فإن الكتاب أود أن أنوه مايكل تشو، بينغ بينغ داي، ويانغ شياو للمساهمة بتقديم البيانات لهذه المخطوطة. ونحن نعترف أيضا الدكتور جون غراي لهدايا سخية من الكواشف المستخدمة في هذه الدراسة. معتمد من قبل PB زمالة ما بعد الدكتوراه من المركز الوطني للسرطان. وأيد هذا البحث من المنح المقدمة من المعهد الوطني للصحة (R01AI68978، P01CA132681 وRCA170820A)، منحة من مؤسسة بيل وميليندا غيتس، منحة تسريع متعدية من المركز المشترك للطب بالحركة ومنحة من كاليفورنيا فيروس نقص المناعة البشرية / الإيدز برنامج البحوث.

هي التي شيدت DC-LV الخلايا المنتجة مستقرة استنادا إلى خلية التعبئة والتغليف GPR 11 السطر الذي يحتوي على المكونات اللازمة lentiviral gagpol، ومراجعة ونظام تيت حالا. أولا، يتم استخدام تنبيغ فيروسات لتوليد جي بي آر إس خط خلية التعبئة والتغليف الذي يشفر بروتين سكري SVGmu تيت التي تعتمد على. ثم، يتم استخدام متسلسل ترنسفكأيشن مجموعة ل transfect خط الخلية جي بي آر إس مع التحوير ناقلات lentiviral مثل GFP. هذا خط الخلية المنتجة مستقرة، تسمى LV-MGFP، يمكن اختبارها في المختبر والمجراة لقدرته على إنتاج لقاح DC-LV ضد GFP. 1. توليد تيت التي تعتمد على خط الخلية SVGmu البلازميد PRX-SVGmu هو بناء التي يتم استنساخ SVGmu بروتين سكري DC-محددة المصب من المروج نقل واكتساب التكنولوجيا المتقدمة من فيروسات البلازميد pRetroX-تيت حالا 1 (الشكل 1C). ثقافة 293T الخلايا في D10 (متوسطة Dulbecco لتعديل النسر مع10٪ مصل بقري جنيني، 2 مم L-الجلوتامين). ثقافة GPR خط خلية التعبئة والتغليف في D10 مع الدوكسيسيكلين (1 نانوغرام / مل) وبوروميسين (2 ميكروغرام / مل). يتم استزراع جميع الخلايا في ترطيب الحاضنة 37 درجة مئوية مع نسبة 5٪ CO 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 16-18 ساعة قبل ترنسفكأيشن عابرة، لوحة 2 × 10 6 خلايا 293T في 4 مل من D10 في 6 سم، والأنسجة صحن الثقافة مثل أن الخلايا تقترب من 90٪ confluency في وقت ترنسفكأيشن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترنسفكأيشن من البلازميدات فيروسات: مزيج 100 ميكرولتر 1.25 M و CaCl 2 الحل، الماء المعقم ملي-Q والبلازميدات التالية: 5 ميكروغرام PRX-SVGmu، 2.5 ميكروغرام pGag بول، و 2.5 ميكروغرام pVSV-G. الحجم النهائي هو 500 ميكرولتر. لمل أنبوب البوليسترين جولة القاع 5، إضافة 500 ميكرولتر 2X HBS (50 HEPES ملي و 10 ملي بوكل، 12 ملم سكر العنب، 280 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1.5 ملي نا 2 هبو 4 * 7H 2 O، ودرجة الحموضة 7.05). إضافة قطرة قطرة خليط البلازميد في المخزن المؤقت HBS 2X بينما محتدما المخزن المؤقت بقوة مع كوب باستور ماصة. بعد إضافة ميلxture، يستمر محتدما لآخر 30 ثانية. ثم، يضاف خليط كله على الخلايا 293T في طبق ثقافة 6 سم، واحتضان عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4 ساعة بعد ترنسفكأيشن، استبدال بعناية المتوسطة في الطبق الثقافة مع 4 مل D10 قبل ساخنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور عدوى: 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن، حصاد SVGmu ترميز جسيمات فيروس في طاف عن طريق تمرير طاف من خلال مرشح 0.45 ميكرون. لوحة الخلايا التعبئة والتغليف GPR في صحن 24 أيضا في 2 × 10 4 خلايا / جيد. إضافة تصفيتها طاف للخلايا التعبئة والتغليف GPR في طبق (2 مل / جيد) والخلايا الطرد المركزي لمدة 90 دقيقة في 1،050 XG و 25 درجة مئوية. تغيير المتوسطة في D10 جديدة مع الدوكسيسيكلين (1 نانوغرام / مل) بعد زيادة