ويقدم البروتوكول طريقة سهلة الأداء لزراعة الأغشية الحيوية عبر المملكة التي تتكون من العقدة. الطفرات والمبيضات ألبيكانس. يسمح قياس نسبة المجهر المستندة إلى المجهر اللاحقة بالرصد الدقيق للتطورات المتعلقة بالحمقط داخل المصفوفة خارج الخلية لتلك الأغشية الحيوية.
الاختيار الدقيق للمعايير الحصول على الصور هو في غاية الأهمية للحصول على بيانات الصورة مع التباين كافية لتحليل لاحق. قياس نسبة الـ (pH) هو طريقة سريعة ودقيقة وغير مكلفة لدراسة تدرجات الـ PH الأفقية والرأسية في الأغشية الحيوية عبر المملكة في الوقت الحقيقي. ويمكن أيضا قياس نسبة الـ (pH) في الأغشية الحيوية الفطرية والبكتيرية البحتة.
تساهم هذه الطريقة في زيادة فهمنا لعملية التمثيل الغذائي الميكروبي في الأغشية الحيوية. إثبات الإجراء لنمو بيو فيلم سيكون أنيت Aakjaer تومسن، وهو فني من مختبري. تنمو S.mutans و C.albicans على لوحات أجار الدم في 37 درجة مئوية في ظل الظروف الهوائية.
ثم نقل مستعمرات واحدة من كل كائن حي لاختبار أنابيب مليئة بخمسة ملليلترات من ضخ القلب في الدماغ وتنمو لهم لمدة 18 ساعة إضافية. في اليوم التالي، والطرد المركزي الثقافات في 1، 200 مرة ز لمدة خمس دقائق والتخلص من الفائق. Resuspend الخلايا في المالحة الفسيولوجية وضبط OD 550 إلى 0.5 لكل من C.albicans وS.mutans.
ثم تمييع تعليق S.mutans 1-10 لتحقيق تركيزات مكافئة. الماصات 50 ميكرولترات من محلول معقمة اللعابية في آبار طبق 96-جيدا القاع البصرية للمجهر. احتضان لوحة لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية، ثم غسل لوحة ثلاث مرات مع 100 ميكرولترات من المالحة الفسيولوجية العقيمة وإفراغ الآبار.
إضافة 100 ميكرولترات من تعليق C.albicans إلى كل بئر، احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة، ثم غسل البئر ثلاث مرات مع المالحة. بعد ذلك، أضف 100 ميكرولترات من مصل الأبقار الجنينية المعطل للحرارة إلى كل بئر. احتضان لوحة لمدة ساعتين، ثم غسله ثلاث مرات مع المالحة.
إفراغ الآبار ولكن ترك خزان 20 ميكرولتر لتجنب قوات القص المفرطة. إضافة 100 ميكروليتر من تعليق S.mutans و 150 ميكرولترات من BHI مع 5٪ السكروز لكل بئر. ثم احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة أو أكثر.
عند زراعة الأغشية الحيوية القديمة، استبدال المتوسط يوميا. في نهاية مرحلة النمو عبر المملكة، اغسل الطبق خمس مرات بالملوحة الفسيولوجية العقيمة. بالنسبة لتصوير نسبة قياس درجة هيدروكسي، استخدم مجهر مسح ليزر مقلوب مع عدسة 63X للنفط أو غمر الماء، وخط ليزر 543 نانومتر، ونظام تصوير طيفي.
استخدام حاضنة لتدفئة مرحلة المجهر إلى 35 درجة مئوية. ضبط كاشف للكشف في وقت واحد من الفلورسين الخضراء من 576 إلى 608 نانومتر وفلوريسنس الأحمر من 629 إلى 661 نانومتر. ثم اختر قوة الليزر المناسبة وكسب لتجنب أكثر وexexposure.
تعيين حجم الثقب إلى وحدة الهواء واحد أو شريحة بصرية من حوالي 0.8 ميكرومتر. ثم قم بتعيين حجم الصورة إلى 512 في 512 بكسل وسرعة المسح الضوئي إلى اثنين. اختر متوسط بند اثنين باستخدام الخيار المتوسط.
إعداد 100 ميكرولترات من المالحة الفسيولوجية العقيمة مع 0.4٪ الجلوكوز مُعزز إلى 7. ثم جعل حل الأسهم من C-SNARF-4 وإضافة الصبغة إلى تركيز النهائي من 30 ميكرومولار. إفراغ واحدة من الآبار مع بيو فيلم عبر المملكة ترك خزان 20 ميكرولتر وإضافة المالحة مع الجلوكوز وصبغة نسبة.
ضع اللوحة على مرحلة المجهر وابدأ التصوير. إعداد سلسلة من 50 ميليمولار MES العازلة مُعَد إلى درجة الH أربعة إلى 7.8 في الزيادات من وحدات 0.2 درجة مئوية في 35 درجة مئوية. ماصة 150 ميكرولترات من كل حل عازلة في آبار من أسفل بصري 96 جيدا لوحة.
