وأيد هذا العمل من قبل فون النظافة من جامعة غراتس الطبية. وقدم جميع الموضوعات علم موافقتهم. تم الحصول على الموافقة المؤسسية لبروتوكول الدراسة من جامعة غراتس الطبية.

1. جمع العينات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة ثابت حنكي المتوسع بعد 4 أشهر من الخدمة داخل الفم. استخدام نظام NOLA حقل جاف لعزل الأجهزة قبل إزالتها (الشكلان 1 و 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام كماشة تعقيمها ، والقفازات والصواني لإزالة التلوث المتوسع دون إضافة (الشكلان 3 و 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكائنات مخزن في قارورة 120 مل في Sarstedt -20 درجة مئوية. اتخاذها لمختبر على الجليد والعملية في غضون 24 ساعة. </li></ol> 2. بيوفيلم التثبيت <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كشط بيوفيلم رقائق مع مشرط معقم ، أو جمع القطع مع ملقط معقم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الثلج الباردة حل PFA 4 ٪ حتى يتم تغطية العينة جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخليط في احتضان +4 درجة مئوية (لا تجميد) لمدة 3 إلى 12 ساعة. قد أوقات أطول التثبيت أو التثبيت ارتفاع درجات الحرارة تجعل المغلفات خلية من خلايا سالبة الجرام أقل نفاذا إلى تحقيقات قليل النوكليوتيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة PFA حل ويغسل مع PBS 1X الجليد الباردة. كرر هذه الخطوة لص 2-3 مراتemove PFA المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend العينة في المجلد 1. الجليد الباردة 1X PBS وإضافة المجلد 1. الجليد الباردة 96 ٪ (V / V) الايثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين العينة عند -20 درجة مئوية. ويمكن تخزين عينات ثابتة وفقا لهذا البروتوكول لعدة شهور وسنوات. </li></ol> 3. جفاف عينات ثابتة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5-30 من تنطبق ميكرولتر - PFA الثابتة المادية عينة لشريحة المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جفاف في 46 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة أو في درجة حرارة الغرفة لفترة أطول. ذوبان الجليد في الليزوزيم وformamide و. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 250 ميكرولتر من الليزوزيم (1mg/ml) في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة ، مما يسهل اختراق للتحقيقات في الخلايا عن طريق تدمير جزئي لجدران الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراجع الانزلاق الى 50 ٪ ، 80 ٪ و 96 ٪ (V / V) لمدة 3 دقائق الايثانول لكل منهما. سيكون تأثير التجفيف للتركيز الايثانول سلسلة تفكيك أغشية الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجافة الشرائح في 46 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. </li></ol> 4. التهجين في الموقع <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 مل من إعدادالطازجة العازلة التهجين (انظر الجدول رقم 1 لتركيزات). Formamide التركيزات المستخدمة في هذه الدراسة : 10 ٪ (EUBmix) ، 20 ٪ (Bac303 ، POGI ، MUT590) أو 45 ٪ (LGCmix). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد الحلول قليل النوكليوتيد التحقيق. يجب أن تبقى على إذابة الجليد تحقيقات ومحمية من الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 ميكرولتر من كل المسبار إلى 200 ميكرولتر من التهجين العازلة ، تخلط جيدا وتطبيق المزيج على عينة المجففة على شريحة المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطعة من المناديل الورقية في طبق بيتري مربع ، وتصب العازلة التهجين المتبقية على الورق الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المكان فورا الشريحة أفقيا في صحن وأغلق الطبق. احتضان في فرن تبلغ 46 درجة مئوية لمدة 1-5 ساعات (90 دقيقة لن يكون كافيا في معظم الحالات). وظائف طبق كغرفة منع تبخر الرطوبة حل التهجين من الشريحة. على وجه الخصوص ، يمكن أن تسبب تبخر formamide غير محددة ملزمة لتحقيق هدف غير الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير 50 ​​مل من غسل العازلة (انظر الجدول رقم 2 للبغية دراسته واقرارهntrations). إعداد العازلة الغسيل في أنبوب 50 مل وسخن إلى 48 درجة مئوية في حمام مائي. يتم تنفيذ الخطوة الغسيل في 48 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الطبق مع شريحة من الفرن التهجين. تغسل فورا قبالة العازلة التهجين مع صغر حجم العازلة الغسيل قبل تحسنت ، ونقل الشريحة في المخزن المؤقت الغسيل المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الأنبوب الذي يحتوي على الشريحة العازلة الغسيل وظهر في حمام مائي واحتضان عند درجة 48 لمدة 10-15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة شريحة من الأنبوب وتراجع في الجليد الباردة O 2 DDH لمدة 2-3 ثانية للقضاء على بقايا العازلة الغسيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الهواء الجاف الشريحة بأسرع وقت ممكن (من المستحسن استخدام الهواء المضغوط). وسوف تجف بسرعة التحقيق لحد التفكك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن تخزين الشرائح المجففة في الظلام على -20 درجة مئوية لعدة أسابيع دون خسارة كبيرة في التحقيق ، إشارة الممنوحة مضان. </li></ol> 5. المجهري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد السمكية ، والغسيل ، وAPPLذ قطرتين من إغلاق antifadent إلى أقاصي اليسار واليمين من شريحة (يجب أن تكون درجة حرارة شرائح مجمدة إلى درجة حرارة الغرفة قبل هذه الخطوة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع غطاء على رأس المجهر زلة وانتظر حتى antifadent انتشرت فوق الشريحة بأكملها. علما بأن كمية زائدة من antifadent يمكن طمس صورة المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة العينات تحت المجهر ليزر متحد البؤر المسح مجهزة مرشحات مناسبة أو الليزر. استخدمنا TCS لايكا وحدة (HCX PL APO/63x ؛ NA 1.2). ويمكن تحليل البيانات مع برامج مثل IMARIS أو أميرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن