ويدعم العمل في المختبر لدينا من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة ، وزارة الزراعة والمعهد الوطني للأغذية والزراعة ، وجبهة الخلاص الوطني ، بارد ، وزارة الطاقة ، والبنك السعودي الفرنسي لVC

1. التعبير واستخراج البروتينات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العلامة بالتفاوت في البروتينات لفحصها للكشف عنها. تسمية البروتين ليكون ثبتوا على الغشاء (ProIM) مع علامة من حجم أكبر (على سبيل المثال ، ضريبة المبيعات) ، ويمكن استخدام البطاقات غير مدمجة والسيطرة على سلبية أداء وظائفها (ProIMnc). تسمية البروتين لاستخدامها كمركز التحقيق القابلة للذوبان (بروسول) مع كبير إما أو علامة صغيرة. فتيل نفس العلامة لمراقبة البروتين السلبية المناسبة القابلة للذوبان (ProSOLnc) ، وتدرج في مقايسة التفاعل لتأكيد خصوصية ملزمة الكشف عنها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار النظام للتعبير عن بروتين تعبير البروتينات المفتاحية ، أي ، إي. القولونية ، الفيروسة العصوية ، وما إلى ذلك ، اعتمادا على شرط آخر التعديلات المحتملة متعدية والغلة من البروتينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج ProIM وNC ProIM من الكائن المختار (الخطوة 1.2) باستخدام SDS - PAGE العازلة تحميل (الجلسرين 20 ٪ ، 4 ٪ SDS ، 20 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، pH6.8) التي تحتوي على بروتين كوكتيل المانع. ترك التعليق الخلية في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة ، إضافة 0.5 ٪ من المركابتويثانول - 2 ويغلي لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج بروسول وNC بروسول من الكائن المختار (الخطوة 1.2) باستخدام البروتوكولات القياسية 16. وينبغي أن تكون هذه البروتينات القابلة للذوبان بسهولة في المخزن ملزمة (كلوريد الصوديوم 140 ملم ، 10 ملم ، ودرجة الحموضة حمض الهيدروكلوريك تريس - 7.4 ، 2 مم EDTA ، 2 مم DTT ، BSA 1 ٪ ، 0.1 ٪ توين 20) المستخدمة في خطوة 4.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد تركيز البروتينات المؤتلف باستخدام الطريقة القياسية ، مثل بيو راد البروتين طقم الفحص. مثل بيو راد البروتين طقم الفحص. إذا تم استخدام استخراج النفط الخام ، بدلا من البروتين النقي ، للفحص ، وتقدير تركيز البروتين من الاهتمام في هذا المستخلص عن طريق مسح قياس كثافة من الفرقة المقابلة على SDS - هلام بولي أكريلاميد الملون مع Coomassie بريليانت الأزرق R - 250 والمعروف به تركيزات BSA كمرجع. </li></ol> 2. تجميد ProIM وProIMnc على الغشاء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل مجموعتين من المقتطفات ، يحتوي كل منها على 1 ميكروغرام من ProIM وNC ProIM على جل SDS - بولي أكريلاميد وفقا لبروتوكول قياسي 16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الكهربائي ، ومكان لنقل جل لفي 100 مل من نقل العازلة (60 ملي جليكاين ، 10 ملي تريس ، 0.0006 ٪ SDS ، MeOH 20 ٪) ، واحتضان مع الإثارة لطيف لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electrotransfer البروتينات الموجودة في هلام لغشاء النيتروسليلوز وفقا لبروتوكول قياسي 16. </li></ol> 3. إعادة للطي من البروتينات غشاء محدد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد electrotransfer ، احتضان الغشاء لمدة 15 دقيقة في 15 مل من العازلة A (30 ملي تريس - pH7.4 حمض الهيدروكلوريك ، 0.05 ٪ توين 20) مع لطيفة لإزالة التحريض SDS المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد افراغ بعناية ، ونقل الغشاء الى 25 مل من العازلة تمسخ (7 هيدروكلوريد الجوانيدين M ، 2 مم EDTA ، 50 ملي DTT ، 50 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك 8.3 درجة الحموضة). واحتضان لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع الانفعالات لطيف. (ملاحظة : غشاء النيتروسليلوز عتامة عندما حضنت تمسخ في المنطقة العازلة). واحتضان لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع الانفعالات لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الغشاء الى 25 مل من TBS (10 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، كلوريد الصوديوم 150 ملم ، ودرجة الحموضة 7.4) ، واحتضان مع الإثارة لطيف لمدة 5 دقائق (ملاحظة : خلال هذه الخطوة ، الغشاء يستعيد لونه الأبيض الأصلي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الغشاء الى 25 مل من العازلة ملزمة (انظر الخطوة 1.2) ، واحتضان عند 4 درجة مئوية مع الإثارة لطيف ليلة وضحاها. </li></ol> 4. سبر ProIM بواسطة بروسول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الغشاء الى قطعتين ، وكلاهما يحتوي على ProIM وNC ProIM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل الحلول والتهجين بروسول ProSOLnc بواسطة تمييع إعداد مع أي من 10-10 ميكروغرام بروسول أو ProSOLnc في 10 مل من العازلة ملزمة جديدة. نقل كل الغشاء الى حل التهجين أو بروسول ProSOLnc واحتضان لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع الإثارة لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأغشية من التهجين وحلول شطف ثلاث مرات لمدة 15 دقيقة في كل TBS. </li></ol> 5. تصور البروتين البروتين التفاعل immunoblotting <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كتلة الغشاء مع الحليب الخالي من الدسم 2.5 ٪ في TBST (10 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، كلوريد الصوديوم 140 ملم ، 20 توين 0.05 ٪ ، ودرجة الحموضة 7.4) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. تمييع الضد الابتدائي (المضادة للأجسام المضادة strepII الأرنب النسائل المتعددة) في الحليب الخالي من الدسم 0.5 ٪ في TBST في التركيز الموصى به من قبل الشركة المصنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الأغشية المحظورة في حل الأضداد ، وحضنت لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو ليلة وضحاها في 4 درجات مئوية مع الإثارة لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف في الأغشية TBST 20 مل لمدة 15 دقيقة ، ومرتين لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الإثارة لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الضد الثانوية (المضادة للأرنب مفتش الضد) مترافق مع البيروكسيداز الفجل (HRP) في الحليب الخالي من الدسم 0.5 ٪ في TBST في تركيز موصى بها من قبل الشركة المصنعة. مكان الأغشية في الضد الثانويةالحل واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع الإثارة لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف في الأغشية TBST 20 مل لمدة 15 دقيقة ، ومرتين لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الإثارة لطيف. بعد شطف النهائي في TBS ، تصور تفاعل البروتين البروتين باستخدام الركيزة معان كيميائي HRP (على سبيل المثال ، ميليبور Immobilon الغربية الركيزة HRP chemiluminescent). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المسبار الأغشية نفسه مع الضد الأولية للعلامة لتنصهر ProIM ، تليها الضد الثانوية المناسبة كما هو موضح في الخطوات 5،1-5،4. تصور ProIM ProIMnc وكما هو موضح في الخطوة 5.5 إلى التحقق من هوية الفرق التي تم الحصول عليها في تراكب فحص غشاء بروتين (الخطوة 5.5). في معظم الحالات ، وتجريد ليست ضرورية ، لأن الإشارات التي حصلت عليها هذه الخطوة هي أقوى بكثير من الإشارات المتبقية التي تم الحصول عليها من الخطوة 5.5. </li></ol> 6. ممثل النتائج : وقد لوحظ التفاعل من قبل النائب كرانك BiFC في خلايا البشرة التبغ (الشكل 1A). لأن النائب هو بروتين غير قابلة للذوبان للغاية عندما أعرب في البكتيريا أو في النباتات ، واعتمد تراكب غشاء فحص البروتين للتحقق من صحة هذا التفاعل في المختبر (1B الشكل). تم حل مقتطفات من البروتين تحتوي على 1 ميكروغرام من GST - MP (ProIM) أو ضريبة السلع والخدمات غير مدمجة (ProIM NC) بواسطة بولي أكريلاميد - SDS الكهربائي للهلام ، تليها electrotransfer لغشاء النيتروسليلوز. عندما تم بحث هذه ProIMs مع ذوبان كرانك strepII (بروسول) ، GST النائب ، ولكن لا ضريبة السلع والخدمات غير مدمجة ، عرضت ملزمة (1B الشكل ، الممرات 1 ، 2 ، مقارنة الممرات 5 ، 6). وعلاوة على ذلك ، عندما تم بحث نفس مجموعة ProIMs مع ProSOLnc لا علاقة لها ، أي Arabidopsis كيناز NADH هيولي strepII الموسومة (NADH3 - strepII) ، لم يلاحظ أي الملزمة ، مما يدل على مزيد من التحديد للتفاعل كرانك النائب (1B الشكل ، والممرات 3 ، 4). <img src="/files/ftp_upload/2961/2961fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1. عنخ ملزمة محددة من التبغ إلى النائب TMV في الجسم الحي وفي المختبر. (A) كرانك النائب تفاعل الخلايا الحية في الكشف عن التبغ البشرة كما BiFC. أعيد بناؤها قوية YFP عند إشارة النائب وكرانك ، تنصهر فيها إلى C - N - محطة ومحطة نصفي YFP ، على التوالي ، وكانت في البشرة coexpressed التبغ microbombardment التالية من الجينات ترميز الخاصة بهم. هذه الإشارة BiFC المتراكمة في نقاط وعلى هامش الخلية ، والتي هي من التشخيص رابطات هيولية 15. (ب) كرانك النائب التفاعل في المختبر الكشف عن بروتين الغشاء كما مقايسة تراكب. تم حل مقتطفات من البروتين تحتوي على 1 ميكروغرام من GST - MP (ProIM) أو ضريبة السلع والخدمات غير مدمجة (ProIMnc) على جل SDS - بولي أكريلاميد 15 ٪ ، تليها electrotransfer على غشاء النيتروسليلوز. وحضنت ضريبة السلع والخدمات ، وMPProIM GSTProIMnc مع 0.5 ميكروغرام / مل من كرانك strepII (بروسول) ، وكان الكشف عن عنخ ملزمة التحقيق الغشاء مع الأضداد المضادة للأرنب strepII النسائل المتعددة ، تليها المضادة للأرنب مفتش الأضداد M + الثانوية لمترافق HRP (حارات 1 و 2). لا ضريبة السلع والخدمات ، ولا MPProIM GSTProIMnc تفاعلت مع البروتين لا علاقة لها ، Arabidopsis كيناز NADH حشوية ، تنصهر فيها إلى العلامة strepII (ProSOLnc ، الممرات 3 و 4). وتم تأكيد هوية الفرقة التي لوحظت في هذا الاختبار من قبل الذين يحققون في الغشاء المضادة للضريبة السلع والخدمات الأضداد (حارات 5 و 6). عندما كان يعالج في الغشاء مع العازلة تمسخ دون غسلها مع العازلة ألف ، يتم فقدان الملزم للضريبة السلع والخدمات إلى النائب عنخ ، بينما البروتينات مجهولين الواردة في GST النائب ومقتطفات GST البروتين contining تفاعلت مع كرانك strepII ، مما يدل على أهمية من الخطوة 3.1 قبل عملية تمسخ (حارات 7 و 8).

