Yazarlar, teknik destek için Dr. Gongpu Zhao ve Danxia Ke teşekkür etmek istiyorum. Biz Dr teşekkür ederim. Edward ve görüntü işleme yazılımları paylaşmak için Egelman ve Niko Grigorieff. Ayrıca, Yapısal cryo-EM tesis Biyoloji ve University of Pittsburgh Tıp Okulu Beowulf ve ızgara destek personeli kabul etmiş sayılırsınız. Bu çalışma GM082251 ve GM085043 tarafından desteklenmiştir.

1. Frozen-sulu EM numune hazırlama HIV-1 kapsid protein (CA) derlemeleri 9 cryo-EM görüntüler güçlü bir arka plan gürültü katkıda bulunan yüksek tuz (NaCl) 1M tampon, sadece kararlı olduğundan, biz geçici tuzu azaltmak için hızlı bir seyreltme ve arka tarafında blot yöntemi kullanın konsantrasyonu dondurulmuş sulu EM ızgara hazırlanıyor. <ol><li> 25 saniye için 200-örgü R2 / 1 Quantifoil bakır ızgaralar 25mA altında Glow deşarj karbon tarafında. </li><li> % 80 nem, ev yapımı bir el yerçekimi piston, çevre odasında getirmek için bir nebülizatör kullanın. </li><li> FEI Vitrobot Piston Dewar, sıvı nitrojen kullanarak serin sıvı etan. Dalma dondurma Dewar manuel yerçekimi piston üzerine monte edin. </li><li> Forseps üzerine monte edilmiş ızgara, karbon yüzüne 2.5 ul önceden monte edilmiş CA çözüm uygulayın ve forseps karbon yüzü size dönük ızgara piston üzerine yük. </li><li> Izgara, arka tarafına, düşük tuz seyreltme tamponu (100 mM NaCl) 3 ul ekleyin ve filtre kağıdı bir parça ızgara arka tarafında hemen kurulayın. Izgara tüm arka yüzeyine filtre kağıdı çıkarmadan önce, yaklaşık 6 saniye filtre kağıdı ile yakın temas halinde olmalıdır. Izgara filtre kağıdı çıkardıktan sonra hemen sıvı etan içine dalıyoruz. </li><li> Piston forseps çıkarın ve ızgara ızgara saklama kutusu içine hızlı bir şekilde aktarmak. </li></ol> 2. CA borulu Cryo-elektron mikroskobu <ol><li> 200kv FEI Polara G2 elektron mikroskobu işletim dondurulmuş sulu ızgara Yük ve Gatan 4Kx4K CCD kamera ile donatılmıştır. </li><li> Düşük doz arama modu, ~ 200x büyütme altında ve bir doz &lt;0.001e - / Å 2, ekran uygun buz ve bir aşama dosyasını bu alanların konumları kaydetmek alanlar için tüm ızgara. </li><li> Düşük doz arama modunda 3900 x büyütme kayıtlı pozisyonları ve bu alanlarda daha fazla ekran hatırlayın. Veri toplama, delik üzerinde iyi ayrılmış, uzun tüpler içeren buz düzgün, ince bir tabaka ile alanları seçin. Ikinci bir aşama dosyasını bu alanların yerleri kaydedin. </li><li> 59.000 x büyütme, içerlek 100 mikron objektif diyafram pozlama modu Switch ve ~ 15 e bir doz için objektif stigmatism ve ışın yoğunluğunu ayarlayın başına / Å 2 poz. </li><li> Düşük doz arama moduna dönün, kayıtlı bir konuma taşımak ve CCD kamera kullanarak iyi bir tüp belirlemek ve merkez. Odak moduna geçer, odak ayarlamak ve bulanıklaştırma değerini ayarlamak, normalde arasında 0,5 - 2,5 mm. Pozlama modu Switch, 15 e bir doz, 0.3-0.5 saniyelik bir pozlama süresi seti - 2 / a, ve bir görüntü toplamak. Bir tabak kamera görüntüleri toplanır ve bir pozlama çekilmeden önce filmler 10 saniye boyunca yerleşmek için izin verilmelidir. </li><li> Sonraki kaydedilen pozisyona taşıyın ve daha fazla görüntü toplamak için 5. adımı yineleyin. </li><li> Filmler, 12 dakika için tam güç D19 geliştirilen ve 6.35 mikron piksel boyutu Nikon Super COOLSCAN 9000 ED, tarayıcı ile dijital. Görüntü dosyalarının formatı TIFF. </li></ol> 3. Helisel indeksleme Sarmal bir nesne iki parametre endeksli olabilir: Bessel sipariş, n, ve katman hattı sayısı, l. Fourier dönüşümü (n, l) ile karakterize Her katman, 2D bir kafes notasyonu kullanarak, (h, k) endeksleri ifade sarmal nesnenin yüzey kafes çizgiler kümesi karşılık gelir. Herhangi bir (h, k), bir (n HK, l HK) katmanı hattı, n ve l değerleri iki temel vektörleri (n = 10, l 10) ve (n = 01, l 01), doğrusal bir kombinasyonu başlıca iki tabaka hatları (1, 0) ve (0, 1) l, Fourier dönüşümü, Z ekseni boyunca ölçülen tabaka satır yüksekliği elde edilebilir. N değeri aşağıdaki denklem 10 kullanılarak tahmin edilebilir πRr ≈ J n ≈ 1.1 | n | -0.9 .....................