تخزين الشرائح المضمنة في antifadent في +4 درجة مئوية (لا تجميد) لمدة تصل إلى 7 أيام قبل لجنة التحقيق ، تمنح مضان يبدأ في الانخفاض. بدلا من ذلك ، يمكن إزالة antifadent مع DDH 2 O ، ويمكن تخزين الشرائح المجففة في -20 درجة مئوية لفترة ممتدة من الزمن. </li></ol> 6. ممثل النتائج : كشط قبالة بيوفيلم الأجهزة التقويمية الثابتة (الشكل 5) غلة رقائق مناسب (الشكل 6) التي يمكن المهجنة مباشرة على شرائح الزجاج المطلي لالمجهري. بهذه الطريقة ، يمكن تحديد مجموعات مختلفة من البكتيريا orobiome في بيئتها الطبيعية الثلاثية الأبعاد التي الرنا الريباسي علامات الجرثومي مع تحقيقات محددة مختلفة المسمى (الشكلان 7 و 8). في الشكل 7 ، والملون مع بيوفيلم EUBmix (أخضر ، كل البكتيريا) وLGCmix (أصفر ، Firmicutes). Firmicutes تظهر باللون الأخضر ، كما أنها كانت ملطخة باللون الأصفر والأزرق. في الشكل 8 ، والملون مع بيوفيلم EUBmix (أحمر ، كل البكتيريا) ، Bac303 (أزرق ، Bacteroidetes) وPOGI (أصفر ، Porphyromonas اللثوية). يظهر Porphyromonas اللثوية باللون الأبيض المصفر ، وجميع التحقيقات three ربط الحمض النووي وتداخل نتائج من الألوان في إشارة بيضاء. ويمكن أيضا الاختلافات الشكلية بين مجموعات من البكتيريا اسمه (الشكلان 9 و 10). وتظهر كتل كبيرة من البكتيريا المكورة في الشكل 9 ، حيث تم تنفيذ تلطيخ مع EUBmix (الأخضر ، وكلها على درجة البكالوريوسcteria). وأشكال مختلفة من البكتيريا عن طريق الفم في تصور الشكل 10 ، حيث يمكن تمييز البكتيريا المكورة والخيطية التي تلطيخ مع EUBmix (الحمراء). أيضا ، يمكن معالجة نموذجية فطر يشبه هيكل بيوفيلم عبر النمذجة 3D البيانات CLSM (الأرقام 11 و 12) <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2967/Film1 Klug Santigli 01_2_JES_Web.mov">اضغط هنا لمشاهدة فيلم من النمذجة 3D.</a> <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig1.jpg" /> الشكل 1. الثابتة حنكي المتوسع في الموقع. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig2.jpg" /> الشكل 2. نولا نظام حقل جاف. <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig3.jpg" /> الشكل 3. المعقم كماشة ، والقفازات والدرج. <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig4.jpg" /> الشكل 4. إزالتها المتوسع. <img alt="الشكل 5" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig5.jpg" /> الشكل 5. القشط قبالة بيوفيلم مع مشرط معقم. <img alt="الشكل 6" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig6.jpg" /> رقائق الراتنج الرقم 6. المهجنة مباشرة على شرائح الزجاج المطلي. <img alt="الرقم 7" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig7.jpg" /> صورة الشكل 7 CLSM : التفريق بين مجموعة محددة البكتيرية. 2D تراكب من بيانات 3D CLSM المكدس. ملون مع بيوفيلم EUBmix (أخضر ، كل البكتيريا) وLGCmix (أصفر ، Firmicutes). <img alt="الشكل 8" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig8.jpg" /> الشكل 8 صورة CLSM : التفريق بين مجموعة محددة البكتيرية. 2D تراكب من بيانات 3D CLSM المكدس. ملون مع بيوفيلم EUBmix (أحمر ، كل البكتيريا) ، Bac303 (أزرق ، Bacteroidetes) وPOGI (أصفر ، Porphyromonas اللثوية). <img alt="الرقم 9" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig9.jpg" /> الرقم 9 صورة CLSM : تمايز morphologies محددة. 2D تراكب من بيانات 3D CLSM المكدس. ملون مع بيوفيلم EUBmix (أخضر ، كل البكتيريا). مجموعات كبيرة من البكتيريا المكورة (الأسهم). <img alt="الرقم 10" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig10.jpg" /> صور CLSM الرقم 10 : تمايز morphologies محددة. 2D تراكب من بيانات 3D CLSM المكدس. ملون مع بيوفيلم EUBmix (أحمر ، كل البكتيريا). ويمكن تمييز مكوراتي (السهم أدناه) ، والبكتيريا الخيطية (السهم أعلاه). <img alt="الرقم 11" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig11.jpg" /> الرقم 11. هيكل الفطر ، وجهات النظر 3D من أسفل. أكوام من رقائق بيوفيلم (كشط قبالة السطح من الأجهزة التقويمية) ، ملطخة EUBmix واإلجراءاتssed مع IMARIS (CLSM الصورة). <img alt="الرقم 11" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig11.jpg" /> الرقم 12. هيكل الفطر ، 3D جانبيا. أكوام من رقائق بيوفيلم (كشط قبالة السطح من الأجهزة التقويمية) المجهزة مع IMARIS (CLSM الصورة). <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="4"> العازلة التهجين (200 ميكرولتر) </td></tr><tr><td> Formamide تركيز </td><td> 10 ٪ </td><td> 20 ٪ </td><td> 45 ٪ </td></tr><tr><td> 5 M كلوريد الصوديوم </td><td> 36 </td><td> 36 </td><td> 36 </td></tr><tr><td> M - 1 تريس حمض الهيدروكلوريك </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> 2 ٪ SDS </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> FA </td><td> 20 </td><td> 40 </td><td> 90 </td></tr><tr><td><strong&gt; DDH 2 O </td><td> 138 </td><td> 118 </td><td> 68 </td></tr><tr><td> أي نوع من الأسماك التحقيق </td><td> 2 </td><td> 2 </td><td> 2 </td></tr></tbody></table> الجدول 1. مقومات العازلة التهجين (التركيزات في ميكرولتر). <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="4"> غسل العازلة (50 مل) </td></tr><tr><td> Formamide تركيز </td><td> 10 ٪ </td><td> 20 ٪ </td><td> 45 ٪ </td></tr><tr><td> 5 M كلوريد الصوديوم </td><td> 4500 </td><td> 2150 </td><td> 300 </td></tr><tr><td> M - 1 تريس حمض الهيدروكلوريك </td><td> 1000 </td><td> 1000 </td><td> 1000 </td></tr><tr><td> 0.5 M EDTA </td><td> 0 </td><td> 500 </td><td> 500 </td></tr><tr><td> DDH 2 O </td><td> 44 500 </td><td> 46 350 </td&gt; <td> 48 200 </td></tr></tbody></table> الجدول 2. مقومات العازلة الغسيل (التركيزات في ميكرولتر). فيلم 1. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2967/Film1 Klug Santigli 01_2_JES_Web.mov">اضغط هنا لمشاهدة الفيلم.</a>