<ol>
	<li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol Cell. 9, 789-798 (2002).</li><li>Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+of+interacting+proteins+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+planta.">Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta.</a> J Mol Biol. 362, 1120-1131 (2006).</li><li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+implementation+of+bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+assays+for+the+visualization+of+protein+interactions+in+living+cells.">Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells.</a> Nat Protoc. 1, 1278-1286 (2006).</li><li>Shyu, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+protein+interactions+in+living+Caenorhabditis+elegans+using+bimolecular+fluorescence+complementation+analysis.">Visualization of protein interactions in living Caenorhabditis elegans using bimolecular fluorescence complementation analysis.</a> Nat Protoc. 3, 588-596 (2008).</li><li>Citovsky, V., Gafni, Y., Tzfira, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localizing+protein-protein+interactions+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+planta.">Localizing protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation in planta.</a> Methods. 45, 196-206 (2008).</li><li>Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+analysis+of+protein-protein+interactions+in+plants+by+bimolecular+fluorescence+complementation.">The analysis of protein-protein interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant Physiol. 145, 1090-1099 (2007).</li><li>Zamyatnin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+integral+membrane+protein+topology+in+living+cells.">Assessment of the integral membrane protein topology in living cells.</a> Plant J. 46, 145-154 (2006).</li><li>Citovsky, V., Knorr, D., Schuster, G., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P30+movement+protein+of+tobacco+mosaic+virus+is+a+single-strand+nucleic+acid+binding+protein.">The P30 movement protein of tobacco mosaic virus is a single-strand nucleic acid binding protein.</a> Cell. 60, 637-647 (1990).</li><li>Heinlein, M., Epel, B. L., Padgett, H. S., Beachy, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+tobamovirus+movement+proteins+with+the+plant+cytoskeleton.">Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton.</a> Science. 270, 1983-1985 (1995).</li><li>Tomenius, K., Clapham, D., Meshi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+by+immunogold+cytochemistry+of+the+virus+coded+30+K+protein+in+plasmodesmata+of+leaves+infected+with+tobacco+mosaic+virus.">Localization by immunogold cytochemistry of the virus coded 30 K protein in plasmodesmata of leaves infected with tobacco mosaic virus.</a> Virology. 160, 363-371 (1987).</li><li>Ding, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+plasmodesmata+are+specific+sites+of+localization+of+the+tobacco+mosaic+virus+movement+protein+in+transgenic+tobacco+plants.">Secondary plasmodesmata are specific sites of localization of the tobacco mosaic virus movement protein in transgenic tobacco plants.</a> Plant Cell. 4, 915-928 (1992).</li><li>Meshi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+the+30+kd+protein+of+tobacco+mosaic+virus:+involvement+in+cell-to-cell+movement+and+dispensability+for+replication.">Function of the 30 kd protein of tobacco mosaic virus: involvement in cell-to-cell movement and dispensability for replication.</a> EMBO J. 6, 2557-2563 (1987).</li><li>Wolf, S., Deom, C. M., Beachy, R. N., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movement+protein+of+tobacco+mosaic+virus+modifies+plasmodesmatal+size+exclusion+limit.">Movement protein of tobacco mosaic virus modifies plasmodesmatal size exclusion limit.</a> Science. 246, 377-379 (1989).</li><li>Waigmann, E., Lucas, W. J., Citovsky, V., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+functional+assay+for+tobacco+mosaic+virus+cell-to-cell+movement+protein+and+identification+of+a+domain+involved+in+increasing+plasmodesmal+permeability.">Direct functional assay for tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein and identification of a domain involved in increasing plasmodesmal permeability.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 1433-1437 (1994).</li><li>Ueki, S., Spektor, R., Natale, D. M., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ANK,+a+host+cytoplasmic+receptor+for+the+Tobacco+mosaic+virus+cell-to-cell+movement+protein,+facilitates+intercellular+transport+through+plasmodesmata.">ANK, a host cytoplasmic receptor for the Tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein, facilitates intercellular transport through plasmodesmata.</a> PLoS Pathog. 6, e1001201-e1001201 (2010).</li><li>Coligan, J. E., Dunn, B. M., Ploegh, H. L., Speicher, D. W., Wingfield, P. T., Taylor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> , (2011).</li><li>Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VIP1,+an+Arabidopsis+protein+that+interacts+with+Agrobacterium+VirE2,+is+involved+in+VirE2+nuclear+import+and+Agrobacterium+infectivity.">VIP1, an Arabidopsis protein that interacts with Agrobacterium VirE2, is involved in VirE2 nuclear import and Agrobacterium infectivity.</a> EMBO J. 20, 3596-3607 (2001).</li><li>Chen, M. H., Sheng, J., Hind, G., Handa, A., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+the+tobacco+mosaic+virus+movement+protein+and+host+cell+pectin+methylesterases+is+required+for+viral+cell-to-cell+movement.">Interaction between the tobacco mosaic virus movement protein and host cell pectin methylesterases is required for viral cell-to-cell movement.</a> EMBO J. 19, 913-920 (2000).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

