وأيد المشروع من قبل المعاهد الوطنية للصحة العقد رقم HHSN2662000500021C المعدية. نشكر تشن مينغ لمساعدته التقنية.

1. برنامج ال 96 Amaxa Nucleofector المكوك جيدا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح ملف المعلمة الجديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد عدد الآبار التي ستستخدم لترنسفكأيشن القياسية عن طريق سحب المؤشر على الرسم البياني 96 لوحة جيدا. استخدام الحد الأدنى من 3 آبار لتجميع لكل عينة تجريبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدخال رمز البرنامج : في PART1 &quot;FF&quot; في اختيار وتحديد part2 &#39;168&#39; من القوائم المنسدلة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد مربع من الحل &quot;، الوحيدات البشرية&quot; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد الخيار تحت مراقبة &#39;معيار&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على تطبيق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتشمل مراقبة عدم ترنسفكأيشن ، حدد مزيد من الآبار المخطط كما هو مطلوب ثم اختر &#39;لا يوجد برنامج التحكم&quot; من خيار التحكم وانقر على تطبيق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد أي الآبار المتبقية غير المستخدمة على لوحة الرسم وانقر على Undefine. </li></ol> 2. إعداد البلدان النامية لترنسفكأيشن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي أن يتم كل العمل تحت ظروف معقمة في خلية غطاء الثقافة حيثما أمكن ذلك. إعداد الحل nucleofection بإضافة 96 - جيدا لتكملة الإنسان الوحيدات 96 Nucleofector الحل جيدا في نسبة من 450 إلى عام 2025. مزيج دافئ والسماح لدرجة حرارة الغرفة. ستحتاج 20μl حل nucleofection لكل بئر. جعل وجود فائض قدره 10 ٪ للسماح pipetting الخطأ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع عدد من الوحدات nucleocuvette تحتاج إلى لوحة nucleocuvette في الاتجاه الصحيح أي إدراج أول واحد في الصفوف 1 و 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد عدد من البلدان النامية بحاجة لتجربتك على حساب الخلايا لكل 500،000 جيدا وبيليه بواسطة الطرد المركزي في 400g عن 10min. إزالة بعناية طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا في حل nucleofection بواسطة pipetting بلطف صعودا وهبوطا عدة مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقسيم وحدة التخزين الصحيحة من الخلايا معلق في eppendorfs المسمى لGLO العلاج خاصة وعلى سبيل المثال RIG - I. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة سيرنا 0.25μg لكل 500،000 الخلايا ومزيج من قبل pipetting. عدم استخدام استهداف سيرنا في عينتك عدم السيطرة ترنسفكأيشن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 20μl من الخلائط أعلاه إلى وحدات nucleocuvette ، وفقا لتخطيط لتجريبية ، وضمان سائلة يتم تسليمها إلى أسفل البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية لوحة nucleocuvette مع غطاء والاستفادة من لوحة على سطح صلب عدة مرات للمساعدة على ضمان إزالة فقاعات الهواء. </li></ol> 3. Transfect البلدان النامية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج لوحة في درج Nucleofector المكوك 96 - جيدا ، وانقر على تحميل ثم بدء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متابعة التقدم المحرز في عملية ترنسفكأيشن في اللفة عرض أعلى ؛ عرضية سوداء على خلفية خضراء ترنسفكأيشن يدل على نجاحها في ذلك جيدا ، في حين ان شريط أسود على خلفية حمراء يعني أنها كانت ناجحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند الانتهاء من عملية ترنسفكأيشن ، وإزالة لوحة وإضافة 80μl متوسطة النمو المستمر إلى كل جيدا باستخدام ماصة الأقنية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحة لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حجم نقل 100μl من nucleocuvettes في أنابيب تحتوي على مصفوفة 100μl من قبل تحسنت العاصمة المتوسطة النمو ، والحفاظ على الاتجاه الصحيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة والتخلص من تلك الأنابيب ترنسفكأيشن حيث لم يحدث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2 لل24H أو غيرها من الفاصل الزمني المطلوب. </li></ol> 4. تصيب الخلايا مع NDV <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أنابيب مصفوفة من الحاضنة إلى الخلية هود الثقافة وأنابيب تجمع لكل عينة تجريبية في eppendorfs </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الخلايا برفق من خلال الدوران في مكتب لجهاز الطرد المركزي الأعلى لمدة 5 دقائق وإزالة طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا في النمو المتوسطة المصل خالية NDV تحتوي على وزارة الداخلية في جامعة النجاح واحتضان من 1 إلى 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2 لمدة 45 دقيقة ، مع تغطية eppendorfs فضفاضة بطريقة عقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 900μl متوسطة النمو العاصمة ، وإعادة احتضان مقابل 80-10 ساعة. </li></ol> 5. حصاد الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الخلايا من خلال الدوران eppendorfs في مكتب أعلى الطرد المركزي وإزالة طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا الحمض النووي الريبي لالحصاد أو استخراج البروتين وفقا للبروتوكول الخاص. </li></ol> 6. ممثل النتائج : باستخدام بروتوكول لدينا الأمثل transfected نحن البلدان النامية مع ريجي استهداف سيرنا لمدة 24 ساعة وبعد ذلك الخلايا المصابة مع NDV (أ الفيروسة المخاطانية الكشف عنها بواسطة I - RIG) لتنشيط المسار استجابة انترفيرون. بواسطة qRT - PCR تحليل أثبتنا نهدم من الجين بنسبة 75 ٪ على مستوى النسخ. لاحظنا أيضا انخفاض مماثل في التعبير عن IFNβ ، وهو المستجيب المصب I - تلاعب في تتالي إشارات الإنترفيرون. علاوة على ذلك ، لاحظنا أن التعبير عن IFNβ في الخلايا غير المصابة التحكم transfected ، كان لا يمكن كشفها في حين أن MxA ، وهو الجين IFNβ استجابة المصب ، وكان الحد الأدنى (الشكل 1A). A ترنسفكأيشن الثانية من البلدان النامية مع ريجي استهداف سيرنا أجريت باستخدام الخلايا بما يكفي لتشمل تحليل لطخة غربية. حيثوRT - PCR نتائج مماثلة لما شهدناه في السابق (62 ٪ و 66 ٪ من نهدم RIG - I على التوالي والتعبير IFNβ) (الشكل 1B) ، للبحث عن لطخة غربية RIG - I كشفت أن التعبير عن هذا الجين قد تم سدت تماما (الشكل 1C). <img src="/files/ftp_upload/2766/2766fig1.jpg" alt="الشكل 1A"/> الشكل 1. (A) وtransfected MoDCs إما مع سيرنا استهداف RIG - I أو غير محدد سيرنا GLO والتأثير على التعبير عن RIG - I IFNβ وMxA يحددها qRT - PCR. وكان البروتوكول ترنسفكأيشن استخدام العازلة الوحيدات محددة وبرنامج nucleoporation FF168 (Lonza Walkersville شركة) الحضانة وبعد لمدة 24 ساعة ، اما الخلايا المصابة transfected مع NDV (+) أو غير مصاب اليسار (--). بعد مزيد من الحضانة لمدة 10 ساعة ، وكان حصاد الخلايا والحمض النووي الريبي مستويات استخراج نسخة تمثل نتائج تجربتين تكرار. مأخوذة من بولز وآخرون 16 (B) ومرة أخرى transfected MoDCs الحصول عليها من معطف الشهباء مختلفة كما تستخدم في الشكل 1A إما مع RIG - I - استهداف سيرنا أو غير محدد سيرنا GLO باستخدام بروتوكول ترنسفكأيشن نفس أعلاه. وقد أدرج عنصر تحكم إضافية باستخدام MoDCs untransfected في التجربة. بعد 24 ساعة حضانة أصيبوا كافة الخلايا مع NDV والمحتضنة لمزيد من 10 ساعة قبل أن يتم حصاد كل من الحمض النووي الريبي واستخراج البروتين. مستويات نص RIG - I IFNβ ، وعلى النحو الذي يحدده MxA qRT - PCR تمثل نتائج تجربتين تكرار. مأخوذة من بولز 16 آخرون (C) وحللت Lysates من خلايا وصفها في الشكل 1B أعلاه لطخة غربية. حارات 1 و 2 ، lysates من خلايا untransfected ؛ الممرات 3 و 4 من خلايا lysates سيرنا GLO transfected ؛ الممرات 5 و 6 من خلايا lysates transfected مع RIG - I استهداف سيرنا. وكانت عينات للبحث I - RIG وكذلك GAPDH (كعنصر تحكم التحميل) وكانت تعمل في مكررة. مأخوذة من بولز 16 آخرون.

