فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور Gongpu تشاو كه وDanxia للحصول على الدعم الفني. نشكر الدكاترة. إدوارد Egelman وGrigorieff نيكو لتقاسم البرمجيات ومعالجة الصور. ونحن نقر أيضا الموظفين الذين يدعمون الأحياء الإنشائية البرد EM المرفق وبياولف العنقودية والشبكة في جامعة بيتسبرغ مدرسة الطب. وأيد هذا العمل من قبل وGM082251 GM085043.

1. رطب مجمدة إعداد EM العينة لأن HIV - 1 قفيصة البروتين (CA) التجميعات 9 مستقرة فقط في الملح (كلوريد الصوديوم 1M) العازلة ، مما يساهم في ضجيج الخلفية القوية البرد EM الصور ، نستخدم التخفيف السريع والعودة الجانبية طريقة للحد من النشاف عابر الملح التركيز عند إعداد الشبكة EM مجمدة المائية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصريف توهج الجانب الكربون من 200 شبكة R2 / 1 في إطار شبكات النحاس Quantifoil 25mA لمدة 25 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام البخاخات لجلب الرطوبة في الغرفة البيئية ، ومنزل من صنع الجاذبية دليل الغواص ، إلى 80 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاتحاد الدولي للفروسية في ديوار الغطاس Vitrobot أو الإيثان السائل بارد باستخدام النيتروجين السائل. تحميل ديوار يغرق التجميد على المكبس اليدوي الجاذبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2.5 ميكرولتر من تطبيق الحل CA مجمعة سلفا على الجانب الكربون من الشبكة ، التي شنت على ملقط ، وتحميل ملقط على المكبس مع الجانب الكربون من الشبكة التي تواجه بعيدا عنك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 3 ميكرولتر من الملح العازلة منخفضة التخفيف (100 ملي مول كلوريد الصوديوم) إلى الجانب الخلفي من الشبكة وصمة عار على الفور في الجانب الخلفي من الشبكة مع قطعة من ورق الترشيح. وينبغي على السطح مرة أخرى كلها من الشبكة تكون على اتصال وثيق مع ورقة الترشيح لحوالي 6 ثوان ، قبل إزالة ورقة الترشيح. يغرق الشبكة على الفور الى الايثان السائل بعد إزالة ورقة الترشيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة ملقط من المكبس ونقل بسرعة الى الشبكة الشبكة مربع التخزين. </li></ol> 2. البرد المجهر الإلكتروني المجالس أنبوبي CA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل الشبكة رطب مجمدة الى الاتحاد الدولي للفروسية التشغيل G2 Polara المجهر الالكتروني في 200kv ومزودة كاميرا CCD غاتان 4Kx4K. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت وضع جرعة منخفضة من تفتيش ، في التكبير من ~ 200X وبجرعة &lt;0.001e -- A / 2 ، شاشة شبكة كاملة للمناطق مناسبة مع الثلج وحفظ مواقع هذه المناطق في ملف المرحلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أذكر مواقف حفظها وشاشة أخرى في هذه المجالات من التكبير 3900 x في وضع جرعة منخفضة من تفتيش. تحديد المناطق التي توجد فيها طبقة وموحدة رقيقة من الجليد يحتوي على فصل جيدا ، وأنابيب طويلة أكثر من الثقوب ، لجمع البيانات. حفظ مواقع هذه المناطق في ملف المرحلة الثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل إلى وضع التعرض في التكبير من 59000 س ، أقحم هدفا ميكرومتر 100 الفتحة ، وضبط الهدف وصم وكثافة شعاع لجرعة من ~ 15 ه -- / 2 في التعرض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عودة إلى وضع جرعة منخفضة من عملية البحث ، والانتقال إلى موقف حفظها وتحديد ومركز أنبوب جيدة باستخدام كاميرا CCD. التبديل إلى وضع التركيز ، وضبط التركيز ، وتعيين قيمة يزيل التباؤر ، ميكرومتر عادة بين 0،5-2،5. التبديل إلى وضع التعرض ، تعيين وقت تعرض 0،3-0،5 ثانية ، لجرعة من 15 ه -- / 2 ، وجمع صورة. يتم جمع الصور على الكاميرا لوحة ، وينبغي السماح للأفلام لتسوية لمدة 10 ثانية قبل اتخاذ التعرض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتقال إلى الموضع التالي حفظ وكرر الخطوة 5 لجمع مزيد من الصور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تطوير هذه الأفلام في كامل قوته D19 لمدة 12 دقيقة ورقمية فائقة باستخدام الماسح الضوئي ED نيكون coolscan 9000 بحجم 6.35 ميكرون بكسل. تنسيق ملفات الصور وTIFF. </li></ol> 3. حلزونية الفهرسة يمكن فهرستها من قبل كائن حلزونية معلمتين : ترتيب بسل ، ن ، وطبقة رقم السطر ، ل. كل سطر في طبقة تحويل فورييه ، كما تميزت (ن ، ل) ، يناظر مجموعة من خطوط على سطح شعرية للكائن حلزونية الرمز بواسطة (ح ، ك) الأرقام القياسية ، وذلك باستخدام الرموز من 2D شعرية. عن أي (ح ، ك) ، وهو خط وطبقة (ن هونج كونج ، ل هونج كونج) هو مزيج خطي من اثنين من ناقلات الأساسية (ن 10 ، ل 10) و (ن 01 ، ل 01) ، والتي هي قيم n و لتر من يمكن الحصول على خطين طبقة الرئيسية (1 ، 0) ولتر (0 ، 1). طبقة من ارتفاع خط قياس طول المحور Z في تحويل فورييه. ويمكن تقدير قيمة ن باستخدام المعادلة التالية 10 πRr ≈ ≈ 1،1 J ن | ن | -0.9.....................