ونقصان العدوى (2 مل / جيد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 72 ساعة بعد ترنسفكأيشن، وتوسيع ثقافة ترانسدوسيد الخلايا التعبئة والتغليف في D10 مع الدوكسيسيكلين (1 نانوغرام / مل) وبوروميسين (2 نانوغرام / مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتأكيد التعبير عن SVGmu والثقافة الخلايا دون الدوكسيسيكلين لمدة 48 ساعة. قياس السابقين سطحاالكتئاب من SVGmu مع التدفق الخلوي باستخدام مصل مضاد للسندبيس. وتتم تسمية هذه الخلايا كما جي بي آر إس خط خلية التعبئة والتغليف. </li></ol> 2. بناء خلايا المنتج DC-LV بواسطة متسلسل ترنسفكأيشن صفيف نقل Lentiviral البلازميد TL20-GFP هو تعطيل الذاتي lentiviral نقل ناقلات البلازميد على أساس pCL20c-MSCV-GFP مع الفيروسي RNA نظام التعبير الجينوم دوكس-regulatable واستبدال الفيروس المضخم للخلايا (CMV) محسن مع 7 تيت مشغلي (الشكل 1C) 11 ، 12،15. البلازميد PGK-بلي هو مقاومة (بلي) كاسيت بليوميسين يقودها ضعيفة المروج PGK 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملخص 20 ميكروغرام البلازميد TL20-GFP مع تقييد انزيم SfiI في 50 درجة مئوية. ملخص 20 ميكروغرام البلازميد PGK-بلي مع PflMI عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية شظايا الحمض النووي (الكاسيت PGK-بلي هو 1011 BP وناقلات TL20-GFP هو 6861 BP) بواسطة الاغاروز الكهربائي للهلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ligate متجه TL20-GFP وPGK-كاسيت بلي في نسبة المولي من 25:1 (نب يغاز DNA T4). احتضان بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ربط بين عشية وضحاها، وتنقية الحمض النووي من خليط ربط (QIAGEN DNeasy الدم والأنسجة كيت). ضمان كمية من الحمض النووي المنقى حوالي 5 ميكروغرام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 16-18 ساعة قبل ترنسفكأيشن، لوحة الخلايا التعبئة والتغليف جي بي آر إس في 6 سم، والأنسجة صحن الثقافة بحيث confluency ستكون حوالي 90٪ في وقت ترنسفكأيشن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الأسلوب ترنسفكأيشن فوسفات الكالسيوم هو موضح في الخطوة 1.2 ل transfect 5 ميكروغرام من الحمض النووي concatemeric المنقاة الخلايا التعبئة والتغليف جي بي آر إس في 6 سم صحن زراعة الأنسجة. 4 ساعة بعد ترنسفكأيشن، وإزالة بعناية المتوسطة واستبدالها مع 4 مل D10 قبل ساخنة مع الدوكسيسيكلين (1 نانوغرام / مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن، تغيير المتوسطة في D10 مع الدوكسيسيكلين (1 نانوغرام / مل) وبوروميسين (2 ميكروغرام / مل). اختر لاستنساخ transfected بإضافة zeocin (50 ميكروغرام / مل) في ثقافة المتوسط. ثقافة الخلايا لمدة حوالي 2 أسابيع حتى الخلية كولونيويمكن رؤية ES في الجزء السفلي من الأطباق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمية المستعمرات الخلية في الجزء السفلي من الأطباق. تأخذ 24 أيضا أطباق زراعة الأنسجة، وعدد الآبار وإضافة إلى كل بئر 2 مل D10 تحتوي على zeocin (50 ميكروغرام / مل)، الدوكسيسيكلين (1 نانوغرام / مل)، وبوروميسين (2 ميكروغرام / مل). نضح المتوسطة من الخلايا ترانسدوسيد، ثم إضافة قطرة واحدة من التربسين على كل من المستعمرات لأقل من دقيقة واحدة. ثم، إضافة واحد أو أكثر من قطرات D10 على نفس المستعمرات. التقاط المستعمرات واحدا تلو الآخر مع ماصة ونقلها إلى آبار منفصلة من 24 جيدا نسيج لوحة الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الثقافة وتوسيع جميع الحيوانات المستنسخة خلية في