<ol>
	<li>Reis e Sousa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+dendritic+cells:+translating+innate+into+adaptive+immunity.">Activation of dendritic cells: translating innate into adaptive immunity.</a> Curr. Opin. Immunol. 16, 21-25 (2004).</li><li>Bancherau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity.">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392, 245-252 (1998).</li><li>Clark, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dendritic+cells+in+the+innate+immune+system.">The role of dendritic cells in the innate immune system.</a> Microbes Infect. 2, 257-272 (2000).</li><li>Hamm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transfection+method+for+primary+cells.">Efficient transfection method for primary cells.</a> Tissue Eng. 8, 235-245 (2002).</li><li>Henderson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+dendritic+cells+genetically+engineered+to+express+high+levels+of+the+human+epithelial+tumor+antigen+mucin+(MUC-1).">Human dendritic cells genetically engineered to express high levels of the human epithelial tumor antigen mucin (MUC-1).</a> Cancer Res. 56, 3763-3770 (1996).</li><li>Reeves, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+transduction+of+human+dendritic+cells+with+a+tumor-associated+antigen+gene.">Retroviral transduction of human dendritic cells with a tumor-associated antigen gene.</a> Cancer Res. 56, 5672-5677 (1996).</li><li>Aicher, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+retroviral+mediated+transduction+of+a+reporter+gene+in+human+dendritic+cells:+feasibility+of+therapy+with+gene-modified+antigen+presenting+cells.">Successful retroviral mediated transduction of a reporter gene in human dendritic cells: feasibility of therapy with gene-modified antigen presenting cells.</a> Exp. Hematol. 25, 39-44 (1997).</li><li>Thomas, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+problems+with+the+use+of+viral+vectors+for+gene+therapy.">Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy.</a> Nat Rev Genet. 4, 346-358 (2003).</li><li>Jooss, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+of+dendritic+cells+by+DNA+viral+vectors+directs+the+immune+response+to+transgene+products+in+muscle+fibers.">Transduction of dendritic cells by DNA viral vectors directs the immune response to transgene products in muscle fibers.</a> J. Virol. 72, 4212-4223 (1998).</li><li>Mitchell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-transfected+dendritic+cells+in+cancer+immunotherapy.">RNA-transfected dendritic cells in cancer immunotherapy.</a> J. Clin. Invest. 106, 1065-1069 (2000).</li><li>Mincheff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+transfection+and/or+cross-priming+of+dendritic+cells+following+DNA+and+adenoviral+immunizations+for+immunotherapy+of+cancer-changes+in+peripheral+mononuclear+subsets+and+intracellular+IL-4+and+IFN-gamma+lymphokine+profile.">In vivo transfection and/or cross-priming of dendritic cells following DNA and adenoviral immunizations for immunotherapy of cancer-changes in peripheral mononuclear subsets and intracellular IL-4 and IFN-gamma lymphokine profile.</a> Crit. Rev. Oncol. Hematol. 39, 125-132 (2001).</li><li>Roth, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helper-dependent+adenoviral+vectors+efficiently+express+transgenes+in+human+dendritic+cells+but+still+stimulate+antiviral+immune+responses.">Helper-dependent adenoviral vectors efficiently express transgenes in human dendritic cells but still stimulate antiviral immune responses.</a> J. Immunol. 169, 4651-4656 (2002).</li><li>Tendeloo, V. F. V. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+gene+delivery+by+mRNA+electroporation+in+human+hematopoietic+cells:+superiority+to+lipofection+and+passive+pulsing+of+mRNA+and+to+electroporation+of+plasmid+cDNA+for+tumor+antigen+loading+of+dendritic+cells.">Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells.</a> Blood. 98, 49-56 (2001).</li><li>Lenz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleoporation+of+dendritic+cells:+efficient+gene+transfer+by+electroporation+into+human+monocyte-derived+dendritic+cells.">Nucleoporation of dendritic cells: efficient gene transfer by electroporation into human monocyte-derived dendritic cells.</a> FEBS Lett. 538, 149-154 (2003).</li><li>Prechtel, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+interfering+RNA+(siRNA)+delivery+into+monocyte-derived+dendritic+cells+by+electroporation.">Small interfering RNA (siRNA) delivery into monocyte-derived dendritic cells by electroporation.</a> J. Immunol. Methods. 311, 139-152 (2006).</li><li>Bowles, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+efficient+high-throughput+plasmid+and+siRNA+transfection+of+human+monocyte-derived+dendritic+cells+without+cell+maturation.">Validation of efficient high-throughput plasmid and siRNA transfection of human monocyte-derived dendritic cells without cell maturation.</a> J. Immunol. Methods. , .</li><li>Kato, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+involvement+of+RIG-I+in+antiviral+response.">Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response.</a> Immunity. 23, 19-28 (2005).</li><li>Kato, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+MDA5+and+RIG-I+helicases+in+the+recognition+of+RNA+viruses.">Differential roles of MDA5 and RIG-I helicases in the recognition of RNA viruses.</a> Nature. 441, 101-105 (2006).</li><li>Haller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mx+GTPase+family+of+interferon-induced+antiviral+proteins.">The Mx GTPase family of interferon-induced antiviral proteins.</a> Microbes Infect. 9, 1636-1643 (2007).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