( 1) حيث J ن هي وظيفة بسل ، الذي يحدد كثافة طبقة ن خط الرابع ، ص هي دائرة نصف قطرها من وجوه حلزونية ، و R هو نصف قطرها من السعة القصوى للخط طبقة. ويرتبط عدد خط طبقة ، ل ، ن لبحكم اختيار 11 ل = أم تينيسي +....................( 2) حيث t و u ثوابت من الحلزون. عن أي الحلزون معين ، قد يكون هناك وحدات ش بالضبط في بالضبط (أو بشكل وثيق جدا) ر جomplete المنعطفات. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مربع من أنبوب مستقيم نسبيا وطويلة مع قطر موحدة باستخدام EMAN في البرنامج 12 helixboxer وحفظ الصور في شكل لجنة نهر الميكونج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد المسافة تكرار حلزونية ، ج ، وذلك باستخدام البرنامج عبر العلاقة القائمة ، مثل &#39;imgccf ، في حزمة MRC 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب تحويل فورييه بطول المربع الجديد الذي يشكل جزءا لا يتجزأ من المسافة تكرار ، ج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار اثنين من خطوط الطبقة الرئيسية التي تحدد شعرية two سطح الناقلة الأساسية (1،0) و (0،1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس قطرها من الأنبوب ، ص ، وارتفاع ونصف قطرها من الخطين الرئيسيين في طبقة تحويل فورييه ، ل 10 ، R 10 ، ل 01 R 01 ، على التوالي (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب ن ن 10 و 01 وفقا لمعادلة (1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منذ يتم تقدير القيم ن فقط ، ويتم الكشف على مجموعات قليلة من ن 10 و 01 ن في خطوات لاحقة (انظر الخطوة 4.2) للعثور على التماثل حلزونية الصحيح باستخدام IHRSR حزمة البرنامج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب التماثل المسمار التي وصفها رقمين الحقيقي : تناوب بين مفارز (Δφ) وارتفاع المحوري (Δz) من الحلزون بنجمة واحدة (ن = 1). نظرا ل 10 ، ل 01 ، ن 10 ، والقيم ن 01 ، يمكن الحصول على وش ر عن طريق اختبار مجموعة من القيم متر (على سبيل المثال ، -50 &lt;م &lt;50) وفقا لقاعدة الاختيار. أخيرا ، وتحسب Δφ Δz باستخدام Δφ = 360 طن / u و Δz = ج / ش. </li></ol> 4. ثلاثي الأبعاد التعمير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجزئة الجسيمات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح صورة مجهرية تحتوي على جزيئات حلزونية ، وذلك باستخدام بوكسر برنامج رسومي ، والذي هو عبارة عن برنامج في حزمة EMAN. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خفض الجسيمات حلزونية الى شرائح متداخلة. في لوحة التحكم من بوكسر ، واختيار وضع اللولب وتعيين المعلمات في رياضة الملاكمة : حجم مربع يجب أن تكون أكبر من قطر من الجسيمات والقيمة عن &#39;OLAP&quot; ينبغي ~ 90 ٪ من حجم الصندوق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد اليسار بالضغط على حد سواء من الجسيمات حلزونية ، سوف تولد تلقائيا بوكسر سلسلة من مربعات الجسيمات على طول الحلزون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ شرائح محاصر فضلا عن الإحداثيات الخاصة بها. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3D إعادة الإعمار الأولية باستخدام برامج IHRSR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقلوب على النقيض من الصور البرد EM وتطبيق تمرير منخفض تصفية 14 (اختياري) قبل تجهيزها مع حلزونية متكررة الحقيقي الفضاء أسلوب إعادة الإعمار (IHRSR). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح واجهة رسومية لبرنامج IHRSR بكتابة &quot;مولد&quot;. توفير واجهة رسومية مع جميع المعلومات عن الجزيئات المكدس محاصر ، بما في ذلك اسم ومسار المكدس ، وعدد الصور في المكدس ، والقيم لمعلمات التناظر ، الخ انقر على زر &quot;إنهاء&quot; لإنشاء البرنامج النصي إعادة الإعمار ، b25.spi. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام اسطوانة صلبة أو جوفاء باعتبارها المرجعية الأولى والسماح للتنقل الداخلي حتى لم تعد هناك أي تغييرات في التماثل المسمار المعرفة ، والذي يحدث عادة بعد بضع دورات. وينبغي أن يكون التماثل حلزونية تعطي الحق التعمير ستابلي المتقاربة. وسوف تستخدم في إعادة الإعمار ولدت في الدورة الماضية مرجعا الأولية لمزيد من الصقل. IHRSR ينفذ باستخدام برامج إعادة الإعمار 3D سبايدر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة الإعمار مع تنقيح تكرارية 15 يستخدم الآن إعادة الإعمار التي تم إنشاؤها بواسطة 3D IHRSR كمرجع أولي لصقل إضافية. خلال صقل والتناظر هو ثابت في Δφ حلزونية وΔz ، والتي تتحدد من الإجراء IHRSR. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد يزيل التباؤر الاستجماتيزم والحاضر في صورة مجهرية باستخدام برامج CTFFIND3 وCTFTILT 16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتضاعف شرائح الجسيمات التي CTF باستخدام برامج سبايدر 17. وتستخدم عملية يطلق FT في جناح سبايدر لحساب تحويل فورييه (FFT) للصورة 2d. بعد ذلك ، هو ضرب من قبل الاتحاد الفرنسي للتنس القيم CTF ، مصممة في الخطوات السابقة ، وذلك باستخدام عملية تسمى MU ضمن جناح سبايدر. القيمة التي تم الحصول عليها ومن ثم تحويلها مرة أخرى عكسية لتشكيل صورة جديدة (CTF لتصحيح) في الفضاء الحقيقي باستخدام عملية سبايدر ، FT مرة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء مطابقة الاسقاط من خلال مقارنة حجم التوقعات من الإشارة مع CTF لتصحيح الصور ، وذلك باستخدام متعددة المرجعية المحاذاة. ويقتصر الاختلاف في زاوية الميل الخروج من الطائرة إلى -10 / + ° و عينات في الخطوات رقم 1. أعرض القيود ، مثل معاملات الارتباط العالية ، في الطائرة بالقرب من زوايا 0 درجة أو 180 درجة مئوية ، ومحدودة X - التحولات ، للمعلمات محاذاة كل قطعة. تدرج في اعادة الاعمار فقط تلك الشرائح التي تفي القيود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد كل دورة صقل تكراري ، يتم إنشاء التعمير 3D باستخدام الإسقاط الخلفي ومقسوما على مجموع CTF2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فرض التماثل حلزونية لتوليد حجم symmetrized. يتم إنهاء صقل تكرارية عندما لا مزيد من التحسن في قرار لإعادة الإعمار 3D جديد يحدث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم استخدام حزمة معالجة سبايدر الصورة لمعظم الخطوات الصقل. يتم التحكم في سلسلة من العمليات التي تقوم بها سبايدر النصية ، والتي تم إنشاؤها من قبل المستخدم التي تحتوي على ملفات التحكم دفعة تسلسل العمليات والقيم المعلمة. يتم حساب باستخدام برامج إعادة الإعمار النهائية في جناح سبايدر. </li></ol></li></ol> 5. ممثل النتائج : وكان احد HIV - 1 CA A92E أنبوب (الشكل 1A) من أصل محاصر ، وكان يحسب لها تحويل فورييه (الشكل 1B) للفهرسة حلزونية. لخطوط طبقة (1 ، 0) و (0 ، 1) ، ل 10 = 28 ، ل 01 = 37 ، ص 10 = 55 ، ص 01 = 44. تعطى نصف قطرها أنبوب 211.57Å ، يقترب نحن ن 10 =- 12 ، ن 01 = 11 (هنا ، ومحددة سلفا من الإنصاف). مع تكرار مسافة 5195.48Å ، تم تحديد التماثل المسمار من الأنبوب كما Δz = 6.8093Å ، Δφ = 328.88 درجة. وتم تنقيح وΔz Δφ ل7.1321Å و328.86 · استخدام IHRSR (الشكل 2A) ، ويظهر في الشكل الأولي التعمير. 2B. تعمير النهائية (الشكل 3) ، وتحسنت بعد تنقيح تكرارية ، والخريطة كثافة بكثير من النموذج الأولي مع احتساب IHRSR (الشكل 2B). <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1. الفهرسة من HIV - 1 أنبوب حلزوني CA. (أ) واحد HIV - 1 A92E CA أنبوب الصورة. مقياس بار ، 30 نانومتر. (ب) وتحويل فورييه من الأنبوب هو موضح في (A). وتدل المؤشرات حلزونية (ن 10 =- 12 ، ن = 01 11). النقاط رأس السهم إلى خط طبقة في القرار 23A. <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2. أولي للتعمير IHRSR به. (أ) تحديد التماثل برغي لكل دورة تكرارية. وΔφ Δz ، بدءا من القيم الأولية ، تتلاقى مع قيم مستقرة بعد 10 دورات متكررة الصقل. (ب) وكثافة 3D الخريطة الأولي بعد 10 دورات متكررة. <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig3.jpg" alt="الشكل 3"/> الشكل 3. الخريطة 3D الكثافة بعد تنقيح تكرارية. (AC) ويتم عرض خريطة كثافة أنابيب CA الى ثلاثة شرائح متعامد : مواز للمحور الأنبوب وعلى مقربة من السطح (A) ، عمودي على محور الأنبوب (B) ، وبالتوازي مع المحور ، ومن خلال أنبوب (C) . أشرطة النطاق ، 10 نانومتر. (د) يجعل سطح خريطة كثافة 3D احيط في 1.8s تضم 100 وحدة التخزين ٪.