( 1) J n n&#39;inci katman hattının yoğunluğunu belirleyen Bessel fonksiyonu, nerede, r yarıçapı sarmal nesne ve katman hattının maksimum genlik R yarıçapı. Katman satır numarasını, l, n seçim kuralı 11 ile ilgili l = tn + um ....................( 2) t ve u sarmal sabitler. Herhangi bir sarmal için, (ya da çok yakından) aynen t c tam u birimleri olabiliromplete döner. <ol><li> EMAN programı 12 helixboxer ve MRC formatında görüntü kaydetmek kullanarak düzgün bir çapa ile nispeten düz ve uzun bir tüp dışarı Kutusu. </li><li> MRC paketi 13 &#39;imgccf&#39; gibi çapraz korelasyon tabanlı bir program kullanarak sarmal tekrar mesafe, c, belirleyin. </li><li> Fourier dönüşümü, tekrar mesafe, c ayrılmaz yeni bir kutu süresini hesaplayın . </li><li> Iki temel yüzey örgü vektörleri (1,0) ve (0,1) iki temel tabaka hatları seçin. </li><li> Tüp yarıçapı, r, Fourier dönüşümü, l 10, R 10, sırasıyla l 01 R 01, (Şekil 1), iki ana katman hatları yükseklik ve yarıçapı ölçün . </li><li> N 10 ve n 01, denklem (1) &#39;e göre hesaplayın. </li><li> N değerleri yalnızca tahmin olduğundan, birkaç kombinasyonları n 10 ve n 01 program paketi IHRSR kullanarak doğru sarmal simetri bulmak için (4.2 adım) daha sonraki adımda test edilmektedir . </li><li> Alt birimden (Δφ) ve tek-yıldızlı sarmalın eksenel artış (Δz) (n = 1) arasında rotasyon iki gerçek sayının tarafından açıklanan vida simetri hesaplayın. L 10, 01, l n = 10 ve n 01 değerleri göz önüne alındığında, u, t, m değerleri aralığı (örneğin, -50 &lt;m &lt;50) seçim kuralına göre test elde edilebilir Son olarak, Δφ ve Δz kullanılarak hesaplanmıştır Δφ = 360 t / u ve Δz = c / u. </li></ol> 4. Üç boyutlu rekonstrüksiyon <ol><li> Parçacık segmentasyon <ol><li> EMAN paket bir program grafik programı Boxer, kullanarak, sarmal parçacıklar içeren bir mikrografı açın. </li><li> Sarmal parçacık örtüşen bölümler halinde kesin. Boxer kontrol paneli, Helix modunu seçebilir ve boks için parametreleri ayarlayın: kutusunun boyutu, partikül çapı ve &#39;Olap&#39; kutusu boyutu ~% 90 olmalıdır değeri daha büyük olmalıdır. </li><li> Sarmal parçacığın her iki uçta da sol tıkladıktan sonra, Boxer sarmalın uzunluğu boyunca bir dizi parçacık kutuları otomatik olarak üretecektir. </li><li> Kutulu segmentleri yanı sıra onların koordinatlarını kaydedin. </li></ol></li><li> İlk 3 boyutlu rekonstrüksiyon IHRSR programları kullanarak <ol><li> Cryo-EM görüntülerin kontrast ters çevirin ve iteratif sarmal gerçek uzay rekonstrüksiyon yöntemi (IHRSR) ile işleme önce 14 (isteğe bağlı) filtreleme alçak geçiren uygulamak. </li><li> &quot;Generator&quot; yazarak grafik arayüzü IHRSR programı açın. Kutulu parçacıklar yığınının adını ve yolunu yığın yığın görüntülerin sayısı da dahil olmak üzere tüm bilgi, grafik arayüzü sağlayın, simetri parametreler için değerler, vb yeniden yapılanma komut dosyası oluşturmak için &quot;Finish&quot; düğmesine tıklayın. b25.spi. </li><li> Katı veya içi boş silindir ilk bir referans olarak kullanın ve genellikle birkaç döngüsünden sonra oluşur tanımlanan vida simetri hiçbir değişiklik olana kadar geçiş yapmak için prosedür izin. Doğru bir sarmal simetri stably bir tümleşik yeniden yapılanma vermelidir. Son döngüsünde oluşturulan yeniden yapılanma için bir başlangıç ​​daha fazla arıtma referans olarak kullanılacaktır. IHRSR ÖRÜMCEK programları kullanarak 3 boyutlu rekonstrüksiyon