<ol>
	<li>Sunde, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH)+for+direct+visualization+of+bacteria+in+periapical+lesions+of+asymptomatic+root-filled+teeth.">Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct visualization of bacteria in periapical lesions of asymptomatic root-filled teeth.</a> Microbiology. 149, 1095-1102 (2003).</li><li>Sussman, M., Loya, Y., Fine, M., Rosenberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+marine+fireworm+Hermodice+carunculata+is+a+winter+reservoir+and+spring-summer+vector+for+the+coral-bleaching+pathogen+Vibrio+shiloi.">The marine fireworm Hermodice carunculata is a winter reservoir and spring-summer vector for the coral-bleaching pathogen Vibrio shiloi.</a> Environ. Microbiol. 5, 250-255 (2003).</li><li>Kolenbrander, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Communication+among+oral+bacteria.">Communication among oral bacteria.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66, 486-505 (2002).</li><li>Zijnge, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+biofilm+architecture+on+natural+teeth.">Oral biofilm architecture on natural teeth.</a> PLoS One. 5, e9321-e9321 (2010).</li><li>Thurnheer, T., Gmur, R., Giertsen, E., Guggenheim, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+fluorescent+in+situ+hybridization+for+the+specific+detection+and+quantification+of+oral+streptococci+in+dental+plaque.">Automated fluorescent in situ hybridization for the specific detection and quantification of oral streptococci in dental plaque.</a> J. Microbiol. Methods. 44, 39-47 (2001).</li><li>Hojo, K., Nagaoka, S., Ohshima, T., Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+interactions+in+dental+biofilm+development.">Bacterial interactions in dental biofilm development.</a> J. Dent. Res. 88, 982-990 (2009).</li><li>Jung, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+initial+bacterial+colonization+on+dentine+and+enamel+in+situ.">Visualization of initial bacterial colonization on dentine and enamel in situ.</a> J. Microbiol. Methods. 81, 166-174 (2010).</li><li>Al-Ahmad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+colonization+of+enamel+in+situ+investigated+using+fluorescence+in+situ+hybridization.">Bacterial colonization of enamel in situ investigated using fluorescence in situ hybridization.</a> J. Med. Microbiol. 58, 1359-1366 (2009).</li><li>Bryers, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medical+biofilms.">Medical biofilms.</a> Biotechnol. Bioeng. 100, 1-18 (2008).</li><li>Cardinale, M., Vieira de Castro, J., Muller, H., Berg, G., Grube, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+analysis+of+the+bacterial+community+associated+with+the+reindeer+lichen+Cladonia+arbuscula+reveals+predominance+of+Alphaproteobacteria.">In situ analysis of the bacterial community associated with the reindeer lichen Cladonia arbuscula reveals predominance of Alphaproteobacteria.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 66, 63-71 (2008).</li><li>Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+normal+bacterial+flora+of+the+oral+cavity.">Defining the normal bacterial flora of the oral cavity.</a> J. Clin. Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).</li><li>Chin, M. Y., Busscher, H. J., Evans, R., Noar, J., Pratten, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+biofilm+formation+and+the+effects+of+antimicrobial+agents+on+orthodontic+bonding+materials+in+a+parallel+plate+flow+chamber.">Early biofilm formation and the effects of antimicrobial agents on orthodontic bonding materials in a parallel plate flow chamber.</a> Eur. J. Orthod. 28, 1-7 (2006).</li><li>Loy, A., Maixner, F., Wagner, M., Horn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=probeBase--an+online+resource+for+rRNA-targeted+oligonucleotide+probes:+new+features+2007.">probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes: new features 2007.</a> Nucleic. Acids. Res. 35, (2007).</li><li>Diaz, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+subject-specific+oral+microflora+during+initial+colonization+of+enamel.">Molecular characterization of subject-specific oral microflora during initial colonization of enamel.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 2837-2848 (2006).