هذا النهج هو مناسبة لاختبار البروتين البروتين التفاعلات بين مجموعات من البروتينات ، عندما تم تطبيقها بنجاح واحد على الأقل من البروتينات التي تذوب بسهولة في المخزن ملزمة ، ومجموعة أخرى من البروتينات 17،18. لا يمكن iInteractions بين البروتينات التي هي غير قابلة للذوبان ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td> بروتين مقايسة طقم </td><td> الحيوي راد </td><td> 500-0001 </td></tr><tr><td> بروتين مثبط الكوكتيل </td><td> SIGMA </td><td> S8820 </td></tr><tr><td> مصغرة نظام متقلب </td><td> الحيوي RAD </td><td> 165-8000 </td></tr><tr><td> وشبه الجافة بغرب النشاف نظام SD electrotransfer </td><td> الحيوي RAD </td><td> 170-3940 </td></tr><tr><td> أرنب المضادة للمفتش الأضداد مترافق مع البيروكسيداز الفجل </td><td> GenScript </td><td> A00098 </td></tr><tr><td> GST المضادة للأرنب الضد النسائل المتعددة </td><td> GenScript </td><td> A00097 </td></tr><tr><td> مكافحة strepII </td><td> GenScript </td><td> A00626 </td></tr><tr><td> BioTrace ، NT نقل غشاء النيتروسليلوز </td><td> بظلالها العلمية </td><td> 27377-000 </td></tr><tr><td> Immobilon الغربية الركيزة chemiluminescent HRP </td><td> ميليبور </td><td> WBKL S0 050 </td></tr></tbody></table>