gerçekleştirir. </li></ol></li><li> Iteratif arıtma 15 ile İmar IHRSR tarafından oluşturulan 3 boyutlu rekonstrüksiyon artık ek bir arıtma için ilk referans olarak kullanılır. Arıtma sırasında, sarmal simetri Δφ ve Δz, IHRSR prosedürü belirlenir sabittir. <ol><li> Odak ve astigmatizma mevcut programları CTFFIND3 ve CTFTILT 16 mikrografı belirleyin. </li><li> ÖRÜMCEK programları kullanarak 17 CTF parçacık segmentleri çarpın. ÖRÜMCEK suite FT olarak adlandırdığı operasyon 2B görüntü Fourier dönüşümü (FFT) hesaplamak için kullanılır. Bundan sonra, FFT ÖRÜMCEK paketi içinde MU olarak adlandırılan işlemi kullanarak, önceki adımlarda belirlenen, CTF değerleri ile çarpılır. Elde edilen değer, daha sonra ters ÖRÜMCEK işlemi kullanarak gerçek uzayda yeni bir resim (CTF düzeltilmiş) formuna geri dönüştürülmüş, FT tekrar. </li><li> Çok referans hizalama kullanılarak referans hacimleri projeksiyonları, CTF-düzeltilmiş görüntüleri karşılaştırarak projeksiyon eşleşen gerçekleştirin. Düzlem-dışı eğim açısı değişimi + / -10 ° ve 1 ° adımları örneklenir. Her segmentin hizalama parametreler için, bu tür yüksek korelasyon katsayıları gibi sınırlamalar, 0 ° veya 180 °, ve x-vardiya sınırlı yakınında düzlem açıları tanıtın. Kısıtlamaları karşılamak yeniden yapılanma, sadece bu bölümlerini içerir. </li><li> Her arıtma döngüsü yinelemeli sonra, 3D rekonstrüksiyon CTF üzerinden toplamı geri projeksiyon kullanarak üretilen ve bölünmüş.2. </li><li> Sarmal simetri simetrik olmadı hacmi oluşturmak için uygulanmalıdır. Yeni 3 boyutlu rekonstrüksiyon çözünürlükte daha fazla iyileşme meydana geldiğinde iteratif arıtma sonlandırıldı. </li><li> Görüntü işleme paketi ÖRÜMCEK arıtma adımları çoğu için kullanılır. Bir dizi operasyon, operasyon ve parametre değerleri dizileri içeren kullanıcı tarafından oluşturulan toplu denetim dosyaları ÖRÜMCEK scriptleri, tarafından kontrol edilir. Nihai yeniden yapılanma ÖRÜMCEK suite programları kullanılarak hesaplanır. </li></ol></li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Tek bir HIV-1 CA A92E tüp (Şekil 1a) kutulu çıkışı ve onun Fourier dönüşümü (Şekil 1b) sarmal indeksleme için hesaplandı. L 10 tabaka hatları (1, 0) ve (0, 1) = 28, 01 L = 37, R 10 = 55, R 01 = 44. 211.57Å bir tüp yarıçapı göz önüne alındığında, biz yaklaştırılmış n 10 = 12, n 01 = 11 (burada, ellilik önceden belirlenmiş). 5195.48Å tekrar mesafesi ile, tüp vidalı simetri Δz olarak belirlendi = 6.8093Å Δφ = 328,88 °. Δz ve Δφ 7.1321Å ve 328,86 rafine ° IHRSR (Şekil 2a) ve ilk rekonstrüksiyon Şekil kullanarak. 2b. Nihai yeniden yapılanma (Şekil 3), arıtma yinelemeli sonra, IHRSR (Şekil 2b) ile hesaplanan ilk model yoğunluk haritası önemli ölçüde geliştirilmiş. <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1, HIV-1 CA helisel tüp Endeksleme . (A) tek bir HIV-1 CA A92E tüp görüntü. Ölçeği bar, 30 nm. (B) (A) gösterilen tüp Fourier dönüşümü. Helisel indeksleri (n = 10 = 12, n 01 = 11) gösterilir. 23a çözünürlükte katman çizgiye ok ucu noktaları. <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2 IHRSR kullanan bir ilk rekonstrüksiyon. (A) her yinelemeli döngüsü için Vida simetri belirlenmesi. 10 arıtma döngüleri iteratif Δφ ve Δz sonra, ilk değerlerinden başlayarak, sabit değerler yakınsar. (B) 10 saniye sonra ilk 3D yoğunluk haritası döngüleri yinelemeli. <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3. Iteratif arıtma sonra 3D yoğunluk haritası. (AC) CA tüplerin yoğunluğu haritası üç ortogonal dilim olarak görüntülenir: tüp eksenine paralel ve dik tüp ekseni (B), yüzey (A) yakın ve paralel olarak tüp ekseni (C) aracılığıyla . Ölçek barlar, 10 nm. (D)% 100 hacim içine 1.8s 3D yoğunluk haritası Yüzey render konturlu.