<ol>
	<li>Frank, J., Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+single+particles+negatively+stained+or+in+vitreous+ice.">Three-dimensional reconstruction of single particles negatively stained or in vitreous ice.</a> Ultramicroscopy. 46, 241-262 (1992).</li><li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+Purple+Membrane+from+Halobacterium-Halobium+-+Analysis+of+X-Ray-Diffraction+Pattern.">Structure of Purple Membrane from Halobacterium-Halobium - Analysis of X-Ray-Diffraction Pattern.</a> J Mol Biol. 93, 123-128 (1975).</li><li>Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+iterative+helical+real+space+reconstruction+method:+surmounting+the+problems+posed+by+real+polymers.">The iterative helical real space reconstruction method: surmounting the problems posed by real polymers.</a> J Struct Biol. 157, 83-94 (2007).</li><li>Egelman, E. H., Francis, N., Derosier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F-Actin+Is+a+Helix+with+a+Random+Variable+Twist.">F-Actin Is a Helix with a Random Variable Twist.</a> Nature. 298, 131-135 (1982).</li><li>Nogales, E., Whittaker, M., Milligan, R. A., Downing, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+model+of+the+microtubule.">High-resolution model of the microtubule.</a> Cell. 96, 79-88 (1999).</li><li>Jimenez, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+structure+of+an+SH3+amyloid+fibril+and+model+of+the+molecular+packing.">Cryo-electron microscopy structure of an SH3 amyloid fibril and model of the molecular packing.</a> Embo J. 18, 815-821 (1999).</li><li>Butler, P. J., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+particle+of+tobacco+mosaic+virus+from+RNA+and+disks+of+protein.">Assembly of the particle of tobacco mosaic virus from RNA and disks of protein.</a> Nat New Biol. 229, 47-50 (1971).</li><li>Namba, K., Yamashita, I., Vonderviszt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+core+and+central+channel+of+bacterial+flagella.">Structure of the core and central channel of bacterial flagella.</a> Nature. 342, 648-654 (1989).</li><li>Byeon, I. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Convergence+between+Cryo-EM+and+NMR+Reveals+Intersubunit+Interactions+Critical+for+HIV-1+Capsid+Function.">Structural Convergence between Cryo-EM and NMR Reveals Intersubunit Interactions Critical for HIV-1 Capsid Function.</a> Cell. 139, 780-790 (2009).</li><li>Toyoshima, C., Unwin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+the+acetylcholine+receptor+by+cryoelectron+microscopy+and+helical+image+reconstruction.">Three-dimensional structure of the acetylcholine receptor by cryoelectron microscopy and helical image reconstruction.</a> J Cell Biol. 111, 2623-2635 (1990).</li><li>Toyoshima, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+determination+of+tubular+crystals+of+membrane+proteins.+I.+Indexing+of+diffraction+patterns.">Structure determination of tubular crystals of membrane proteins. I. Indexing of diffraction patterns.</a> Ultramicroscopy. 84, 1-14 (2000).</li><li>Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN:+semiautomated+software+for+high-resolution+single-particle+reconstructions.">EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions.</a> J Struct Biol. 128, 82-97 (1999).</li><li>Yonekura, K., Toyoshima, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+determination+of+tubular+crystals+of+membrane+proteins.+IV.+Distortion+correction+and+its+combined+application+with+real-space+averaging+and+solvent+flattening.">Structure determination of tubular crystals of membrane proteins. IV. Distortion correction and its combined application with real-space averaging and solvent flattening.</a> Ultramicroscopy. 107, 1141-1158 (2007).</li><li>van Heel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+electron+cryo-microscopy:+towards+atomic+resolution.">Single-particle electron cryo-microscopy: towards atomic resolution.</a> Q Rev Biophys. 33, 307-369 (2000).</li><li>Sachse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+electron+microscopy+of+helical+specimens:+A+fresh+look+at+Tobacco+Mosaic+Virus.">High-resolution electron microscopy of helical specimens: A fresh look at Tobacco Mosaic Virus.</a> J Mol Biol. 371, 812-835 (2007).</li><li>Mindell, J. A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+determination+of+local+defocus+and+specimen+tilt+in+electron+microscopy.">Accurate determination of local defocus and specimen tilt in electron microscopy.</a> J Struct Biol. 142, 334-347 (2003).</li><li>Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+and+WEB:+Processing+and+visualization+of+images+in+3D+electron+microscopy+and+related+fields.">SPIDER and WEB: Processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields.</a> J Struct Biol. 116, 190-199 (1996).</li><li>Zhang, P. J., Hinshaw, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+dynamin+in+the+constricted+state.">Three-dimensional reconstruction of dynamin in the constricted state.</a> Nat Cell Biol. 3, 922-926 (2001).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