D10 تحتوي على zeocin (50 ميكروغرام / مل)، الدوكسيسيكلين (1 نانوغرام / مل) وبوروميسين (2 ميكروغرام / مل) لتقييم القدرة المنتجة الفيروسية. </li></ol> 3. تقييم الانتاج الفيروسية من كل استنساخ الخلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعرض للتريبسين الخلايا المنتجة وحول لوحة 4x10 6 خلايا في 6 سم، والأنسجة صحن الثقافة في D10 دون الدوكسيسيكلين بحيث confluencyيتجاوز 90٪. استبدال المتوسطة مع D10 قبل ساخنة طازجة يوميا وجمع المتوسطة للمقايسة عيار 72 ساعة بعد إزالة دوكس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد طاف الفيروسية من خلال تصفية المتوسطة مع مرشح 0.45 ميكرون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلايا المستهدفة لوحة تعبر عن مستقبلات DC-SIGN (على سبيل المثال 293T.hDC في التوقيع أو نخاع العظام المستمدة الماوس الخلايا الجذعية 16) و293T كعنصر تحكم السلبية في أطباق ثقافة 96 جيدا، 1 × 10 4 خلايا / جيد. إضافة التخفيفات التسلسلي 2 أضعاف من طاف الفيروسية إلى الآبار (100 ميكرولتر / جيد). عادة، 6-8 التخفيفات كافية للوصول إلى النطاق الذي ترانسدوسيد GFP إيجابية الخلايا هي في وجود علاقة خطية لكمية من الفيروس المضافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي الخلايا واستبدال المتوسطة كما هو موضح في الخطوة 1.4. يجب أن يكون مثقف BMDCs في RPMI المتوسطة مع FBS 10٪ و GM-CSF (1:20 J558L المتوسطة مكيفة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس التعبير GFP في ترانسدوسيد الخلايا عن طريق التدفق الخلوي 4-6 أيام بعد تنبيغ. وvecto lentiviralيتم احتساب R عيار في نطاق تخفيف ناقلات عندما تكون النسبة المئوية للخلايا GFP إيجابية وكمية النواقل هما في وجود علاقة خطية. اختر استنساخ الخلية وفقا لأعلى الانتاج الفيروسية للتطبيقات اللاحقة. </li></ol> 4. إنتاج والتركيز ناقلات lentiviral <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة خط الخلية المنتج (LV-MGFP) في 15 سم أطباق زراعة الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعرض للتريبسين الخلايا والخلايا المنتجة لوحة في 15 سم أطباق زراعة الأنسجة في أكثر من 90٪ confluency في D10 طازج بدون الدوكسيسيكلين. تغيير المتوسطة مع الطازجة، D10 قبل ساخنة يوميا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في وقت الذروة الانتاج الفيروسية (كما هو محدد من قبل المستخدم)، والحصاد طاف الفيروسية وتحديد ذلك باستخدام فلتر 0.45 ميكرون. تحميل طاف تصفيتها في الجدار السميك 32.5 مل أنابيب نابذة فائقة السرعة، وختم مع parafilm والطرد المركزي في XG 50،000، 4 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. resuspend بدقة بيليه في 50 ميكرولتر أو حجم مناسب من برنامج تلفزيوني أو HBSS اعتمادا على التطبيق. &lt;/ لى&gt; </ol> 5. تحصين الفئران في الجسم الحي وتحليل الاستجابة المناعية مستضد محددة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنتاج فيروس عيار عالية كما هو موضح في القسم 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن الفئران BALB / ج (6-8 أسبوع من العمر، أنثى) عن طريق المسار قاطع الطريق مع تعليق النواقل (25 ميكرولتر لكل قاطع الطريق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 2 أسابيع التحصين، وعزل الطحال وsplenocytes الحصاد. splenocytes الثقافة مع GFP الببتيدات حاتمة وتحليل وجود GFP محددة CD8 + الخلايا التائية باستخدام الخلايا تلطيخ خلوى، كما هو موضح سابقا 17 (الشكل 3B). </li></ol>