protein membrane overlay assay: a protocol to test interaction between soluble and insoluble proteins in vitro

التحقق من التفاعلات بين البروتينات المختلفة أمر حيوي لتحقيق وظائفها البيولوجية على المستوى الجزيئي. هناك أساليب عدة ، سواء في التجارب المختبرية والحية ، لتقييم ملزمة البروتين ، وينبغي أن تجرى على الأقل طريقتين التي تكمل بعضها البعض أوجه القصور في الحصول على رؤى وثوقية. لمقايسة في الجسم الحي ، وتكامل ثنائي الجزيء مضان (BiFC) مقايسة يمثل النهج الأكثر شعبية والأقل الغازية التي تمكن للكشف عن البروتين البروتين التفاعل داخل الخلايا الحية ، وكذلك تحديد توطين الخلايا من 1،2 البروتينات المتفاعلة. في هذا الاختبار ، وتنصهر غير الفلورسنت N - C ومحطة GFP - نصفي أو مشتقاته للبروتينات اختبار ، وعندما يتم إحضارها بروتينات اندماج اثنين معا بسبب تفاعلات البروتينات اختبار &quot;، يتم إعادة تشكيل إشارة الفلورسنت 3-6 . بسبب اشارة غير قابلة للكشف بسهولة عن طريق الفحص المجهري أو epifluorescence مبائر ، برز BiFC كأداة قوية من الاختيار بين علماء الأحياء خلية لدراسة عن بروتين تفاعلات البروتين في الخلايا الحية 3. هذا الاختبار ، ومع ذلك ، يمكن ان تنتج في بعض الأحيان إلى نتائج إيجابية كاذبة. على سبيل المثال ، يمكن تشكيل لإشارة الفلورسنت بشظايا GFP two رتبت بقدر 7 نانومتر من بعضها البعض بسبب إغلاق التعبئة والتغليف في المحفظة أ التحت خلوية صغيرة ، وأنه بدلا بسبب تفاعلات معينة 7. بسبب هذه القيود ، يجب تأكيد النتائج التي تم الحصول عليها من تقنيات التصوير الخلية الحية بنهج مستقل يقوم على مبدأ مختلفة للكشف عن تفاعلات البروتين. شارك في مناعي (المشارك IP) أو الجلوتاثيون ترانسفيراز (GST) المنسدلة المقايسات تمثل هذه الطرق البديلة التي يشيع استخدامها لتحليل التفاعلات بين البروتينات والبروتين في المختبر. ومع ذلك ، IIN هذه المقايسات ، ومع ذلك ، يجب أن تكون قابلة للذوبان البروتينات اختبارها بسهولة في المنطقة العازلة التي supportsused للتفاعل ملزمة. لذا ، لا يمكن أن تنطوي على تفاعلات معينة غير قابلة للذوبان البروتين يتم تقييمها بواسطة هذه التقنيات. هنا ، نحن لتوضيح بروتوكول للتراكب فحص غشاء بروتين ملزمة ، والتي تلتف على هذه الصعوبة. في هذه التقنية ، يمكن التفاعل بين البروتينات القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان اختبار موثوق لأنه يجمد واحد من البروتينات على مصفوفة الغشاء. هذا الأسلوب ، في تركيبة مع التجارب المجراة في مثل BiFC ، يقدم نهجا موثوق بها للتحقيق في وتوصيف التفاعلات بين البروتينات بإخلاص للذوبان وغير القابلة للذوبان. في هذه المقالة ، الربط بين فيروس موزاييك التبغ (TMV) البروتين حركة (MP) ، التي تمارس وظائف متعددة أثناء النقل الخلية الى خلية الفيروسية 8-14 ، والنباتات التي تم تحديدها مؤخرا interactor الخلوية ، والتبغ ankyrin تكرار المحتوية على البروتين (عنخ ويتجلى) 15 ، وذلك باستخدام هذه التقنية.

Watch this Scientific Journal Video about Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro at JoVE.com

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

لا غنى عن اختبار البروتين البروتين التفاعل لتشريح وظيفة البروتين. هنا ، نحن بتقديم و<em&gt; في المختبر</em&gt; البروتين البروتين فحص ملزمة ليشمل التحقيق في غشاء من البروتين ثبتوا مع بروتين قابل للذوبان. هذا الاختبار يوفر طريقة موثوق بها لاختبار التفاعل بين البروتينات غير قابلة للذوبان وبروتين في الحل.

الفحص البروتين تراكب الأغشية : بروتوكول لاختبار التفاعل بين البروتينات القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان في المختبر</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

protein-membrane-overlay-assay-protocol-to-test-interaction-between

Research

JoVE Journal

Biology

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

22.0K Views.  State University of New York. لا غنى عن اختبار البروتين البروتين التفاعل لتشريح وظيفة البروتين. هنا ، نحن بتقديم و في المختبر البروتين البروتين فحص ملزمة ليشمل التحقيق في غشاء من البروتين ثبتوا مع بروتين قابل للذوبان. هذا الاختبار يوفر طريقة موثوق بها لاختبار التفاعل بين البروتينات...