<ol>
	<li>Frank, J., Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+single+particles+negatively+stained+or+in+vitreous+ice.">Three-dimensional reconstruction of single particles negatively stained or in vitreous ice.</a> Ultramicroscopy. 46, 241-262 (1992).</li><li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+Purple+Membrane+from+Halobacterium-Halobium+-+Analysis+of+X-Ray-Diffraction+Pattern.">Structure of Purple Membrane from Halobacterium-Halobium - Analysis of X-Ray-Diffraction Pattern.</a> J Mol Biol. 93, 123-128 (1975).</li><li>Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+iterative+helical+real+space+reconstruction+method:+surmounting+the+problems+posed+by+real+polymers.">The iterative helical real space reconstruction method: surmounting the problems posed by real polymers.</a> J Struct Biol. 157, 83-94 (2007).</li><li>Egelman, E. H., Francis, N., Derosier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F-Actin+Is+a+Helix+with+a+Random+Variable+Twist.">F-Actin Is a Helix with a Random Variable Twist.</a> Nature. 298, 131-135 (1982).</li><li>Nogales, E., Whittaker, M., Milligan, R. A., Downing, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+model+of+the+microtubule.">High-resolution model of the microtubule.</a> Cell. 96, 79-88 (1999).</li><li>Jimenez, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+structure+of+an+SH3+amyloid+fibril+and+model+of+the+molecular+packing.">Cryo-electron microscopy structure of an SH3 amyloid fibril and model of the molecular packing.</a> Embo J. 18, 815-821 (1999).</li><li>Butler, P. J., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+particle+of+tobacco+mosaic+virus+from+RNA+and+disks+of+protein.">Assembly of the particle of tobacco mosaic virus from RNA and disks of protein.</a> Nat New Biol. 229, 47-50 (1971).</li><li>Namba, K., Yamashita, I., Vonderviszt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+core+and+central+channel+of+bacterial+flagella.">Structure of the core and central channel of bacterial flagella.</a> Nature. 342, 648-654 (1989).</li><li>Byeon, I. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Convergence+between+Cryo-EM+and+NMR+Reveals+Intersubunit+Interactions+Critical+for+HIV-1+Capsid+Function.">Structural Convergence between Cryo-EM and NMR Reveals Intersubunit Interactions Critical for HIV-1 Capsid Function.</a> Cell. 139, 780-790 (2009).</li><li>Toyoshima, C., Unwin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+the+acetylcholine+receptor+by+cryoelectron+microscopy+and+helical+image+reconstruction.">Three-dimensional structure of the acetylcholine receptor by cryoelectron microscopy and helical image reconstruction.</a> J Cell Biol. 111, 2623-2635 (1990).</li><li>Toyoshima, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+determination+of+tubular+crystals+of+membrane+proteins.+I.+Indexing+of+diffraction+patterns.">Structure determination of tubular crystals of membrane proteins. I. Indexing of diffraction patterns.</a> Ultramicroscopy. 84, 1-14 (2000).</li><li>Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN:+semiautomated+software+for+high-resolution+single-particle+reconstructions.">EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions.</a> J Struct Biol. 128, 82-97 (1999).</li><li>Yonekura, K., Toyoshima, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+determination+of+tubular+crystals+of+membrane+proteins.+IV.+Distortion+correction+and+its+combined+application+with+real-space+averaging+and+solvent+flattening.">Structure determination of tubular crystals of membrane proteins. IV. Distortion correction and its combined application with real-space averaging and solvent flattening.</a> Ultramicroscopy. 107, 1141-1158 (2007).</li><li>van Heel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+electron+cryo-microscopy:+towards+atomic+resolution.">Single-particle electron cryo-microscopy: towards atomic resolution.</a> Q Rev Biophys. 33, 307-369 (2000).