أضف الصبغة إلى الآبار المملوءة بالمخزن المؤقت بتركيز 30 ميكرومولار واتركها تهوي لمدة خمس دقائق. دافئة مرحلة المجهر إلى 35 درجة مئوية واختيار نفس الإعدادات كما للتصوير نسبة الرقم الH الموصوفة سابقا. ضع لوحة 96-well على مرحلة المجهر وركز على الجزء السفلي من الآبار.
احصل على صور القنوات الخضراء والأحمر لجميع حلول المخزن المؤقت. على فترات منتظمة، التقاط الصور مع إيقاف تشغيل الليزر لتصحيح إزاحة كاشف. تنفيذ تجربة المعايرة في ثلاث ة و تصدير كافة الصور كملفات TIFF.
تخزين الصور الخضراء والأحمر في مجلدات منفصلة وإعادة تسمية كل من سلسلة من الملفات مع أرقام متسلسلة. استيراد الصور إلى برامج مخصصة لتحليل الصور مثل ImageJ. في الصور التي تم التقاطها مع إيقاف تشغيل الليزر، انقر فوق التحليل والميوغراف البياني لتحديد متوسط كثافة الفلوريسنس.
طرح هذه القيمة من الصور بيو فيلم عن طريق النقر على عملية، والرياضيات، والطرح. ثم استيراد اثنين من سلسلة الصور في دايم وتنفيذ تجزئة على أساس العتبة من الصور قناة حمراء عن طريق النقر على قطعة ، والتجزئة التلقائية ، والحد الأقصى المخصص. تعيين عتبة منخفضة فوق كثافة الفلوراسنس من السيتوبلازم الفطرية والعتبة العالية تحت كثافة جدران الخلايا الفطرية والبكتيريا.
ثم نقل طبقة الكائن من سلسلة الصور المجزأة إلى سلسلة صورة القناة الخضراء عن طريق النقر على الجزء ونقل طبقة الكائن. حذف وحدات البكسل غير الكائن في سلسلة القنوات الحمراء والأخضر. الآن يتم مسح الصور بيو فيلم من الخلايا البكتيرية والفطرية ويمكن تصديرها كملفات TIFF.
استيراد سلسلة الصور مرة أخرى إلى ImageJ وتقسيم سلسلة صورة حمراء في حد ذاته. ثم اضرب النتيجة في سلسلة الصور الأصلية. سلسلة الصور الناتجة مطابقة للأصل باستثناء إزالة كافة وحدات البكسل ذات الكثافة الصفرية.
كرر العملية مع سلسلة الصور الخضراء. بعد ذلك، استخدم متوسط التصفية في كل من سلسلة الصور للتعويض عن ضوضاء الكاشف. تقسيم الأخضر على سلسلة صورة حمراء التي تسفر عن نسبة الأخضر إلى الأحمر لجميع بكسل الكائن.
طوّرت قوّيّة عبر المملكة [بيو فيلم] في البئر لوحات بعد 24 و48 ساعات. وأشارت الخلايا والسلاسل المفردة من S.mutans مجمعة حول hyphae الفطرية والمساحات الكبيرة داخل الخلايا إلى وجود مصفوفة ضخمة. تم تصور قيم الـ pH في المساحة الخارجية الخلية باستخدام جدول بحث.
انخفض مستوى السكر في الخلايا خارج الخلية في الأغشية الحيوية بسرعة في الدقائق الخمس الأولى بعد التعرض للجلوكوز. وبعد ذلك، تباطأت عملية التحمض لتصل عادة إلى قيم تتراوح بين 5.5 و5.8 بعد 15 دقيقة. بسبب التغيرات في درجة اله ( pH ) المحلية ، تغيرت شدة الفلورس في الأغشية الحيوية بمرور الوقت.
أثناء تجزئة الصورة، تم اختيار عتبات عالية ومنخفضة للقضاء بشكل كاف على جميع المناطق التي تغطيها الخلايا البكتيرية والفطرية. وقد تم القضاء على المساحات الزرقاء والخضراء من خلال العتبات المنخفضة والعالية على التوالي. الاختيار الدقيق لبارامترات الحصول على الصور أمر بالغ الأهمية للحصول على تباين جيد بين الخلايا البكتيرية والخلايا الفطرية ومصفوفة البيوفيلم.
إذا نمت الأغشية الحيوية عبر المملكة في خلايا التدفق، يمكن رصد التطورات pH تحت حالة تدفق تحاكي تلك الموجودة في تجويف الفم. وقد استخدمت قياس نسبة الحموضة لتحديد المناطق المحلية في الأغشية الحيوية الأسنان مع انخفاض الرقم الحموضة بشكل خاص، ما يسمى النقاط الساخنة الحمضية.