Video: Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

ثنائي الجزيء الإسفار التكملة (BiFC) الفحص عن البروتين البروتين في خلايا البصل التفاعل باستخدام مدفع الجينات هيليوس

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

تقارب المرحلة السائلة الفحص التقاطها باستخدام الخرز المغناطيسي لدراسة البروتين البروتين التفاعل: المثال فيروس شلل الأطفال، Nanobody

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

استخدام روبوت لارتفاع الإنتاجية البلورة من بروتينات الغشاء في Mesophases شحمي

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

في المختبر مثلأيشن الفحص لدراسة البروتين أرجينين مثلأيشن

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

الجينوم على نطاق فحص التفاعلات بين البروتينات التي كتبها البروتين جزء التكملة الفحص (PCA) في الخلايا الحية

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

لوسيفراس "التكامل بالتصوير الإنزيم" في أوراق نيكوتيانا بينثاميانا "تحديد عابر ديناميات التفاعل" البروتين-بروتين

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Determination of Tripartite Interaction between Two Monomers of a MADS-box Transcription Factor and a Calcium Sensor Protein by BiFC-FRET-FLIM Assay

Protein-protein interactions are an integral part of all biological processes in the cells as they play a crucial role in regulating, maintaining, and amending cellular functions. These interactions are involved in a wide range of phenomena such as signal transduction, pathogen response, cell-cell interactions, metabolic and developmental processes. In the case of transcription factors, these interactions may lead to oligomerization of subunits, sequestering in specific subcellular contexts such as the nucleus, cytoplasm, etc., which, in turn, might have a more profound effect on the expression of the downstream genes. Here, we demonstrate a methodology to visualize in vivo tripartite interaction using Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) based F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) involving Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM). Two of the proteins selected for this demonstration interact as BiFC partners, and their reconstituted fluorescence activity is used to assay FRET-FLIM with the third partner. Four to five-week-old growth-chamber-grown Nicotiana benthamiana plants have been used as the model plant system for this demonstration.

Here we present, a method to visualize ternary complex formation between three protein partners using fluorescent-tagged proteins by BiFC based FRET-FLIM assay. This method is valuable for studying protein-protein interaction complexes in vivo.

تحديد التفاعل الثلاثي بين اثنين من مونومرات من عامل النسخ MADS مربع وبروتين استشعار الكالسيوم من قبل BiFC-FRET-FLIM المقايسة

Protein-protein interactions are an integral part of all biological processes in the cells as they play a crucial role in regulating, maintaining, and ...

إنتاج وتصوير الحويصلات المملوءة بالبروتين المؤتلف من الإشريكية القولونية

Optimized Production and Analysis of Recombinant Protein-Filled Vesicles from E. coli

This innovative system, using a short peptide tag, that exports multiple recombinant proteins in membrane bound vesicles from E. coli, provides an effective solution to a range of problems associated with bacterial recombinant protein expression. These recombinant vesicles compartmentalise proteins within a micro-environment that facilitates the production of otherwise challenging, toxic, insoluble, or disulfide-bond containing proteins from bacteria. Protein yield is increased considerably when compared to typical bacterial expression in the absence of the vesicle-nucleating peptide tag. The release of vesicle-packaged proteins supports isolation from the culture medium&#160;and permits long-term active protein storage. This technology gives rise to increased yields of vesicle-packaged, functional proteins for simplified downstream processing for a diverse range of applications from applied biotechnology to discovery science and medicine. In the present article and the associated video, a detailed protocol of the method is provided, which highlights key steps in the methodology to maximize recombinant protein-filled vesicle production.

تسليط الضوء على المؤلف: إنتاج البروتينات المؤتلفة 

The present protocol describes a detailed method for the bacterial production of recombinant proteins, including typically insoluble or disulfide-bond containing proteins, packaged inside extracellular membrane-bound vesicles. This has the potential to be applied to versatile areas of scientific research, including applied biotechnology and medicine.