</li><li>Sachse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+electron+microscopy+of+helical+specimens:+A+fresh+look+at+Tobacco+Mosaic+Virus.">High-resolution electron microscopy of helical specimens: A fresh look at Tobacco Mosaic Virus.</a> J Mol Biol. 371, 812-835 (2007).</li><li>Mindell, J. A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+determination+of+local+defocus+and+specimen+tilt+in+electron+microscopy.">Accurate determination of local defocus and specimen tilt in electron microscopy.</a> J Struct Biol. 142, 334-347 (2003).</li><li>Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+and+WEB:+Processing+and+visualization+of+images+in+3D+electron+microscopy+and+related+fields.">SPIDER and WEB: Processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields.</a> J Struct Biol. 116, 190-199 (1996).</li><li>Zhang, P. J., Hinshaw, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+dynamin+in+the+constricted+state.">Three-dimensional reconstruction of dynamin in the constricted state.</a> Nat Cell Biol. 3, 922-926 (2001).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz sarmal nesnelerin 3D yapılar elde etmek için basit bir yaklaşım sağlamak için bir dizi protokoller mevcut. Açıklanan prosedürleri kullanarak, tek bir tüp görüntü (176 parça), HIV-1 kapsid montaj 3 boyutlu bir yapı elde etti. Yüksek çözünürlüklü yapıları, daha fazla görüntü verilerinin de dahil elde edilebilir. En uygun veri toplama ve analiz için pek çok kritik nokta vardır: Birincisi cryo-EM örneğinin hazırlanması sırasında, örnek çözümü örneklem büyüklüğü biraz daha kalın bir çözüm üniforma, ince bir tabaka bırakarak uzakta, lekelenen olmalıdır. Örnek blot için birkaç farklı yolu vardır. Bakteri hücreleri ve HIV-1 CA montaj gibi borulu örnekler, özellikle arka-yan, bir tarafı blot için çok uygundur. İkincisi, sarmalın ellilik bu sarmal indeksleme ya da yeniden yapılamaz olarak tespit edilmesi gerekiyor. Döner ellilik belirlemek için 18 gölgeleme takip dondurma yakma, ortak bir uygulama kullanmak için. Ellilik, yoğunluk haritası çözünürlük yeterince yüksek olduğunda da yeniden yapılandırma sonrası tespit edilebilir, doğru bir ellilik varsayılır bileşenleri tek tek 3 boyutlu atom modelleri de yoğunluk haritasına uygun olmalıdır. Aksi takdirde, bunun tam tersi ellilik kabul edilmelidir. Üçüncü olarak, Wiener filtresi, gürültüyü amplifikasyon azaltmak için, her iki faz ve genlik düzeltme için görüntü işleme sırasında kullanılan olmalıdır. Tek bir görüntü CTF her zaman sıfır geçişleri bu yana, karşılıklı alan bilgilerin bir kısmını kaybetmiş. Bu nedenle, farklı odak dışı değerleri 3D rekonstrüksiyon, her görüntülü dahil birden fazla projeksiyon veri setleri için gereklidir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Kaynak </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> 100X Kızdırma deşarj </td><td> 100X Kızdırma deşarj </td><td></td></tr><tr><td> Tecnai Polara Field Emission Gun F30 mikroskop </td><td> FEI, Hillsboro, OR </td><td></td></tr><tr><td> Gatan 4K x 4K CCD kamera </td><td> Gatan, Pleasanton, CA </td><td></td></tr><tr><td> Dalma-donma cihaz </td><td></td><td> Ev yapımı el yerçekimi piston </td></tr><tr><td> Quantifoil R2 / 1 200 mesh holely-karbon, bakır ızgaralar </td><td> Quantifoil Micro Araçlar, Jena, Almanya </td><td></td></tr><tr><td> EM yazılımı EMAN </td><td> <a href="http://blake.bcm.edu/EMAN/">http://blake.bcm.edu/EMAN/</a> </td><td></td></tr><tr><td> EM yazılımı IHRSR </td><td> <a href="http://people.virginia.edu/~ehe2n/">http://people.virginia.edu/ ~ ehe2n /</a> </td><td> Edward H. Egelman Programlar </td></tr><tr><td> EM yazılımı Örümcek </td><td> <a href="http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html">http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html</a> </td><td></td></tr><tr><td> MRC merkezli helisel işleme yazılımı </td><td> <a href="http://www.riken.jp/biostrmech/index.html">http://www.riken.jp/biostrmech/index.html</a> </td><td> Koji Yonekura Programlar </td></tr><tr><td> CTFFIND3/CTFTILT ve Gerçek uzay sarmal arıtma yazılımı </td><td> <a href="http://emlab.rose2.brandeis.edu/software">http://emlab.rose2.brandeis.edu/software</a> </td><td></td></tr></tbody></table>