نقدم مجموعة من البروتوكولات لتوفير نهج مباشرة للحصول على هياكل 3D الأجسام حلزونية. باستخدام الإجراءات المذكورة ، حصلنا على هيكل 3D من HIV - 1 قفيصة التجمع من صورة أنبوب واحد (176 شرائح). ويمكن تحقيق أعلى هياكل القرار بما في ذلك المزيد من البيانات الصورة. هناك العديد من النقاط الحاسمة لجمع البيانات وتحليلها الأمثل : أولا ، أثناء إعداد عينة البرد - EM ، يجب أن تكون العينة نشف الحل بعيدا ، وترك موحدة ، طبقة رقيقة من الحل الذي هو أكثر سمكا قليلا من حجم العينة. هناك عدة طرق مختلفة لطخة العينة. لعينات الخلايا البكتيرية وأنبوبي ، مثل HIV - 1 التجمع CA ، النشاف من جانب واحد ، ولا سيما من الجانب الخلفي ، هي الأكثر ملاءمة. الثانية ، والإنصاف من الحلزون يحتاج إلى تحديد ، وهذا لا يمكن أن تقوم به فهرسة حلزونية أو إعادة الإعمار. ومن الممارسات الشائعة هو استخدام تشميد ، تليها دوارة 18 التظليل لتحديد الطغيان. ويمكن أيضا الإنصاف أن تحدد بعد إعادة الإعمار عندما حل الخريطة كثافة عالية بما فيه الكفاية ، ونماذج 3D الذري للعناصر الفردية يجب أن تتوافق جيدا في خريطة الكثافة عندما يتم افتراض الإنصاف الصحيح. خلاف ذلك ، ينبغي أن تولى الطغيان المعاكس. ثالثا ، ينبغي استخدام عامل تصفية فينر خلال معالجة الصور ، سواء بالنسبة لمرحلة التصحيح والسعة ، للحد من التضخيم الضوضاء. منذ CTF من صورة واحدة دائما صفر المعابر ، وفقدان جزء من المعلومات في الفضاء متبادلة. لذا ، فمن الضروري الحصول على بيانات الإسقاط متعددة شملت مجموعات لإعادة الإعمار 3D ، في تصوير كل القيم يزيل التباؤر مختلفة.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم </td><td> مصدر </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> توهج تصريف الجهاز 100X </td><td> توهج تصريف الجهاز 100X </td><td></td></tr><tr><td> Tecnai Polara F30 المجهر مع حقل بندقية الانبعاثات </td><td> الاتحاد الدولي للفروسية ، هيلزبورو ، OR </td><td></td></tr><tr><td> غاتان 4K X كاميرا CCD 4K </td><td> غاتان ، بليزانتون ، كاليفورنيا </td><td></td></tr><tr><td> الغطس للتجميد الجهاز </td><td></td><td> محلية الصنع المكبس اليدوي الجاذبية </td></tr><tr><td> Quantifoil R2 / 1 200 شبكات سلكية النحاس holely الكربون </td><td> Quantifoil مايكرو أدوات ، جينا ، ألمانيا </td><td></td></tr><tr><td> EM البرمجيات EMAN </td><td> <a href="http://blake.bcm.edu/EMAN/">http://blake.bcm.edu/EMAN/</a> </td><td></td></tr><tr><td> EM البرمجيات IHRSR </td><td> <a href="http://people.virginia.edu/~ehe2n/">http://people.virginia.edu/ ~ ehe2n /</a> </td><td> إدوارد المتاحة من البرامج H. Egelman </td></tr><tr><td> EM البرمجيات العنكبوت </td><td> <a href="http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html">http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html</a> </td><td></td></tr><tr><td> MRC تجهيز البرامج القائمة على حلزونية </td><td> <a href="http://www.riken.jp/biostrmech/index.html">http://www.riken.jp/biostrmech/index.html</a> </td><td> المتاحة من البرامج يونيكورا كوجي </td></tr><tr><td> CTFFIND3/CTFTILT وريال مدريد في الفضاء برامج التحسين حلزونية </td><td> <a href="http://emlab.rose2.brandeis.edu/software">http://emlab.rose2.brandeis.edu/software</a> </td><td></td></tr></tbody></table>