</li><li>Dige, I., Nilsson, H., Kilian, M., Nyvad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+identification+of+streptococci+and+other+bacteria+in+initial+dental+biofilm+by+confocal+laser+scanning+microscopy+and+fluorescence+in+situ+hybridization.">In situ identification of streptococci and other bacteria in initial dental biofilm by confocal laser scanning microscopy and fluorescence in situ hybridization.</a> Eur. J. Oral Sci. 115, 459-467 (2007).</li><li>Kolenbrander, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+interactions+and+successions+during+plaque+development.">Bacterial interactions and successions during plaque development.</a> Periodontology. 42, 47-79 (2000).</li><li>Kolenbrander, P. E., Palmer, R. J., Periasamy, S., Jakubovics, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+multispecies+biofilm+development+and+the+key+role+of+cell-cell+distance.">Oral multispecies biofilm development and the key role of cell-cell distance.</a> Nat. Rev. Microbiol. 8, 471-480 (2010).</li><li>Chalmers, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+quantum+dot+luminescent+probes+to+achieve+single-cell+resolution+of+human+oral+bacteria+in+biofilms.">Use of quantum dot luminescent probes to achieve single-cell resolution of human oral bacteria in biofilms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 630-636 (2007).</li><li>Wecke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+technique+for+monitoring+the+development+of+bacterial+biofilms+in+human+periodontal+pockets.">A novel technique for monitoring the development of bacterial biofilms in human periodontal pockets.</a> FEMS Microbiol. Lett. 191, 95-101 (2000).</li><li>Moter, A., Gobel, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH)+for+direct+visualization+of+microorganisms.">Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct visualization of microorganisms.</a> J. Microbiol. Methods. 41, 85-112 (2000).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وهنا وصف البروتوكول هو نهج عملي للغاية لتلطيخ الأغشية الحيوية التي تم جمعها من المواد الصلبة. أخذ العينات والتهجين هي الخطوات الأكثر أهمية. خلال المعاينة ، يجب الحرص على جمع شرائح من سمك كافية لضمان أن الهيكل بيوفيلم لا تزال سليمة. خلال التهجين ، فمن الضروري لتجنب التقلبات المفرطة في درجة الحرارة ، وبالتالي تجنب غير محددة وملزمة ، أو فقدان ملزمة ، من تحقيقات fluorescently المسمى. FISH هذا البروتوكول هو أسلوب أنيق وصمة عار على بيوفيلم متجانسة طبيعية مباشرة على الشرائح الزجاجية دون تعطيل تكوينها. ويمكن على الفور الشرائح تستعمل لالمجهري دون الحاجة لنقل العينة مرة أخرى. بهذه الطريقة ، يتم تحقيق تحسن على تلطيخ في أنابيب بالقوة أقل القص يجري تطبيقها على بيوفيلم. يمكن تحضير شرائح&gt; 50 ميكرون سميكة والتحقيق في هذا الشكل.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<th>Oligonucleotides</th>
			<th>Target organism</th>
			<th>Fluorochrome</th>
		</tr>
		<tr>
			<td>EUB338 - 338III</td>
			<td>Eubacteria</td>
			<td>Cy3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LGC354 A-C</td>
			<td>Firmicutes</td>
			<td>FITC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bac303</td>
			<td>Bacteroidetes</td>
			<td>Cy5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mut590</td>
			<td>Streptococcus mutans</td>
			<td>FITC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POGI</td>
			<td>Porphyromonas gingivalis</td>
			<td>FITC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 3. Oligonucleotides (refer to probeBase13 for details).
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<th>Component</th>
			<th>Company</th>
			<th>Comments</th>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>4% solution in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 x PBS</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>3 x solution prepared</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (100%)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Roth</td>
			<td>100 mg/ml stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Roth</td>
			<td>99.5% solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% SDS</td>
			<td>Roth</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FISH probes (oligonucleotides)</td>
			<td>Invitrogen, Sigma</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifadent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<th>Equipment</th>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>IKA Tez</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysine-coated slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 4. Materials and equipment.