structure of hiv-1 capsid assemblies by cryo-electron microscopy and iterative helical real-space reconstruction

Görüntü işleme ile birlikte Cryo-elektron mikroskobu (cryo-EM), makromoleküler protein kompleksleri ve meclislerinin yapısı tayini için giderek daha güçlü bir araç. Aslında, tek parçacık elektron mikroskobu (2D) iki boyutlu elektron kristalografisi 2 nispeten rutin metodolojileri ve çok sayıda yapılar haline gelmiştir 1 ve bu yöntemler kullanılarak çözüldü. Aynı zamanda, görüntü işleme ve helis nesneleri üç boyutlu (3B) rekonstrüksiyonu, özellikle sarmal sarmal simetri ile birlikte tek parçacık analiz araçları kullanır gerçek-uzay rekonstrüksiyon (IHRSR) yöntemiyle 3, iteratif hızla gelişmiştir. Sarmal bir varlık 3D yoğunluk haritası, tek bir projeksiyon elde edilebilir, çünkü pek çok biyolojik varlıklar, ipliksi ya da sarmal formları da dahil olmak üzere aktin filamentler 4, mikrotüplerin 5, amiloid lifleri 6, tütün mozaik virüsü 7, ve bakteri kamçısı 8, ve fonksiyon IHRSR yöntemi ile sarmal olmayan bir nesnenin 3D yeniden inşası için gerekli olan çok sayıda resim, esnek ve düzensiz sarmal meclislerinin yapısal analizi ile karşılaştırıldığında görüntü, şimdi ulaşılabilir. Bu video makalede, cryo-EM cryo-EM numune hazırlama, düşük doz veri toplama protokoller de dahil olmak üzere bir sarmal protein montaj 3D yoğunluk haritası (HIV-1 kapsid 9 bizim örneğimizde), indeksleme elde etmek için detaylı protokolleri sarmal kırınım desenleri ve IHRSR kullanarak görüntü işleme ve 3 boyutlu rekonstrüksiyon. Diğer tekniklerle karşılaştırıldığında, cryo-EM yakın doğal koşullar altında en iyi örnek koruma sunar. Örnekleri vitreus buz ince bir tabaka halinde hızlı dondurma, gömülü ve radyasyon hasarı en aza indirmek için düşük doz koşulları altında, sıvı azot sıcaklığında elektron mikroskopları imaged. Örnek görüntüler, düşük sinyal ve düşük kontrast kaydedilen mikrograflar pahasına yakın yerli koşullar altında elde edilir. Neyse ki, helisel yeniden yapılanma sürecini büyük ölçüde sarmal kırınım endeksleme dışında, otomatik olmuştur. Burada bir yaklaşım anasayfası sarmal yapısını tanımlamak ve sayısallaştırılmış mikrograflar, 3D helisel yeniden inşası için önemli bir adım sarmal simetriler (helisel parametreleri) belirlemek. Kısaca, biz IHRSR yöntemi uygulayarak ilk 3D yoğunluk haritası edinin. Bu ilk harita sonra iteratif böylece özgürlük derece kontrol, her segment hizasını parametreleri için kısıtlamalar getirerek rafine edilir. Elektron mikroskobu (genlik ve faz düzeltme) kontrast transfer fonksiyonu (CTF) düzelterek ve montaj sarmal simetri optimize ederek daha da iyileştirilmesi sağlanır.