ترنسفكأيشن كفاءة الخلايا الجذعية الأولية السذاجة المهم لتحليل إنتاجية عالية والهندسة العكسية من التهابات المسالك الخليوي في هذه الخلية الرئيسية تتوسط الانتقال فطرية - التكيف المناعي. ومع ذلك ، فإن معظم المحققين وجدت أن هذه الخلايا من الصعب على حد سواء transfect بكفاءة ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> المعدات / الكاشف </th><th> شركة </th><th> كتالوج # </th><th> تعليقات </th></tr><tr><td> Amaxa Nucleofector 96 - جيدا المكوك </td><td> Lonza </td><td> 108S0109 </td><td> رقم متسلسل </td></tr><tr><td> Amaxa الإنسان الوحيدات 96 - جيدا كيت Nucleofector </td><td> Lonza </td><td> VHPA - 2007 </td><td> يحتوي على الوحيدات الإنسان 96 - جيدا الحل Nucleofector ، الملحق 96 - جيدا وNucleocuvettes وألواح </td></tr><tr><td> RIG - I سيرنا </td><td> Dharmacon </td><td> L - 012511-00 </td><td></td></tr><tr><td> GLO سيرنا </td><td> Dharmacon </td><td> D - 001600 - 01 - 20 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875 </td><td> تستكمل مع FCS 10 ٪ ، 2 مم L - الجلوتامين ، 100 U / مل البنسلين و100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين لجعل العاصمة المتوسطة النمو </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td><td></td></tr><tr><td> L - الجلوتامين </td><td> Invitrogen </td><td> 25030081 </td><td></td></tr><tr><td> البنسلين / الستربتوميسين </td><td> Invitrogen </td><td> 15070063 </td><td></td></tr><tr><td> الجنين مصل العجل </td><td> HyClone </td><td> 3070،03 </td><td></td></tr><tr><td> شجيري خلايا </td><td> نيويورك مركز الدم </td><td></td><td> وتنقيته من البلدان النامية المعاطف الشهباء باستخدام إجراء القياسية </td></tr></tbody></table>

optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation

ويمكن اعتبار الخلايا الجذعية (DCS) حراسا للنظام المناعي والتي تلعب دورا حاسما في بدء وردا على العدوى 1. الكشف عن مستضد الممرضة التي السذاجة البلدان النامية من خلال التعرف على الأنماط مستقبلات (PRRs) والتي هي قادرة على الاعتراف هياكل محددة الحفظ ويشار إلى الممرض المرتبطة بأنماط الجزيئي (PAMPS). كشف من قبل البلدان النامية PAMPs مشغلات تسقط إشارات بين الخلايا مما يؤدي إلى تنشيط والتحول إلى البلدان النامية ناضجة. وتتميز عادة هذه العملية من خلال انتاج الانترفيرون من النوع 1 جنبا إلى جنب مع السيتوكينات proinflammatory أخرى ، upregulation من علامات سطح الخلية مثل MHCII وCD86 والهجرة في العاصمة ناضجة لتصريف الغدد الليمفاوية ، حيث التفاعل مع الخلايا التائية يبدأ الاستجابة المناعية التكيفية 2 ، 3. وبالتالي ، DCS ربط أنظمة المناعة الفطرية والتكيفية. القدرة على تشريح الشبكات الجزيئية الكامنة وراء العاصمة ردا على مسببات الأمراض المختلفة ضروري لفهم أفضل لتنظيم هذه المسارات إشارة وجيناتها المستحث. وينبغي أن يساعد أيضا تسهيل تطوير العاصمة مقرا لقاحات ضد الأمراض المعدية والأورام. ومع ذلك ، فقد كان هذا الخط من البحوث أعاق بشدة من جراء صعوبة transfecting البلدان النامية الأولية 4. وعادة ما تستخدم أساليب تنبيغ الفيروس ، مثل نظام lentiviral ، ولكنها تحمل الكثير من القيود مثل التعقيد والمخاطر البيولوجية الخطرة (مع التكاليف المرتبطة بها) 5،6،7،8. بالإضافة إلى ذلك ، وتسليم المنتجات الجين الفيروسي يزيد من استمناع تلك transduced 9،10،11،12 البلدان النامية. وقد استخدمت Electroporation مع نتائج مختلطة 13،14،15 ، ولكن نحن أول من التقرير استخدام بروتوكول ترنسفكأيشن الإنتاجية العالية ، وتثبت بشكل قاطع فائدتها. نحن في هذا التقرير تلخيص وضع بروتوكول تجاري لتحسين الإنتاجية العالية من البلدان النامية ترنسفكأيشن الأولية الإنسان ، مع سمية الخلية محدودة وعدم وجود نضوج العاصمة 16. وكانت الكفاءة ترنسفكأيشن (من البلازميد GFP) وبقاء الخلية أكثر من 50 ٪ و 70 ٪ على التوالي. أنشئت FACS تحليل غياب زيادة في التعبير عن علامات النضج وCD86 MHCII transfected في الخلايا ، في حين تظاهر qRT - PCR لا upregulation من IFNβ. باستخدام هذا البروتوكول electroporation ، ونحن نقدم الدليل على نجاح ترنسفكأيشن البلدان النامية مع سيرنا وفعالة نهدم من الجينات المستهدفة RIG - I ، مفتاح مستقبلات الاعتراف الفيروسي 16،17 في مرنا على حد سواء ، ومستويات البروتين.

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation at JoVE.com

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

نحن حاضرنا الأمثل بروتوكول nucleofection عالية الإنتاجية باعتبارها وسيلة فعالة لtransfecting الوحيدات الإنسان الأساسية المستمدة من الخلايا الجذعية إما مع DNA البلازميد أو سيرنا دون التسبب في نضوج الخلايا. ونحن نقدم أدلة أخرى لإسكات سيرنا الناجح لاستهداف الجينات RIG - I مرنا في كل المستويات والبروتين.

بروتوكول الأمثل لترنسفكأيشن كفاءة الخلايا الجذعية من دون نضوج الخلايا

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

optimized-protocol-for-efficient-transfection-dendritic-cells-without

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

20.2K Views.  Mount Sinai School of Medicine. نحن حاضرنا الأمثل بروتوكول nucleofection عالية الإنتاجية باعتبارها وسيلة فعالة لtransfecting الوحيدات الإنسان الأساسية المستمدة من الخلايا الجذعية إما مع DNA البلازميد أو سيرنا دون التسبب في نضوج الخلايا. ونحن نقدم أدلة أخرى لإسكات سيرنا الناجح لاستهداف الجينات RIG - I مرنا ف...

