by flow cytometry-based techniques. However, novel surface markers identified various functionally distinct subsets within the liver progenitor/stem cell compartment. The method presented here describes the isolation and detailed flow cytometry analysis of progenitor subsets using novel surface marker combinations. Moreover, it demonstrates how the various progenitor cell subsets can be isolated with high purity using automated magnetic and FACS sorting-based methods. Importantly, novel and simplified enzymatic dissociation of the liver allows for the isolation of these rare cell populations with a high viability that is superior in comparison to other existing methods. This is especially relevant for further studying progenitor cells in vitro or for isolating high-quality RNA to analyze the gene expression profile.

Liver injuries are accompanied by progenitor cell expansion that represents a heterogeneous cell population. Novel classification of this cellular compartment allows for the distinguishing of multiple subsets. The method described here illustrates the flow cytometry analysis and high purity isolation of various subsets that can be used for further assays.

İzolasyon ve Roman Yüzey Etiket Kombinasyon ile tanımlanır Karaciğer progenitör Alt Grupları zenginleştirilmesi

During chronic liver injuries, progenitor cells expand in a process called ductular reaction, which also entails the appearance of inflammatory cellular ...

Gelişim Biyolojisi

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. The various functions of these cells are related to their activation states, which is also called polarization. The precise molecular description of these various polarizations is a priority in the field of macrophage biology. It is currently acknowledged that a multidimensional approach is necessary to describe how polarization is controlled by environmental signals. In this report, we describe a protocol designed to obtain the proteomic signature of various polarizations in human macrophages. This protocol is based on a label-free quantification of macrophage protein expression obtained from in-gel fractionated and Lys C/trypsin-digested cellular lysis content. We also provide a protocol based on in-solution digestion and isoelectric focusing fractionation to use as an alternative. Because oxygen concentration is a relevant environmental parameter in tissues, we use this protocol to explore how atmospheric composition or a low oxygen environment affects the classification of macrophage polarization.

We present a protocol to obtain proteomic signatures of human macrophages and apply this to determination of the impact of a low oxygen environment on macrophage polarization.

Düşük oksijen ortamı altında insan makrofaj polarizasyon proteomik analizi

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Biyokimya

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Bir<em&gt; In vitro</emİnsan Makrofaj Farklılaşma ve Polarizasyon heterojenliği Eğitim için&gt; Model

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to understand the underlying mechanisms of these diseases. We therefore present a straightforward protocol for the isolation of human monocytes from buffy coats, followed by a differentiation procedure which results in high macrophage yields. The technique relies mostly on commonly available lab equipment and thus provides a cost and time effective way to obtain large quantities of human macrophages. Briefly, buffy coats from healthy blood donors are subjected to a double density gradient centrifugation to harvest monocytes from the peripheral blood. These monocytes are then cultured in fluorinated ethylene propylene (FEP) Teflon-coated cell culture bags in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The differentiated macrophages can be easily harvested and used for subsequent studies and functional assays. Important methods for quality control and validation of the isolation and differentiation steps will be highlighted within the protocol. In summary, the protocol described here enables scientists to routinely and reproducibly isolate human macrophages without the need for cost intensive tools. Furthermore, disease models can be studied in a syngeneic human system circumventing the use of murine macrophages.

We present a simple and efficient protocol for the generation of human macrophages. Buffy coats are processed by double density gradient centrifugation and isolated monocytes are then differentiated to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. This maximizes macrophage yields and facilitates cell harvesting for subsequent experiments.

İnsan Çift Gradient Santrifüj ile Monositlerinde ve teflon kaplı Hücre Kültürü Çantalar Makrofagların Onların Farklılaşma İzolasyonu

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

Makrofaj koloni stimüle edici faktör farklılaştırılmış insan monosit türevli makrofajlar Kültür

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

<meta charset="utf8"></head><body>Makrofaj-Tümör Sferoid Etkileşimlerinin 3 Boyutlu Kollajen Matriks Kurulumunda İncelenmesi

A Macrophage-Tumor Spheroid Co-Invasion Assay

The interaction of immune and cancer cells and their respective impact on metastasis represents an important aspect of cancer research. So far, only a few protocols are available that allow an in vitro approximation of the in vivo situation. Here, we present a novel approach to observing the impact of human macrophages on the invasiveness of cancer cells, using tumor spheroids of H1299 non-small cell lung carcinoma cells embedded in a three-dimensional (3D) collagen I matrix. With this co-cultivation setup, we tested the impact of small interfering RNA (siRNA)-based depletion of regulatory factors in macrophages on the 3D invasion of cancer cells from the tumor spheroid compared to controls. This method allows the determination of different parameters, such as spheroid area or the number of invading cancer cells, and thus, to detect differences in cancer cell invasion. In this article, we present the respective setup, discuss the subsequent analysis, as well as the advantages and potential pitfalls of this method.