oral biofilm analysis of palatal expanders by fluorescence in-situ hybridization and confocal laser scanning microscopy

اليوم سهلت مبائر المجهري المسح بواسطة أشعة الليزر (CLSM) من غير المتجانسة بيوفيلم الطبيعية مجموعة شاملة من تقنيات التلوين ، واحد منهم يجري في مضان التهجين الموضع (FISH). 1،2 نحن إجراء الدراسة التجريبية التي جمعت عينات من الفم بيوفيلم الثابتة وكانت ملطخة الأجهزة التقويمية (حنكي المتوسع) من الأسماك ، والهدف من ذلك لتقييم منظمة ثلاثية الأبعاد من بيوفيلم الطبيعية وتراكم الترسبات. 3،4 FISH يخلق فرصة لصبغ الخلايا في بيئتها الأصلية بيوفيلم عن طريق استخدام 16S fluorescently المسمى الرنا الريباسي استهداف تحقيقات. 4-7،19 بالمقارنة مع التقنيات البديلة مثل وضع العلامات مناعي ، وهذا هو غير مكلفة ، تقنية وضع العلامات دقيقة ومباشرة التحقيق في مجموعات بكتيرية مختلفة في اتحادات بيوفيلم مختلطة. 18،20 التحقيقات العامة التي كانت تستخدم لربط Eubacteria ( + + EUB338 EUB338II EUB338III ؛ الآخرة EUBmix) ، 8-10 Firmicutes (LGC354 AC ؛ استخدمت LGCmix الآخرة) ، وBacteroidetes 9،10 (Bac303) 11 بالإضافة إلى ذلك ، تحقيقات محددة وملزمة لالعقدية الطافرة (MUT590) 12،13 وPorphyromonas اللثوية (POGI) 13،14. . صلابة المتطرفة من المواد السطحية المعنية (الفولاذ المقاوم للصدأ وراتنج الأكريليك) أجبرتنا على إيجاد طرق جديدة لإعداد بيوفيلم. كما لا يمكن أن تكون هذه المواد السطحية قطع بسهولة مع مبضع بردي ، واستكشاف أساليب مختلفة للحصول على عينات بيوفيلم الشفوي سليمة. وقدم معظم عملي من هذين النهجين في هذا البلاغ. وكشط رقائق صغيرة من راتنج الأكريليك بيوفيلم الحاملة قبالة مع مشرط معقم ، مع الحرص على عدم الاضرار هيكل بيوفيلم. تم استخدام ملقط لجمع بيوفيلم من الأسطح الفولاذية. جمعها مرة واحدة ، كانت ثابتة العينات ووضعها مباشرة على الشرائح polysine الزجاج المطلي. وقد أجريت هذه الأسماك مباشرة على الشرائح مع تحقيقات مentioned أعلاه. تم الجمع بين مختلف بروتوكولات السمكية وتعديلها لإنشاء البروتوكول الجديد الذي كان من السهل التعامل معها. 5،10،14،15 وبعد ذلك تم تحليل العينات بواسطة الليزر المجهري متحد البؤر المسح الضوئي. ويمكن معروفة تكوينات 3،4،16،17 يمكن تصور ، بما فطر على غرار تشكيلات ومجموعات من البكتيريا المكورة التي عمت القنوات. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحليل تركيبة هذه الهياكل البكتيرية بيوفيلم وخلق الصور النمطية 2D و 3D.

Watch this Scientific Journal Video about Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy at JoVE.com

Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy

نقدم بروتوكولا للتحليل الهيكلية والتركيبية للبيوفيلم الفم الطبيعية من الأجهزة التقويمية مع<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين (FISH) ومتحد البؤر المجهري مسح الليزر (CLSM). تم جمع عينات من الفم بيوفيلم المتوسع حنكي وتجريف الاكريليك الراتنج ، رقائق قبالة سطحها وإحالتهم للتجهيز الجزيئية.

عن طريق الفم من تحليل بيوفيلم المتوسعون حلقي بواسطة التهجين في الموضع الإسفار ومتحد البؤر المسح الضوئي ليزر مجهرية

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) of natural heterogeneous biofilm is today facilitated by a comprehensive range of staining techniques, one of ...

oral-biofilm-analysis-palatal-expanders-fluorescence-situ

Research

JoVE Journal

Medicine

15.9K Views.  Medical University of Graz. نقدم بروتوكولا للتحليل الهيكلية والتركيبية للبيوفيلم الفم الطبيعية من الأجهزة التقويمية مع في الموقع التهجين (FISH) ومتحد البؤر المجهري مسح الليزر (CLSM). تم جمع عينات من الفم بيوفيلم المتوسع حنكي وتجريف الاكريليك الراتنج ، رقائق قبالة سطحها وإحالتهم للتجه...

Video: Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy

Probe-based Confocal Laser Endomicroscopy of the Urinary Tract: The Technique

Probe-based confocal laser endomicroscopy (CLE) is an emerging optical imaging technology that enables real-time in vivo microscopy of mucosal surfaces during standard endoscopy. With applications currently in the respiratory1 and gastrointestinal tracts,2-6 CLE has also been explored in the urinary tract for bladder cancer diagnosis.7-10 Cellular morphology and tissue microarchitecture can be resolved with micron scale resolution in real time, in addition to dynamic imaging of the normal and pathological vasculature.7
The probe-based CLE system (Cellvizio, Mauna Kea Technologies, France) consists of a reusable fiberoptic imaging probe coupled to a 488 nm laser scanning unit. The imaging probe is inserted in the working channels of standard flexible and rigid endoscopes. An endoscope-based CLE system (Optiscan, Australia), in which the confocal endomicroscopy functionality is integrated onto the endoscope, is also used in the gastrointestinal tract. Given the larger scope diameter, however, application in the urinary tract is currently limited to ex vivo use.11 Confocal image acquisition is done through direct contact of the imaging probe with the target tissue and recorded as video sequences. As in the gastrointestinal tract, endomicroscopy of the urinary tract requires an exogenenous contrast agent&mdash;most commonly fluorescein, which can be administered intravenously or intravesically. Intravesical administration is a well-established method to introduce pharmacological agents locally with minimal systemic toxicity that is unique to the urinary tract. Fluorescein rapidly stains the extracellular matrix and has an established safety profile.12 Imaging probes of various diameters enable compatibility with different caliber endoscopes. To date, 1.4 and 2.6 mm probes have been evaluated with flexible and rigid cystoscopy.10 Recent availability of a &lt; 1 mm imaging probe13 opens up the possibility of CLE in the upper urinary tract during ureteroscopy. Fluorescence cystoscopy (i.e. photodynamic diagnosis) and narrow band imaging are additional endoscope-based optical imaging modalities14 that can be combined with CLE to achieve multimodal imaging of the urinary tract. In the future, CLE may be coupled with molecular contrast agents such as fluorescently labeled peptides15 and antibodies for endoscopic imaging of disease processes with molecular specificity.