Watch this Scientific Journal Video about Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction at JoVE.com

Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

Bu makale kriyo-elektron mikroskobu ile helisel monte moleküllerin üç boyutlu (3D) yapısı elde etmek için bir yöntem açıklanır. Bu protokol, HIV-1 kapsid meclisleri iteratif sarmal gerçek uzay rekonstrüksiyon yöntemi ile bir yoğunluk haritası ulaşmak için ayrıntılı 3 boyutlu rekonstrüksiyon prosedürü göstermek için kullanın.

Cryo-Elektron Mikroskopi tarafından HIV-1 kapsid Meclisleri Yapısı ve iteratif Helisel Gerçek uzay İmar

Cryo-electron microscopy (cryo-EM), combined with image processing, is an increasingly powerful tool for structure determination of macromolecular protein ...

structure-hiv-1-capsid-assemblies-cryo-electron-microscopy-iterative

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.3K Görüntüleme.  University of Pittsburgh School of Medicine. Bu makale kriyo-elektron mikroskobu ile helisel monte moleküllerin üç boyutlu (3D) yapısı elde etmek için bir yöntem açıklanır. Bu protokol, HIV-1 kapsid meclisleri iteratif sarmal gerçek uzay rekonstrüksiyon yöntemi ile bir yoğunluk haritası ulaşmak için ayrıntılı 3 boyutlu rekonstrüksiyon prosedürü göstermek için kullanın.