<ol>
	<li>Naldini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector.">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272, 263-267 (1996).</li><li>Kootstra, N. A., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+with+viral+vectors.">Gene therapy with viral vectors.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 43, 413-439 (2003).</li><li>Montini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+gene+transfer+in+a+tumor-prone+mouse+model+uncovers+low+genotoxicity+of+lentiviral+vector+integration.">Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration.</a> Nat. Biotechnol. 24, 687-696 (2006).</li><li>Montini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genotoxic+potential+of+retroviral+vectors+is+strongly+modulated+by+vector+design+and+integration+site+selection+in+a+mouse+model+of+HSC+gene+therapy.">The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of HSC gene therapy.</a> J. Clin. Invest. 119, 964-975 (1172).</li><li>Hu, B., Tai, A., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+delivered+by+lentiviral+vectors+for+cancer+and+infectious+diseases.">Immunization delivered by lentiviral vectors for cancer and infectious diseases.</a> Immunological Reviews. 239, 45-61 (2011).</li><li>Broussau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+packaging+cells+for+large-scale+production+of+lentiviral+vectors+in+serum-free+suspension+culture.">Inducible packaging cells for large-scale production of lentiviral vectors in serum-free suspension culture.</a> Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 500-507 (2008).</li><li>Cockrell, A. S., Ma, H., Fu, K., McCown, T. J., Kafri, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+trans-lentiviral+packaging+cell+line+for+high-titer+conditional+self-inactivating+HIV-1+vectors.">A trans-lentiviral packaging cell line for high-titer conditional self-inactivating HIV-1 vectors.</a> Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 14, 276-284 (2006).</li><li>Ikeda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+high-titer+HIV-1+vector+production.">Continuous high-titer HIV-1 vector production.</a> Nature Biotechnology. 21, 569-572 (2003).</li><li>Kafri, T., van Praag, H., Ouyang, L., Gage, F. H., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+packaging+cell+line+for+lentivirus+vectors.">A packaging cell line for lentivirus vectors.</a> Journal of Virology. 73, 576-584 (1999).</li><li>Strang, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+type+1+vectors+with+alphavirus+envelope+glycoproteins+produced+from+stable+packaging+cells.">Human immunodeficiency virus type 1 vectors with alphavirus envelope glycoproteins produced from stable packaging cells.</a> Journal of Virology. 79, 1765-1771 (2005).</li><li>Throm, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+construction+of+producer+cell+lines+for+a+SIN+lentiviral+vector+for+SCID-X1+gene+therapy+by+concatemeric+array+transfection.">Efficient construction of producer cell lines for a SIN lentiviral vector for SCID-X1 gene therapy by concatemeric array transfection.</a> Blood. 113, 5104-5110 (2009).</li><li>Lee, C. L., Chou, M., Dai, B., Xiao, L., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+stable+producer+cells+to+make+high-titer+lentiviral+vectors+for+dendritic+cell-based+vaccination.">Construction of stable producer cells to make high-titer lentiviral vectors for dendritic cell-based vaccination.</a> Biotechnol. Bioeng. 109, 1551-1560 (2012).</li><li>Steinman, R. M., Banchereau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+dendritic+cells+into+medicine.">Taking dendritic cells into medicine.</a> Nature. 449, 419-426 (2007).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+lentivector+targeting+of+dendritic+cells+for+in+vivo+immunization.">Engineered lentivector targeting of dendritic cells for in vivo immunization.</a> Nature Biotechnology. 26, 326-334 (2008).</li><li>Hanawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+rhesus+repopulating+hematopoietic+stem+cells+using+a+simian+immunodeficiency+virus-based+lentiviral+vector+system.">Efficient gene transfer into rhesus repopulating hematopoietic stem cells using a simian immunodeficiency virus-based lentiviral vector system.</a> Blood. 103, 4062-4069 (2004).</li><li>Yang, L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+provision+of+antigen-specific+T+cell+immunity+by+programming+hematopoietic+stem+cells.">Long-term in vivo provision of antigen-specific T cell immunity by programming hematopoietic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4518-4523 (2005).</li><li>Dai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Gag-specific+immunity+induced+by+a+lentivector-based+vaccine+directed+to+dendritic+cells.">HIV-1 Gag-specific immunity induced by a lentivector-based vaccine directed to dendritic cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20382-20387 (2009).</li><li>Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+lentiviral+vectors+for+transducing+cells+from+the+central+nervous+system.">Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system.</a> J. Vis. Exp. (63), e4031 (2012).</li><li>Kochan, G., Escors, D., Stephenson, H., Breckpot, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Grade+Lentiviral+Vectors.">Clinical Grade Lentiviral Vectors.</a> Lentiviral Vectors and Gene Therapy. , 69-85 (2012).</li><li>Loew, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+PG13-based+packaging+cell+line+for+stable+production+of+clinical-grade+self-inactivating+gamma-retroviral+vectors+using+targeted+integration.">A new PG13-based packaging cell line for stable production of clinical-grade self-inactivating gamma-retroviral vectors using targeted integration.</a> Gene Ther. 17, 272-280 (2010).</li><li>Gaspar, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+of+X-linked+severe+combined+immunodeficiency+by+use+of+a+pseudotyped+gammaretroviral+vector.">Gene therapy of X-linked severe combined immunodeficiency by use of a pseudotyped gammaretroviral vector.</a> Lancet. 364, 2181-2187 (2004).</li><li>Cornetta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-competent+lentivirus+analysis+of+clinical+grade+vector+products.">Replication-competent lentivirus analysis of clinical grade vector products.</a> Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 557-566 (2011).</li><li>Stewart, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stable+producer+cell+line+for+the+manufacture+of+a+lentiviral+vector+for+gene+therapy+of+Parkinson's+disease.">A stable producer cell line for the manufacture of a lentiviral vector for gene therapy of Parkinson's disease.</a> Human Gene Therapy. 22, 357-369 (2011).</li><li>Coroadinha, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrovirus+producer+cell+line+metabolism:+implications+on+viral+productivity.">Retrovirus producer cell line metabolism: implications on viral productivity.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 72, 1125-1135 (2006).</li></ol>