structure of hiv-1 capsid assemblies by cryo-electron microscopy and iterative helical real-space reconstruction

البرد المجهر الإلكتروني (البرد م) ، جنبا إلى جنب مع معالجة الصور ، أداة قوية بشكل متزايد لتحديد بنية الجزيئات البروتينية المجمعات والتجمعات. في الواقع ، لقد تم حل واحد المجهر الإلكتروني الجسيمات (1) وثنائية الأبعاد (2D) الإلكترون البلورات 2 أصبحت روتينية منهجيات نسبيا وعدد كبير من الهياكل باستخدام هذه الأساليب. في الوقت نفسه ، وقد وضعت ومعالجة الصور ثلاثية الأبعاد (3D) إعادة بناء الأجسام حلزونية بسرعة ، وخاصة ، وتكرارية حلزونية الحقيقي الفضاء إعادة الإعمار (IHRSR) الأسلوب 3 ، والذي يستخدم أدوات التحليل واحد الجسيمات بالتعاون مع التماثل حلزونية. العديد من الكيانات البيولوجية وظيفة في أشكال حلزونية أو الخيطية ، بما في ذلك شعيرات أكتين 4 ، ميكروتثبول 5 ، 6 ألياف اميلويد ، والفيروسات فسيفساء التبغ 7 و 8 سياط الجراثيم ، وأنه يمكن التوصل إلى خريطة كثافة 3D كيان حلزونية من الإسقاط واحد الصورة ، بالمقارنة مع العديد من الصور المطلوبة لإعادة الإعمار 3D لكائن غير حلزونية ، مع أسلوب IHRSR ، التحليل البنيوي لهذه الجمعيات حلزونية مرنة والمختلين الآن يمكن بلوغه. في هذه المقالة الفيديو ، ونحن نقدم بروتوكولات وإجراءات تفصيلية للحصول على خريطة كثافة 3D التجمع من البروتين حلزونية (HIV - 1 قفيصة 9 هو مثالنا) ، بما في ذلك بروتوكولات للتحضير العينة البرد EM ، وانخفاض جمع البيانات عن طريق جرعة والبرد EM ، وفهرسة أنماط الحيود حلزونية ، ومعالجة الصور وإعادة الإعمار 3D باستخدام IHRSR. مقارنة مع التقنيات الأخرى ، والبرد EM عروض الأمثل في ظل ظروف الحفاظ على عينة الأصلي القريب. هي جزء لا يتجزأ العينات في طبقة رقيقة من الجليد الزجاجي ، من خلال تجميد السريع ، وتصويرها في المجاهر الإلكترونية في درجة حرارة النتروجين السائل ، في ظل ظروف جرعة منخفضة للحد من أضرار الإشعاع. ويتم الحصول على عينة من الصور الأصلية في ظل ظروف قرب على حساب إشارة منخفضة وعلى النقيض من انخفاض في micrographs مسجل. لحسن الحظ ، تم إلى حد كبير عملية إعادة الإعمار حلزونية الآلي ، مع استثناء من فهرسة نمط حيود حلزونية. هنا ، نحن تصف نهجا للبنية حلزونية وتحديد مؤشر التماثلات حلزونية (لولبية المعلمات) من micrographs الرقمية ، وهي خطوة ضرورية لإعادة الإعمار 3D حلزونية. باختصار ، نحصل على كثافة 3D الخريطة الأولية عن طريق تطبيق أسلوب IHRSR. ومن ثم صقل هذه خريطة أولية تكرارا عن طريق إدخال قيود للمعلمات محاذاة كل قطعة ، وبالتالي السيطرة على درجة من الحرية. ويتم تحقيق مزيد من التحسن عن طريق تصحيح للالمقابل نقل وظيفة (CTF) من المجهر الالكتروني (السعة ومرحلة التصحيح) ، وتحقيق الاستفادة المثلى من التماثل حلزونية من التجميع.