Video: Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone marrow, spleen, lymph nodes and Peyer's patches 1-3. DCs present in peripheral tissues sample the organism for the presence of antigens, which they take up, process and present in their surface in the context of major histocompatibility molecules (MHC). Then, antigen-loaded DCs migrate to immunological organs where they present the processed antigen to T lymphocytes triggering specific immune responses. One way to evaluate the migratory capabilities of DCs is to label them with fluorescent dyes 4.
Herewith we demonstrate the use of Qdot fluorescent nanocrystals to label murine bone marrow-derived DC. The advantage of this labeling is that Qdot nanocrystals possess stable and long lasting fluorescence that make them ideal for detecting labeled cells in recovered tissues. To accomplish this, first cells will be recovered from murine bone marrows and cultured for 8 days in the presence of granulocyte macrophage-colony stimulating factor in order to induce DC differentiation. These cells will be then labeled with fluorescent Qdots by short in vitro incubation. Stained cells can be visualized with a fluorescent microscopy. Cells can be injected into experimental animals at this point or can be into mature cells upon in vitro incubation with inflammatory stimuli. In our hands, DC maturation did not determine loss of fluorescent signal nor does Qdot staining affect the biological properties of DCs. Upon injection, these cells can be identified in immune organs by fluorescent microscopy following typical dissection and fixation procedures.

Dendritic cells uptake antigens and migrate towards immune organs to present processed antigens to T cells. Qdot nanocrystal labeling provides a long-lasting and stable fluorescent signal. This allows tracking of dendritic cells to different organs by fluorescent microscopy.

جيل ووسمها الفئران خلايا نخاع العظام المستمدة من البلورات النانوية مع شجيري Qdot تتبع للدراسات

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in peripheral tissues in steady state; however in response to antigen stimulation, DCs take up the antigen and rapidly migrate to the draining lymph nodes where they initiate T cell response against the antigen1,2. Additionally, DCs also play a key role in initiating autoimmune as well as allergic immune response3.
DCs play an essential role in both initiation of immune response and induction of tolerance in the setting of lung environment4. Lung environment is largely tolerogenic, owing to the exposure to vast array of environmental antigens5. However, in some individuals there is a break in tolerance, which leads to induction of allergy and asthma. In this study, we describe a strategy, which can be used to monitor airway DC maturation and migration in response to the antigen used for sensitization. The measurement of airway DC maturation and migration allows for assessment of the kinetics of immune response during airway allergic inflammation and also assists in understanding the magnitude of the subsequent immune response along with the underlying mechanisms.
Our strategy is based on the use of ovalbumin as a sensitizing agent. Ovalbumin-induced allergic asthma is a widely used model to reproduce the airway eosinophilia, pulmonary inflammation and elevated IgE levels found during asthma6,7. After sensitization, mice are challenged by intranasal delivery of FITC labeled ovalbumin, which allows for specific labeling of airway DCs which uptake ovalbumin. Next, using several DC specific markers, we can assess the maturation of these DCs and can also assess their migration to the draining lymph nodes by employing flow cytometry.

We describe a strategy to monitor maturation and migration of pulmonary dendritic cells in response to ovalbumin in the setting of ovalbumin induced allergic airway inflammation. This strategy can be modified to assess migration of pulmonary dendritic cells in settings of infection.

تحليل الرئوي نضوج خلية شجيري والهجرة خلال التهاب الشعب الهوائية التحسسي

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied by adverse side effects such as a reduced ability to control infections or malignancies. Therefore, new approaches need to be developed that target only the disease mediating cells and leave the remaining immune system intact. Over the past decade a variety of cell based immunotherapy strategies to modulate T cell mediated immune responses have been developed. Most of these approaches rely on tolerance-inducing antigen presenting cells (APC). However, in addition to being technically difficult and cumbersome, such cell-based approaches are highly sensitive to cytotoxic T cell responses, which limits their therapeutic capacity. Here we present a protocol for the generation of non-cellular killer artificial antigen presenting cells (KaAPC), which allows for the depletion of pathologic T cells while leaving the remaining immune system untouched and functional. KaAPC is an alternative solution to cellular immunotherapy which has potential for treating autoimmune diseases and allograft rejections by regulating undesirable T cell responses in an antigen specific fashion.

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Guidelines are presented for the generation of killer artificial antigen presenting cells, KaAPC, an efficient tool for in vitro depletion of human antigen-specific T cells and an alternative solution to cellular immunotherapy for the treatment of T cell-mediated autoimmune diseases in an antigen-specific fashion without compromising the remaining immune system.