<p class="jove_content"&gt; تعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.</p

هنا، لدينا الخطوط العريضة لطريقة لإنتاج كميات كبيرة من ناقلات lentiviral باستخدام 293T الخلايا ترانسدوسيد ثابت مع جميع المكونات lentiviral تحت تيت قبالة نظام التنظيمية. حتى الآن، معظم بروتوكولات لإنتاج ناقلات lentiviral الاعتماد على معيار فوسفات الكالسيوم ترنسفكأيشن عابرة (انظر <su...

وقد تم تطوير العديد من أنظمة ناقلات لتوصيل الجينات. وكانت الناقلة على أساس lentiviruses بين نظام الفيروسية الأكثر شيوعا درس. هذه النواقل هي مفيدة لأنها يمكن أن تنبيغ بكفاءة سواء بتقسيم وغير تقسيم الخلايا 1، وتحقيق التعبير على المدى الطويل بسبب الاندماج في الجينوم المضيف، يحمل منخفض الطبيعية الحصانة مكافحة النواقل في معظم المجتمعات البشرية 2، ولها قدرة منخفضة على السمية الجينية من الطفرات غرزي 3،4. كان دائما الملونة إنتاج lentiviruses بواسطة مخاوف تتعلق بالسلامة. وتستمد ناقلات lentiviral عموما من HIV-1، والعامل المسبب لمرض الإيدز. ترنسفكأيشن عابرة من المكونات الفردية للlentivector (نقل، مغلف، والبلازميدات التعبئة والتغليف) هو وسيلة مشتركة ومرنة لإيصال المادة الوراثية في بيئة معملية. ومع ذلك، ورفع مستوى transfections عابرة للتطبيقات السريرية هي مرهقة وأماهY يؤدي إلى تطوير الفيروسة البطيئة النسخ المتماثل المختصة 5،6. للتغلب على هذه العقبات، وقد وضعت العديد من التعبئة والتغليف وخطوط الخلية مستقرة المنتجة 6-11. واحد من هذه الخطوط، خط التعبئة والتغليف GPR 11، لديه ميزة جذابة من يجري تنظيمها من قبل التتراسيكلين. في هذه الورقة، ونحن لشرح كيفية التكيف مع هذا النظام لإنتاج تعطيل الذاتي ناقلات lentiviral التي تستهدف على وجه التحديد نحو الخلايا الجذعية (DC-لفس) 12. الخلايا الجذعية (DCS) هي الأكثر قوة مستضد تقديم الخلايا في الجهاز المناعي. وقد كانت موضع اهتمام كبير في تطوير لقاح السرطان لأنها تشرع مباشرة، برنامج، وتنظيم الاستجابات المناعية ورم محددة 13. دمج بروتوكول التطعيم لتشمل البلدان النامية لديه القدرة على استثارة استجابة مناعية أقوى انتيتومور من اللقاحات الببتيد أو الحمض النووي. مؤخرا، قمنا بتطوير ناقلات lentiviral أن specificallY يستهدف الخلايا الجذعية من خلال بروتين سكري فيروس سندبيس تعديل، SVGmu 14. هذه النواقل هي فريدة من نوعها من حيث أنها تظهر خصوصية عالية للخلايا الجذعية وتوليد استجابات مناعية أقوى من غير محدد، ناقلات VSVG-pseudotyped. هنا، ونحن التقرير وسيلة لإنتاج كميات كبيرة من هذه ناقلات lentiviral DC-المستهدفة. علينا أن نظهر أن هذه DC-لفس يمكن أن تصيب البلدان النامية وتولد قوية CD8 + T خلية الاستجابات المناعية. تم تنفيذ كافة الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات بطريقة إنسانية، بموجب موافقة من USC Intitutional رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام. من أجل أداء في التجارب المجراة والسريرية، فمن الأهمية بمكان لإنشاء خط الخلية التي يمكن أن تنتج فيروس في آن وعيار عالية. وتنفيذ الخطوات تنبيغ وترنسفكأيشن تماما كما هو موضح تعظيم فرص توليد هذا استنساخ.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Mediatech Inc.</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Mediatech Inc.</td>
			<td>25-005-Cl</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Clontech Laboratories, Inc.</td>
			<td>631311</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Zeocin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R250-01</td>
			<td>Toxic</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DNeasy Blood &amp; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