<meta charset="utf8"></head><body>Bir Makrofaj-Tümör Sferoid Ko-İnvazyon Testi

Here, we present a protocol to investigate the interaction of primary human monocyte-derived macrophages with a tumor spheroid in a three-dimensional (3D) collagen I matrix, with the possibility to compare the impact of soluble and physical properties of the microenvironment on cell invasion.

Bir Makrofaj-Tümör Sferoid Ko-İnvazyon Testi

The interaction of immune and cancer cells and their respective impact on metastasis represents an important aspect of cancer research. So far, only a few ...

Kanser Araştırmaları

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the uremic milieu, oxidative stress, endotoxemia and the decreased clearance of circulating proinflammatory cytokines by producing a large number of acute-phase reactants. Experimental tools to study inflammation and the underlying role of hepatocytes are crucial to understand the regulation and contribution of hepatic cytokines to a systemic acute phase response and a prolonged pro-inflammatory scenario, especially in an intricate setting such as chronic kidney disease. Since studying complex mechanisms of inflammation in vivo remains challenging, resource-intensive and usually requires the usage of transgenic animals, primary isolated hepatocytes provide a robust tool to gain mechanistic insights into the hepatic acute-phase response. Since this in vitro technique features moderate costs, high reproducibility and common technical knowledge, primary isolated hepatocytes can also be easily used as a screening approach. Here, we describe an enzymatic-based method to isolate primary murine hepatocytes, and we describe the assessment of an inflammatory response in these cells using ELISA and quantitative real-time PCR.

Here, we show an enzymatic approach to isolate primary hepatocytes from adult mice, and we describe the quantification of an inflammatory response using ELISA and real-time PCR.

Fare Primer Hepatosit Kültürler bir inflamatuar yanıtın indüksiyon

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. Diet-induced obesity (DIO) is a valuable model in studying the role of macrophage heterogeneity; however, adequate macrophage isolations are difficult to acquire from inflamed tissues. In this protocol, we outline the isolation steps and necessary troubleshooting guidelines derived from our studies for obtaining a suitable population of tissue-resident macrophages from mice following 18 weeks of high-fat (HFD) or high-fat/high-cholesterol (HFHCD) diet intervention. This protocol focuses on three hallmark tissues studied in obesity and atherosclerosis including the liver, white adipose tissues (WAT), and the aorta. We highlight how dualistic usage of flow cytometry can achieve a new dimension of isolation and characterization of tissue-resident macrophages. A fundamental section of this protocol addresses the intricacies underlying tissue-specific enzymatic digestions and macrophage isolation, and subsequent cell-surface antibody staining for flow cytometric analysis. This protocol addresses existing complexities underlying fluorescent-activated cell sorting (FACS) and presents clarifications to these complexities so as to obtain broad range characterization from adequately sorted cell populations. Alternate enrichment methods are included for sorting cells, such as the dense liver, allowing for flexibility and time management when working with FACS. In brief, this protocol aids the researcher to evaluate macrophage heterogeneity from a multitude of inflamed tissues in a given study and provides insightful troubleshooting tips that have been successful for favorable cellular isolation and characterization of immune cells in DIO-mediated inflammation.

This protocol allows a researcher to isolate and characterize tissue-resident macrophages in various hallmark inflamed tissues extracted from diet-induced models of metabolic disorders.

Yetişkin Karaciğer Hücrelerinin Karma İlköğretim Kültürler Makrofajlar yalıtın Basit ve Etkin Yöntem

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

İzolasyon ve Roman Yüzey Etiket Kombinasyon ile tanımlanır Karaciğer progenitör Alt Grupları zenginleştirilmesi

Düşük oksijen ortamı altında insan makrofaj polarizasyon proteomik analizi

Bir

İnsan Çift Gradient Santrifüj ile Monositlerinde ve teflon kaplı Hücre Kültürü Çantalar Makrofagların Onların Farklılaşma İzolasyonu

Makrofaj koloni stimüle edici faktör farklılaştırılmış insan monosit türevli makrofajlar Kültür

Bir Makrofaj-Tümör Sferoid Ko-İnvazyon Testi

Bir Makrofaj-Tümör Sferoid Ko-İnvazyon Testi

Bir Makrofaj-Tümör Sferoid Ko-İnvazyon Testi

Fare Primer Hepatosit Kültürler bir inflamatuar yanıtın indüksiyon

Yalıtım, karakterizasyonu ve obezite ile ilgili iltihap tarafından etkilenen dokular makrofajlar arıtma