Probe-based confocal laser endomicroscopy enables real-time microscopy of the human urinary tract during cystoscopy, providing dynamic, intravital imaging of pathological states such as bladder cancer with cellular resolution. Endomicroscopy may augment the diagnostic accuracy of standard white light endoscopy and provide intraoperative image guidance to improve surgical resection.

التحقيق المستندة إلى Endomicroscopy الليزر متحد البؤر في المسالك البولية: تقنية

Probe-based  confocal laser endomicroscopy (CLE) is an emerging optical imaging technology  that enables real-time in vivo microscopy of mucosal surfaces ...

Clinicopathological Analysis of miRNA Expression in Breast Cancer Tissues by Using miRNA In Situ Hybridization

In this article, we describe a detailed protocol for miRNA detection in breast cancer tissue using in situ hybridization with a digoxigenin-labelled LNA (Locked Nucleic Acid) probe. The probe was recognized by anti-DIG alkaline phosphatase antibodies and later developed using alkaline phosphatase substrate producing fluorescence signals. Here we utilized miRNA in situ hybridization (MISH) technique to analyze expression of miR-489 in tissues from breast cancer patients. This technique can detect the localization of miRNA of interest in individual tissue samples. This technique can be used to compare the expression of desired miRNA in tumor tissue with that in adjacent normal tissue and to identify the specific structures responsible for expressing this miRNA. This technique can be very useful in answering certain clinical questions, such as role of specific miRNA in the development of cancer. Our results indicate that mammary epithelial cells express significantly higher levels of miR-489 than adjacent tumor cells.

Clinicopathological Analysis of miRNA Expression in Breast Cancer Tissues by Using miRNA In Situ Hybridization

Here we present a protocol to detect miRNA expression in breast cancer patient samples using miRNA in situ hybridization.

تحليل إكلينيكية من ميرنا التعبير في سرطان الثدي الأنسجة باستخدام ميرنا<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين

In this article, we describe a detailed protocol for miRNA detection in breast cancer tissue using in situ hybridization with a digoxigenin-labelled LNA ...

Oral Biofilm Sampling for Microbiome Analysis in Healthy Children

Oral biofilm and its molecular analysis provide a basis for investigating various dental research and clinical questions. Knowledge of biofilm composition leads to a better understanding of cariogenic and periopathogenic mechanisms. Microbial changes taking place in the oral cavity during childhood are of interest for several reasons. The evolution of the child oral microbiota and shifts in its composition need to be analyzed further to understand and possibly prevent the onset of disease. At the same time, advanced knowledge of the natural composition of oral biofilm is needed. Early stages of caries-free permanent dentition with healthy gums provide a widely unaffected subgingival habitat that can serve as an in situ baseline for studying features of oral health and disease. Analysis of children's oral biofilm during different stages in life is thus an important theme in the field. Modern molecular analysis methods can provide comprehensive information about the bacterial diversity of such biofilms. To enable microbiota data comparison, it is important to standardize each step in the procedure for molecular data generation. This procedure spans from clinical sampling, Next Generation Sequencing (NGS), bioinformatic data processing, to taxonomic interpretation. One of the most critical factors here is biofilm sampling. Sampling in children is even more challenging in particular due to limited space in subgingival areas. We thus focus on the use of paper points for subgingival sampling. This article provides a detailed protocol for oral biofilm sampling of the subgingival sulcus, the mucosa, and saliva in children.

Changes in the oral microbiome throughout childhood are of growing interest. Comparison of different microbiome studies reveals a lack of standardized sampling protocols. Limited space makes sampling the sound subgingival sulcus of children challenging. Paper point sampling is presented here in detail as the method of choice for this area.

بيوفيلم الشفوي أخذ العينات للتحليل ميكروبيومي في الأطفال الأصحاء

Oral biofilm and its molecular analysis provide a basis for investigating various dental research and clinical questions. Knowledge of biofilm composition ...

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking (TXL) for Myopia

Methods to strengthen tissue by introducing chemical bonds (non-enzymatic cross-linking) into structural proteins (fibrillar collagens) for therapy include photochemical cross-linking and tissue cross-linking (TXL) methods. Such methods for inducing mechanical tissue property changes are being employed to the cornea in corneal thinning (mechanically weakened) disorders such as keratoconus as well as the sclera in progressive myopia, where thinning and weakening of the posterior sclera occurs and likely contributes to axial elongation. The primary target proteins for such tissue strengthening are fibrillar collagens which constitute the great majority of dry weight proteins in the cornea and sclera. Fortuitously, fibrillar collagens are the main source of second harmonic generation signals in the tissue extracellular space. Therefore, modifications of the collagen proteins, such as those induced through cross-linking therapies, could potentially be detected and quantitated through the use of second harmonic generation microscopy (SHGM). Monitoring SHGM signals through the use of a laser scanning microscopy system coupled with an infrared excitation light source is an exciting modern imaging method that is enjoying widespread usage in the biomedical sciences. Thus, the present study was undertaken in order to evaluate the use of SHGM microscopy as a means to measure induced cross-linking effects in ex vivo rabbit sclera, following an injection of a chemical cross-linking agent into the sub-Tenon&#39;s space (sT), an injection approach that is standard practice for causing ocular anesthesia during ophthalmologic clinical procedures. The chemical cross-linking agent, sodium hydroxymethylglycinate (SMG), is from a class of cosmetic preservatives known as formaldehyde releasing agents (FARs). Scleral changes following reaction with SMG resulted in increases in SHG signals and correlated with shifts in thermal denaturation temperature, a standard method for evaluating induced tissue cross-linking effects.