a tetracycline-regulated cell line produces high-titer lentiviral vectors that specifically target dendritic cells

ناقلات lentiviral (لفس) هي وسيلة قوية لإيصال المادة الوراثية لأنواع عديدة من الخلايا. بسبب مخاوف تتعلق بالسلامة المرتبطة بهذه ناقلات المستمدة HIV-1، وتنتج كميات كبيرة من لفس يمثل تحديا. في هذه الورقة، ونحن التقرير وسيلة لإنتاج التتر عالية من لفس-تعطيل الذاتي. نحن retrovirally تنبيغ تيت حالا الخلية المنتجة مستقرة خط GPR لتوليد خط الخلية، جي بي آر إس، والتي يمكن أن تعبر عن جميع مكونات الفيروسية، بما في ذلك بروتين سكري خلية محددة شجيري، SVGmu. ثم، ونحن نستخدم ترنسفكأيشن الحمض النووي concatemeric ل transfect نقل LV ترميز البلازميد GFP الجينات مراسل في تركيبة مع علامة اختيار. العديد من الحيوانات المستنسخة مما يمكن ان تنتج LV في عيار 10 أضعاف أكبر من ما نحقق مع ترنسفكأيشن عابرة. بالاضافة الى ذلك، هذه الفيروسات تنبيغ كفاءة الخلايا الجذعية في المختبر، وإنشاء خلية T استجابة مناعية قوية للمستضد مراسلنا. قد يكون هذا الأسلوب FO خيار جيدR إنتاج اللقاحات قوية قائمة على LV للدراسات السريرية للسرطان أو أمراض معدية.

خط الخلية مستقرة وصفها في هذا الأسلوب يمكن أن تنتج كميات كبيرة من ناقلات lentiviral التي تستهدف على وجه التحديد إلى الخلايا الجذعية. كما هو مبين في الشكل 1B، أسفرت عن عزل الحيوانات المستنسخة الفردية خطوط الخلايا مستقرة متفاوتة الجودة 12. بين 26 استنساخ اختبار?...

Watch this Scientific Journal Video about A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells at JoVE.com

A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells

هنا، ونحن نستخدم تنبيغ فيروسات وترنسفكأيشن concatemeric لإنشاء خط الخلية التي يمكن أن تعبر عن مكونات ناقلات lentiviral (LV) في غياب التتراسيكلين. هذا LV بترميز GFP وpseudotyped مع بروتين سكري، SVGmu، والتي هي محددة لمستقبلات على الخلايا الجذعية.