القاتل مستضد تقديم الخلايا الاصطناعي (KaAPC) للكفاءة<em&gt; في المختبر</em&gt; استنفاد خلايا T الإنسان مستضد محددة

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. Transfection with siRNA and plasmid DNA is an efficient tool for studying their function, but transfection of macrophages is not a trivial matter. Although many different approaches for transfection of eukaryotic cells are available, only few allow reliable and efficient transfection of macrophages, but reduced cell vitality and severely altered cell behavior like diminished capability for differentiation or polarization are frequently observed. Therefore a transfection protocol is required that is capable of transferring siRNA and plasmid DNA into macrophages without causing serious side-effects thus allowing the investigation of the effect of the siRNA or plasmid in the context of normal cell behavior. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently transfecting human THP-1 macrophages and monocytes with high cell vitality, high transfection efficiency, and minimal effects on cell behavior. This approach is based on Nucleofection and the protocol has been optimized to maintain maximum capability for cell activation after transfection. The protocol is adequate for adherent cells after detachment as well as cells in suspension, and can be used for small to medium sample numbers. Thus, the method presented is useful for investigating gene regulatory effects during macrophage differentiation and polarization. Apart from presenting results characterizing macrophages transfected according to this protocol in comparison to an alternative chemical method, the impact of cell culture medium selection after transfection on cell behavior is also discussed. The presented data indicate the importance of validating the selection for different experimental settings.

This protocol presents an efficient and reliable method to transfect human THP-1 macrophages with siRNA or plasmid DNA by electroporation with high transfection efficiency while maintaining high cell vitality and full macrophage capacity for differentiation and polarization.

ترنسفكأيشن كفاءة عالية من الإنسان THP-1 الضامة بواسطة Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

على طريقة العائد فعالة وعالية لعزل مجموعات فرعية خلية الفأر الجذعية

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. The immune system is a constant balance in maintaining tolerance to self-molecules and reacting rapidly to pathogens. Dendritic cells (DCs) are powerful professional antigen presenting cells that link the innate immune system to the adaptive immune system and balance the adaptive response between self and non-self. Depending on the maturation signals, immature dendritic cells can be selectively stimulated to differentiate into immunogenic or tolerogenic DCs. Immunogenic dendritic cells provide proliferation signals to antigen-specific T cells for clonal expansion; while tolerogenic dendritic cells regulate tolerance by antigen-specific T-cell deletion or clonal expansion of regulatory T-cells. Due to this unique property, dendritic cells are highly sought after as therapeutic agents for cancer and autoimmune diseases. Dendritic cells can be loaded with specific antigens in vitro and injected into the human body to mount a specific immune response both immunogenic and tolerogenic. This work presents a means to generate in vitro from monocytes, immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), tolerogenic and mature moDCs that differ in surface marker expression, function and metabolic phenotypes.

Immature dendritic cells can be selectively differentiated into tolerogenic or mature dendritic cells to regulate the balance between immunity and tolerance. This work presents a means to generate from immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), in vitro tolerogenic and mature moDCs that differ in metabolic phenotypes.

جيل غير ناضج، ناضج ومولد للتحمل الجذعية خلايا مع اختلاف الاستقلابية الظواهر

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&amp;#945;

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

التنمية والتحقق من جزيء واحد أولتراسينسيتيفي الصفيف الرقمي المرتبط بالانزيم مقايسة الممتز للبشرية انترفيرون-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells

Extracorporeal photochemotherapy (ECP) is a widely used cancer immunotherapy for cutaneous T cell lymphoma (CTCL), operative in over 350 university centers worldwide. While ECP&#8217;s clinical efficacy and exemplary safety profile have driven its widespread use, elucidation of the underlying mechanisms has remained a challenge, partly owing to lack of a laboratory ECP model. To overcome this obstacle and create a simple, user-friendly platform for ECP research, we developed a scaled-down version of the clinical ECP leukocyte-processing device, suitable for work with both mouse models, and small human blood samples. This device is termed the Transimmunization (TI) chamber, or plate. In a series of landmark experiments, the miniaturized device was used to produce a cellular vaccine that regularly initiated therapeutic anti-cancer immunity in several syngeneic mouse tumor models. By removing individual factors from the experimental system and ascertaining their contribution to the in vivo anti-tumor response, we then elucidated key mechanistic drivers of ECP immunizing potential. Collectively, our results revealed that anti-tumor effects of ECP are initiated by dendritic cells (DC), physiologically generated through blood monocyte interaction with platelets in the TI plate, and loaded with antigens from tumor cells whose apoptotic cell death is finely titrated by exposure to the photoactivatable DNA cross-linking agent 8-methoxypsoralen and UVA light (8-MOPA). When returned to the mouse, this cellular vaccine leads to specific and transferable anti-tumor T cell immunity. We verified that the TI chamber is also suitable for human blood processing, producing human DCs fully comparable in activation state and profile to those derived from the clinical ECP chamber. The protocols presented here are intended for ECP studies in mouse and man, controlled generation of apoptotic tumor cells with 8-MOPA, and rapid production of physiologic human and mouse monocyte-derived DCs for a variety of applications.

The transimmunization (TI) device or plate and related protocols have been developed to replicate the key features of extracorporeal photochemotherapy (ECP), in an experimental setting, allowing for production of physiologically activated, tunable dendritic cells (DCs) for cancer immunotherapy.

بروتوكول جديد لتوليد الخلايا العصبية المناعية الفسيولوجية

Extracorporeal photochemotherapy (ECP) is a widely used cancer immunotherapy for cutaneous T cell lymphoma (CTCL), operative in over 350 university ...

Single-cell Screening Method for the Selection and Recovery of Antibodies with Desired Specificities from Enriched Human Memory B Cell Populations

The human antibody repertoire represents a largely untapped source of potential therapeutic antibodies and useful biomarkers. While current computational methods, such as next generation sequencing (NGS), yield enormous sets of data on the antibody repertoire at the sequence level, functional data is required to identify which sequences are relevant for a particular antigen or set of antigens. Here, we describe a method to identify and recover individual antigen-specific antibodies from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from a human blood donor. This method utilizes an initial enrichment of mature B cells and requires a combination of phenotypic cell markers and fluorescently-labeled protein to isolate IgG memory B cells via flow cytometry. The heavy and light chain variable regions are then cloned and re-screened. Although limited to the memory B cell compartment, this method takes advantage of flow cytometry to interrogate millions of B cells and returns paired heavy and light chain sequences from a single cell in a format ready for expression and confirmation of specificity. Antibodies recovered with this method can be considered for therapeutic potential, but can also link specificity and function with bioinformatic approaches to assess the B cell repertoire within individuals.

The BSelex method to identify and recover individual antigen-specific antibodies from human peripheral blood mononuclear cells combines flow cytometry with single cell PCR and cloning.

طريقة فحص خلية واحدة لاختيار واستعادة الأجسام المضادة مع الخصائص المطلوبة من الذاكرة البشرية المخصب B مجموعات الخلايا

The human antibody repertoire represents a largely untapped source of potential therapeutic antibodies and useful biomarkers. While current computational ...

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern recognition receptors (PRRs). Unfortunately, this also makes macrophages particularly challenging to transfect as the transfection reagent and the transfected nucleic acids are often recognized by the PRRs as non-self. Therefore, transfection often results in macrophage activation and degradation of the transfected nucleic acids or even in suicide of the macrophages. Here, we describe a protocol that allows highly efficient transfection of murine primary macrophages such as peritoneal macrophages (PM) and bone marrow-derived macrophages (BMDM) with mRNA in vitro transcribed from DNA templates such as plasmids. With this simple protocol, transfection rates of about 50-65% for PM and about 85% for BMDM are achieved without cytotoxicity or immunogenicity observed. We describe in detail the generation of mRNA for transfection from DNA constructs such as plasmids and the transfection procedure.

Macrophages, especially primary macrophages, are challenging to transfect as they specialize in detecting molecules of non-self origin. We describe a protocol that allows highly efficient transfection of primary macrophages with mRNA generated from DNA templates such as plasmids.

النقل عاليه الكفاءة من الضامة الابتدائية مع في المختبر كتب mRNA

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...