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking TXL for Myopia

This protocol describes techniques for evaluating chemical cross-linking of the rabbit sclera using&#160;second harmonic generation imaging and differential scanning calorimetry.

إشارات جيل التوافقي الثاني في أرنب الصلبة كأداة للتقييم للأنسجة العلاجي العابرة للربط (TXL) لقصر النظر

Methods to strengthen tissue by introducing chemical bonds (non-enzymatic cross-linking) into structural proteins (fibrillar collagens) for therapy ...

Oral Biofilm Formation on Different Materials for Dental Implants

Dental implants and their prosthetic components are prone to bacterial colonization and biofilm formation. The use of materials that provides low microbial adhesion may reduce the prevalence and progression of peri-implant diseases. In view of the oral environment complexity and oral biofilm heterogeneity, microscopy techniques are needed that can enable a biofilm analysis of the surfaces of teeth and dental materials. This article describes a series of protocols implemented for comparing oral biofilm formation on titanium and ceramic materials for prosthetic abutments, as well as the methods involved in oral biofilms analyses at the morphological and cellular levels. The in situ model to evaluate oral biofilm formation on titanium and zirconia materials for dental prosthesis abutments as described in this study provides a satisfactory preservation of the 48 h biofilm, thereby demonstrating methodological adequacy. Multiphoton microscopy allows the analysis of an area representative of the biofilm formed on the test materials. In addition, the use of fluorophores and the processing of the images using multiphoton microscopy allows the analysis of the bacterial viability in a very heterogeneous population of microorganisms. The preparation of biological specimens for electron microscopy promotes the structural preservation of biofilm, images with good resolution, and no artifacts.

Here, we present a protocol to evaluate oral biofilm formation on titanium and zirconia materials for dental prosthesis abutments, including the analysis of bacterial cells viability and morphological characteristics. An in situ model associated with powerful microscopy techniques is used for the oral biofilm analysis.

تشكيل بيوفيلم الشفوي في المواد المختلفة لزراعة الأسنان

Dental implants and their prosthetic components are prone to bacterial colonization and biofilm formation. The use of materials that provides low ...

Oral Health Assessment by Lay Personnel for Older Adults

Oral health is an often-undervalued contributor to overall health. The literature, however, underscores the myriad of systemic diseases influenced by oral health, including type II diabetes, heart disease, and atherosclerosis. Thus, assessments of oral health, called oral screenings, have a significant role in assessing risk of disease, managing disease, and even improving disease by oral care. Here we present a method to assess oral health quickly and consistently across time. The protocol is simple enough for non-oral health professionals such as students, family, and caregivers. Useful for any age of patient, the method is particularly key for older individuals who are often at risk of inflammation and chronic disease. Components of the method include existing oral health assessment scales and inventories, which are combined to produce a comprehensive assessment of oral health. Thus, oral characteristics assessed include intraoral and extraoral structures, soft and hard tissues, natural and artificial teeth, plaque, oral functions such as swallowing, and the impact this oral health status has on the patient&#39;s quality of life. Advantages of this method include its inclusion of measures and perceptions of both the observer and patient, and its ability to track changes in oral health over time. Results acquired are quantitative totals of questionnaire and oral screening items, which can be summed for an oral health status score. The scores of successive oral screenings can be used to track the progression of oral health across time and guide recommendations for both oral and overall health care.

The goal of this protocol is to enable non-dental professionals to assess oral health status for research or health-screening purposes. Aspects assessed include lips, tongue, soft and hard tissues, natural and artificial teeth, oral cleanliness, plaque, swallowing, and impact of oral health on quality of life.

تقييم صحة الفم من قبل الموظفين العاديين لكبار السن

Oral health is an often-undervalued contributor to overall health. The literature, however, underscores the myriad of systemic diseases influenced by oral ...

Visualizing Membrane Ruffle Formation using Scanning Electron Microscopy

Membrane ruffling is the formation of motile plasma membrane protrusions containing a meshwork of newly polymerized actin filaments. Membrane ruffles may form spontaneously or in response to growth factors, inflammatory cytokines, and phorbol esters. Some of the membrane protrusions may reorganize into circular membrane ruffles that fuse at their distal margins and form cups that close and separate into the cytoplasm as large, heterogeneous vacuoles called macropinosomes. During the process, ruffles trap extracellular fluid and solutes that internalize within macropinosomes. High-resolution scanning electron microscopy (SEM) is a commonly used imaging technique to visualize and quantify membrane ruffle formation, circular protrusions, and closed macropinocytic cups on the cell surface. The following protocol describes the cell culture conditions, stimulation of the membrane ruffle formation in vitro, and how to fix, dehydrate, and prepare cells for imaging using SEM. Quantification of membrane ruffling, data normalization, and stimulators and inhibitors of membrane ruffle formation are also described. This method can help answer key questions about the role of macropinocytosis in physiological and pathological processes, investigate new targets that regulate membrane ruffle formation, and identify yet uncharacterized physiological stimulators as well as novel pharmacological inhibitors of macropinocytosis.