خط خلية التتراسيكلين التنظيم وتنتج ناقلات lentiviral عالي عيار التي تستهدف على وجه التحديد خلايا الجذعية

Lentiviral  vectors (LVs) are a powerful means of delivering genetic material to many types  of cells. Because of safety concerns associated with these ...

a-tetracycline-regulated-cell-line-produces-high-titer-lentiviral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.4K Views.  University of Southern California, Los Angeles. هنا، ونحن نستخدم تنبيغ فيروسات وترنسفكأيشن concatemeric لإنشاء خط الخلية التي يمكن أن تعبر عن مكونات ناقلات lentiviral (LV) في غياب التتراسيكلين. هذا LV بترميز GFP وpseudotyped مع بروتين سكري، SVGmu، والتي هي محددة لمستقبلات على الخلايا الجذعية.

Video: A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection of pathogenic antigen by na&iuml;ve DCs is through pattern recognition receptors (PRRs) which are able to recognize specific conserved structures referred to as pathogen-associated molecular patterns (PAMPS). Detection of PAMPs by DCs triggers an intracellular signaling cascade resulting in their activation and transformation to mature DCs. This process is typically characterized by production of type 1 interferon along with other proinflammatory cytokines, upregulation of cell surface markers such as MHCII and CD86 and migration of the mature DC to draining lymph nodes, where interaction with T cells initiates the adaptive immune response2,3. Thus, DCs link the innate and adaptive immune systems. 
The ability to dissect the molecular networks underlying DC response to various pathogens is crucial to a better understanding of the regulation of these signaling pathways and their induced genes. It should also help facilitate the development of DC-based vaccines against infectious diseases and tumors. However, this line of research has been severely impeded by the difficulty of transfecting primary DCs4.
Virus transduction methods, such as the lentiviral system, are typically used, but carry many limitations such as complexity and bio-hazardous risk (with the associated costs)5,6,7,8. Additionally, the delivery of viral gene products increases the immunogenicity of those transduced DCs9,10,11,12. Electroporation has been used with mixed results13,14,15, but we are the first to report the use of a high-throughput transfection protocol and conclusively demonstrate its utility.
In this report we summarize an optimized commercial protocol for high-throughput transfection of human primary DCs, with limited cell toxicity and an absence of DC maturation16. Transfection efficiency (of GFP plasmid) and cell viability were more than 50% and 70% respectively. FACS analysis established the absence of increase in expression of the maturation markers CD86 and MHCII in transfected cells, while qRT-PCR demonstrated no upregulation of IFN&beta;. Using this electroporation protocol, we provide evidence for successful transfection of DCs with siRNA and effective knock down of targeted gene RIG-I, a key viral recognition receptor16,17, at both the mRNA and protein levels.

We present our optimized high-throughput nucleofection protocol as an efficient way of transfecting primary human monocyte-derived dendritic cells with either plasmid DNA or siRNA without causing cell maturation. We further provide evidence for successful siRNA silencing of targeted gene RIG-I at both the mRNA and protein levels.

بروتوكول الأمثل لترنسفكأيشن كفاءة الخلايا الجذعية من دون نضوج الخلايا

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

إدخال إجهاد القص في دراسة الالتصاق الجرثومي

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

عزل خلايا الرئة ماوس شجيرى

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

توسيع الخلايا اللمفاوية T السامة للخلايا من دم الحبل السري أن الفيروس المضخم للخلايا الهدف، فيروس ابشتاين بار، واتش

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) have greatly improved our ability to study physiological or pathological processes in living organisms. MRI is also proving to be a valuable tool for capturing transplanted cells in vivo. Initial cell labeling strategies for MRI made use of contrast agents that influence the MR relaxation times (T1, T2, T2*) and lead to an enhancement (T1) or depletion (T2*) of signal where labeled cells are present. T2* enhancement agents such as ultrasmall iron oxide agents (USPIO) have been employed to study cell migration and some have also been approved by the FDA for clinical application. A drawback of T2* agents is the difficulty to distinguish the signal extinction created by the labeled cells from other artifacts such as blood clots, micro bleeds or air bubbles. In this article, we describe an emerging technique for tracking cells in vivo that is based on labeling the cells with fluorine (19F)-rich particles. These particles are prepared by emulsifying perfluorocarbon (PFC) compounds and then used to label cells, which subsequently can be imaged by 19F MRI. Important advantages of PFCs for cell tracking in vivo include (i) the absence of carbon-bound 19F in vivo, which then yields background-free images and complete cell selectivityand(ii) the possibility to quantify the cell signal by 19F MR spectroscopy.

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Tracking of cells using MRI has gained remarkable attention in the past years. This protocol describes the labeling of dendritic cells with fluorine (19F)-rich particles, the in vivo application of these cells, and monitoring the extent of their migration to the draining lymph node with 19F/1H MRI and 19F MRS.