Watch this Scientific Journal Video about Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction at JoVE.com

Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

توضح هذه المقالة طريقة للحصول على ثلاثي الأبعاد (3D) بنية الجزيئات helically تجميعها باستخدام البرد المجهر الإلكتروني. في هذا البروتوكول ، ونحن نستخدم تجميعات HIV - 1 قفيصة مفصلة لتوضيح الإجراء إعادة الإعمار 3D لتحقيق خريطة كثافة من تكرارية حلزونية طريقة اعادة الاعمار الحقيقية في الفضاء.

هيكل HIV - 1 بواسطة جمعيات قفيصة البرد المجهر الإلكتروني وتكرارية حلزوني الإعمار الحقيقي الفضاء

Cryo-electron microscopy (cryo-EM), combined with image processing, is an increasingly powerful tool for structure determination of macromolecular protein ...

structure-hiv-1-capsid-assemblies-cryo-electron-microscopy-iterative

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.3K Views.  University of Pittsburgh School of Medicine. توضح هذه المقالة طريقة للحصول على ثلاثي الأبعاد (3D) بنية الجزيئات helically تجميعها باستخدام البرد المجهر الإلكتروني. في هذا البروتوكول ، ونحن نستخدم تجميعات HIV - 1 قفيصة مفصلة لتوضيح الإجراء إعادة الإعمار 3D لتحقيق خريطة كثافة من تكرارية حلزونية طريقة اعادة الاعمار ا...

Video: Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

Assessment of Immunologically Relevant Dynamic Tertiary Structural Features of the HIV-1 V3 Loop Crown R2 Sequence by ab initio Folding

The antigenic diversity of HIV-1 has long been an obstacle to vaccine design, and this variability is especially pronounced in the V3 loop of the virus' surface envelope glycoprotein. We previously proposed that the crown of the V3 loop, although dynamic and sequence variable, is constrained throughout the population of HIV-1 viruses to an immunologically relevant &beta;-hairpin tertiary structure. Importantly, there are thousands of different V3 loop crown sequences in circulating HIV-1 viruses, making 3D structural characterization of trends across the diversity of viruses difficult or impossible by crystallography or NMR. Our previous successful studies with folding of the V3 crown1, 2 used the ab initio algorithm 3 accessible in the ICM-Pro molecular modeling software package (Molsoft LLC, La Jolla, CA) and suggested that the crown of the V3 loop, specifically from positions 10 to 22, benefits sufficiently from the flexibility and length of its flanking stems to behave to a large degree as if it were an unconstrained peptide freely folding in solution. As such, rapid ab initio folding of just this portion of the V3 loop of any individual strain of the 60,000+ circulating HIV-1 strains can be informative. Here, we folded the V3 loop of the R2 strain to gain insight into the structural basis of its unique properties. R2 bears a rare V3 loop sequence thought to be responsible for the exquisite sensitivity of this strain to neutralization by patient sera and monoclonal antibodies4, 5. The strain mediates CD4-independent infection and appears to elicit broadly neutralizing antibodies. We demonstrate how evaluation of the results of the folding can be informative for associating observed structures in the folding with the immunological activities observed for R2.

Assessment of Immunologically Relevant Dynamic Tertiary Structural Features of the HIV-1 V3 Loop Crown R2 Sequence by ab initio Folding

The crown region of different V3 loop sequences of the surface envelope glycoprotein (gp120) of HIV-1 can be structurally characterized in many cases by in silico folding of positions 10 to 22 of the loop using a state-of-the-art ab initio folding algorithm. Here we demonstrate the folding and evaluation of this region of the V3 loop from the R2 strain of HIV-1, a uniquely neutralization sensitive strain with puzzling functional properties.