Macropinocytosis is a highly conserved endocytic process initiated by the formation of F-actin-rich sheet-like membrane projections, also known as membrane ruffles. Increased rate of macropinocytotic solute internalization has been implicated in various pathological conditions. This protocol presents a method to quantify membrane ruffle formation in vitro using scanning electron microscopy.

تصور تشكيل غشاء الكشكشة باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح

Membrane ruffling is the formation of motile plasma membrane protrusions containing a meshwork of newly polymerized actin filaments. Membrane ruffles may ...

Interphase Fluorescence in situ Hybridization of Bone Marrow Smears of Multiple Myeloma

Fluorescence in situ hybridization (FISH) detection is an indispensable method in genetic risk stratification in multiple myeloma (MM), which is one of the most common hematological malignancies. The identifying characteristic of MM is accumulated malignant plasma cells in bone marrow. FISH reports for MM mainly focus on purified or identified clonal plasma cells, rather than all nucleated cells, by sorting with anti-CD138 magnetic beads or marking with cytoplasmic immunoglobulin light chain &#954; or &#955;. Bone marrow interphase nuclei are usually obtained from fresh bone marrow cells. However, satisfactory enrichment of plasma cell specimens requires large amounts of fresh heparin anti-coagulated bone marrow, which cannot be obtained in the case of difficult bone marrow extraction or a bone marrow dry tap. Herein, we establish a novel method to improve the success of FISH detection on stained or unstained bone marrow smears. Bone marrow smears are easier to obtain than anticoagulated bone marrow specimens.

Interphase Fluorescence in situ Hybridization of Bone Marrow Smears of Multiple Myeloma

Here, we present a protocol for improving the success of interphase fluorescence in situ hybridization detection on bone marrow smears from multiple myeloma patients.

التألق بين الأطوار في الموقع تهجين مسحات نخاع العظم من المايلوما المتعددة

Fluorescence in situ hybridization (FISH) detection is an indispensable method in genetic risk stratification in multiple myeloma (MM), which is one of ...

Semi-Automated Planimetric Quantification of Dental Plaque Using an Intraoral Fluorescence Camera

Dental plaque accumulation is quantified using clinical indices or, otherwise, the planimetric plaque index (PPI),&#160;which measures the relative area of a tooth that is covered by plaque deposits. Compared to clinical indices, the PPI has a higher discriminatory power, but traditional planimetry is a time-consuming analysis, as the plaque-covered and clean tooth areas have to be determined manually for each image using image-processing software. Here, we present a method for the semi-automated planimetric quantification of dental plaque, which allows for the rapid processing of up to 1,000 images simultaneously. The method exploits the enhanced contrast between disclosed plaque, sound tooth surfaces, and soft tissues in fluorescence images acquired with an intraoral camera. Careful execution of the clinical procedures and accurate image acquisition are crucial steps for the successful semi-automated identification of the plaque-covered areas. The method is suitable for planimetry on sound facial and oral tooth surfaces, on most composite resin restorations, and on teeth with orthodontic brackets, but not on metallic restorations. Compared to traditional PPI recordings, semi-automated planimetry considerably reduces the amount of time spent on the analysis, as well as the subjective human input, thus increasing the reproducibility of planimetric measurements.

This study presents a semi-automated digital image analysis procedure for the planimetric quantification of disclosed dental plaque based on images acquired with an intraoral fluorescence camera. The method allows for the rapid and reliable quantification of dental plaque in the research environment.

القياس الكمي شبه الآلي للوحة الأسنان باستخدام كاميرا مضان داخل الفم

Dental plaque accumulation is quantified using clinical indices or, otherwise, the planimetric plaque index (PPI),&#160;which measures the relative area ...

التقاط عينات أنسجة التليف تحت المخاطي عن طريق الفم لتحليل المكاني - أوميكس

Isolation of Cells with Morphological and Spatial Information from Oral Submucous Fibrosis Samples by Laser Capture Microdissection

Oral submucous fibrosis (OSF) is a common type of potentially malignant disorder in the oral cavity. The atrophy of epithelium and fibrosis of the lamina propria and the submucosa are often found on histopathological slides. Epithelial dysplasia, epithelial atrophy, and senescent fibroblasts have been proposed to be associated with the malignant transformation of OSF. However, because of the heterogeneity of potentially malignant oral disorders and oral squamous cell carcinoma, it is difficult to identify the specific molecular mechanisms of malignant transformation in OSF. Here, we present a method to obtain a small number of epithelial or mesenchymal cells carrying morphological data and spatial information by laser capture microdissection on formalin-fixed paraffin-embedded tissue slides. Using a microscope, we can precisely capture microscale (~500 cells) dysplastic or atrophic epithelial tissue and fibrotic subepithelial tissue. The extracted cells can be evaluated by genome or transcriptome sequencing to acquire genomic and transcriptomic data with morphological and spatial information. This approach removes the heterogeneity of bulk OSF tissue sequencing and the interference caused by cells in non-lesioned areas, allowing for precise spatial-omics analysis of OSF tissue.

تسليط الضوء على المؤلف: فتح أسرار الأورام الخبيثة المحتملة عن طريق الفم 

Laser capture microdissection of oral submucous fibrosis tissues allows for precise extraction of cells from histological regions of interest for the analysis of multi-omics data with morphological and spatial information.

عزل الخلايا بالمعلومات المورفولوجية والمكانية من عينات التليف تحت المخاطي للفم عن طريق التشريح المجهري لالتقاط الليزر

Oral submucous fibrosis (OSF) is a common type of potentially malignant disorder in the oral cavity. The atrophy of epithelium and fibrosis of the lamina ...