رصد هجرة الخلايا الجذعية باستخدام<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H التصوير بالرنين المغناطيسي

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H mice using ALDEFLUOR/ALDH as a marker, and tested their immunogenicity using the cell lysate as a source of antigens to pulse dendritic cells (DCs). DCs pulsed with ALDHhigh CSC lysates induced significantly higher protective antitumor immunity than DCs pulsed with the lysates of unsorted whole tumor cell lysates in both models and in a lung metastasis setting and a s.c.&#160;tumor growth setting, respectively. This phenomenon was due to CSC vaccine-induced humoral as well as cellular anti-CSC responses. In particular, splenocytes isolated from the host subjected to CSC-DC vaccine produced significantly higher amount of IFN&#947; and GM-CSF than splenocytes isolated from the host subjected to unsorted tumor cell lysate pulsed-DC vaccine. These results support the efforts to develop an autologous CSC-based therapeutic vaccine for clinical use in an adjuvant setting.

Evaluated in syngeneic immunocompetent hosts, cancer stem cell (CSC) based dendritic cell (DC) vaccine demonstrated significantly higher antitumor immunity than traditional DC vaccines pulsed with heterogeneous bulk tumor cells.

جيل من لقاح جديد للخلايا التشجرية باستخدام الميلانوما والخلايا الجذعية السرطانية الحرشفية

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

عزل الخلايا الجذعية متعلق بالنخاع الشوكي والخلايا الظهارية من الغدة الصعترية الإنسان

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. The immune system is a constant balance in maintaining tolerance to self-molecules and reacting rapidly to pathogens. Dendritic cells (DCs) are powerful professional antigen presenting cells that link the innate immune system to the adaptive immune system and balance the adaptive response between self and non-self. Depending on the maturation signals, immature dendritic cells can be selectively stimulated to differentiate into immunogenic or tolerogenic DCs. Immunogenic dendritic cells provide proliferation signals to antigen-specific T cells for clonal expansion; while tolerogenic dendritic cells regulate tolerance by antigen-specific T-cell deletion or clonal expansion of regulatory T-cells. Due to this unique property, dendritic cells are highly sought after as therapeutic agents for cancer and autoimmune diseases. Dendritic cells can be loaded with specific antigens in vitro and injected into the human body to mount a specific immune response both immunogenic and tolerogenic. This work presents a means to generate in vitro from monocytes, immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), tolerogenic and mature moDCs that differ in surface marker expression, function and metabolic phenotypes.

Immature dendritic cells can be selectively differentiated into tolerogenic or mature dendritic cells to regulate the balance between immunity and tolerance. This work presents a means to generate from immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), in vitro tolerogenic and mature moDCs that differ in metabolic phenotypes.

جيل غير ناضج، ناضج ومولد للتحمل الجذعية خلايا مع اختلاف الاستقلابية الظواهر

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. Among them, reversible lysine acetylation is one of the most widely distributed in all domains of life. Although numerous mass spectrometry-based acetylome studies have been performed, further characterization of these putative acetylation targets has been limited. One possible reason is that it is difficult to generate purely acetylated proteins at desired positions by most classic biochemical approaches. To overcome this challenge, the genetic code expansion technique has been applied to use the pair of an engineered pyrrolysyl-tRNA synthetase variant, and its cognate tRNA from Methanosarcinaceae species, to direct the cotranslational incorporation of acetyllysine at the specific site in the protein of interest. After first application in the study of histone acetylation, this approach has facilitated acetylation studies on a variety of proteins. In this work, we demonstrated a facile protocol to produce site-specifically acetylated proteins by using the model bacterium Escherichia coli as the host. Malate dehydrogenase was used as a demonstration example in this work.

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Genetic code expansion serves as a powerful tool to study a wide range of biological processes, including protein acetylation. Here we demonstrate a facile protocol to exploit this technique for generating homogeneously acetylated proteins at specific sites in Escherichia coli cells.

بروتوكول سهلة لتوليد بروتينات سيتيسبيسيفيكالي أسيتيلاتيد في الإشريكيّة القولونية

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&amp;#945;

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

التنمية والتحقق من جزيء واحد أولتراسينسيتيفي الصفيف الرقمي المرتبط بالانزيم مقايسة الممتز للبشرية انترفيرون-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...