تقييم ميزات التعليم العالي ذات الصلة مناعيا الديناميكية الهيكلية للHIV - 1 حلقة V3 تسلسل R2 بواسطة ولي العهد منذ البداية للطي

The antigenic diversity of HIV-1 has long been an obstacle to vaccine design, and this variability is especially pronounced in the V3 loop of the virus' ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

الاستدلال الوراثي من HIV - 1 Tropism باستخدام السكان على أساس تسلسل V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) such investigations can take several days1,2 and are therefore not suited for a rapid diagnosis of plant virus diseases. Microwave fixation can be used to drastically reduce sample preparation time for TEM investigations with similar ultrastructural results as observed after conventionally sample preparation3-5. Many different custom made microwave devices are currently available which can be used for the successful fixation and embedding of biological samples for TEM investigations5-8. In this study we demonstrate on Tobacco Mosaic Virus (TMV) infected Nicotiana tabacum plants that it is possible to diagnose ultrastructural alterations in leaves in about half a day by using microwave assisted sample preparation for TEM. We have chosen to perform this study with a commercially available microwave device as it performs sample preparation almost fully automatically5 in contrast to the other available devices where many steps still have to be performed manually6-8 and are therefore more time and labor consuming. As sample preparation is performed fully automatically negative staining of viral particles in the sap of the remaining TMV-infected leaves and the following examination of ultrastructure and size can be performed during fixation and embedding.

This study describes a method that allows the rapid and clear diagnosis of plant virus diseases in about half a day by using a combination of microwave assisted plant sample preparation for transmission electron microscopy and negative staining methods.

الميكروويف بمساعدة التشخيص السريع للأمراض النباتية من الفيروسات المجهر الإلكتروني ناقل

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by the majority of HIV strains in order to infect the human immune cells (Fig. 1). Other HIV isolates use a different coreceptor, the CXCR4. Which receptor is used, is determined in the virus by the Env protein (Fig. 2). Depending on the coreceptor used, the viruses are classified as R5 or X4, respectively. MVC binds to the CCR5 receptor inhibiting the entry of R5 viruses into the target cell. During the course of disease, X4 viruses may emerge and outgrow the R5 viruses. Determination of coreceptor usage (also called tropism) is therefore mandatory prior to administration of MVC, as demanded by EMA and FDA. 
The studies for MVC efficiency MOTIVATE, MERIT and 1029 have been performed with the Trofile assay from Monogram, San Francisco, U.S.A. This is a high quality assay based on sophisticated recombinant tests. The acceptance for this test for daily routine is rather low outside of the U.S.A., since the European physicians rather tend to work with decentralized expert laboratories, which also provide concomitant resistance testing. These laboratories have undergone several quality assurance evaluations, the last one being presented in 20111.
For several years now, we have performed tropism determinations based on sequence analysis from the HIV env-V3 gene region (V3)2. This region carries enough information to perform a reliable prediction. 
The genotypic determination of coreceptor usage presents advantages such as: shorter turnover time (equivalent to resistance testing), lower costs, possibility to adapt the results to the patients' needs and possibility of analysing clinical samples with very low or even undetectable viral load (VL), particularly since the number of samples analysed with VL&lt;1000 copies/&mu;l roughly increased in the last years (Fig. 3).
The main steps for tropism testing (Fig. 4) demonstrated in this video: 
1. Collection of a blood sample 
 2. Isolation of the HIV RNA from the plasma and/or HIV proviral DNA from blood mononuclear cells 
 3. Amplification of the env region 
 4. Amplification of the V3 region 
 5. Sequence reaction of the V3 amplicon 
 6. Purification of the sequencing samples 
 7. Sequencing the purified samples 
 8. Sequence editing 
 9. Sequencing data interpretation and tropism prediction

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

The prediction of the coreceptor usage of HIV-1 is required for the administration of a new class of antiretroviral drugs, i.e. coreceptor antagonists. It can be performed by sequence analysis of the env gene and subsequent interpretation through an internet based interpretation system (geno2pheno[coreceptor]).

التنبؤ الإشتخدام HIV-1 Coreceptor (Tropism) من خلال تحليل تسلسل الوراثي باستخدام نهج

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

Uncoating في المختبر من HIV - 1 النوى

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

أدوات جديدة لتوسيع الخلايا التائية التنظيمية من الأفراد HIV-1-المصابة

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

تقييم الفطرية الاستشعار من HIV-1 CD4 المصابة<sup&gt; +</sup&gt; T الخلايا عن طريق الخلايا الجذعية بلازماوية الشكل باستخدام<em&gt; خارج الحي</em&gt; المشارك ثقافة النظام.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

تقييم بتكوين لHIV-1 مغلف مثلوثي بروتينات سكرية باستخدام خلية القاعدة ELISA الفحص

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

عزل Exosomes من البلازما من HIV-1 الأفراد ايجابية

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

قياس ل<em&gt; في المختبر</em&gt; التكامل آخر من HIV-1 Preintegration مجمعات

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...