Video: Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

Assessment of Immunologically Relevant Dynamic Tertiary Structural Features of the HIV-1 V3 Loop Crown R2 Sequence by ab initio Folding

The antigenic diversity of HIV-1 has long been an obstacle to vaccine design, and this variability is especially pronounced in the V3 loop of the virus' surface envelope glycoprotein. We previously proposed that the crown of the V3 loop, although dynamic and sequence variable, is constrained throughout the population of HIV-1 viruses to an immunologically relevant &beta;-hairpin tertiary structure. Importantly, there are thousands of different V3 loop crown sequences in circulating HIV-1 viruses, making 3D structural characterization of trends across the diversity of viruses difficult or impossible by crystallography or NMR. Our previous successful studies with folding of the V3 crown1, 2 used the ab initio algorithm 3 accessible in the ICM-Pro molecular modeling software package (Molsoft LLC, La Jolla, CA) and suggested that the crown of the V3 loop, specifically from positions 10 to 22, benefits sufficiently from the flexibility and length of its flanking stems to behave to a large degree as if it were an unconstrained peptide freely folding in solution. As such, rapid ab initio folding of just this portion of the V3 loop of any individual strain of the 60,000+ circulating HIV-1 strains can be informative. Here, we folded the V3 loop of the R2 strain to gain insight into the structural basis of its unique properties. R2 bears a rare V3 loop sequence thought to be responsible for the exquisite sensitivity of this strain to neutralization by patient sera and monoclonal antibodies4, 5. The strain mediates CD4-independent infection and appears to elicit broadly neutralizing antibodies. We demonstrate how evaluation of the results of the folding can be informative for associating observed structures in the folding with the immunological activities observed for R2.

Assessment of Immunologically Relevant Dynamic Tertiary Structural Features of the HIV-1 V3 Loop Crown R2 Sequence by ab initio Folding

The crown region of different V3 loop sequences of the surface envelope glycoprotein (gp120) of HIV-1 can be structurally characterized in many cases by in silico folding of positions 10 to 22 of the loop using a state-of-the-art ab initio folding algorithm. Here we demonstrate the folding and evaluation of this region of the V3 loop from the R2 strain of HIV-1, a uniquely neutralization sensitive strain with puzzling functional properties.

HIV-1 V3 döngü Taç R2 Sıra immünolojik İlgili Dinamik Tersiyer Yapısal Özellikler Değerlendirilmesi Ab initio Katlanır

The antigenic diversity of HIV-1 has long been an obstacle to vaccine design, and this variability is especially pronounced in the V3 loop of the virus' ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

HIV-1 tropizm genotipik Çıkarım kullanarak Nüfus tabanlı Sıralama V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) such investigations can take several days1,2 and are therefore not suited for a rapid diagnosis of plant virus diseases. Microwave fixation can be used to drastically reduce sample preparation time for TEM investigations with similar ultrastructural results as observed after conventionally sample preparation3-5. Many different custom made microwave devices are currently available which can be used for the successful fixation and embedding of biological samples for TEM investigations5-8. In this study we demonstrate on Tobacco Mosaic Virus (TMV) infected Nicotiana tabacum plants that it is possible to diagnose ultrastructural alterations in leaves in about half a day by using microwave assisted sample preparation for TEM. We have chosen to perform this study with a commercially available microwave device as it performs sample preparation almost fully automatically5 in contrast to the other available devices where many steps still have to be performed manually6-8 and are therefore more time and labor consuming. As sample preparation is performed fully automatically negative staining of viral particles in the sap of the remaining TMV-infected leaves and the following examination of ultrastructure and size can be performed during fixation and embedding.

This study describes a method that allows the rapid and clear diagnosis of plant virus diseases in about half a day by using a combination of microwave assisted plant sample preparation for transmission electron microscopy and negative staining methods.

Mikrodalga Transmisyon Elektron Mikroskobu ile Bitki Virüs Hastalıkları Hızlı Tanı Destekli

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by the majority of HIV strains in order to infect the human immune cells (Fig. 1). Other HIV isolates use a different coreceptor, the CXCR4. Which receptor is used, is determined in the virus by the Env protein (Fig. 2). Depending on the coreceptor used, the viruses are classified as R5 or X4, respectively. MVC binds to the CCR5 receptor inhibiting the entry of R5 viruses into the target cell. During the course of disease, X4 viruses may emerge and outgrow the R5 viruses. Determination of coreceptor usage (also called tropism) is therefore mandatory prior to administration of MVC, as demanded by EMA and FDA. 
The studies for MVC efficiency MOTIVATE, MERIT and 1029 have been performed with the Trofile assay from Monogram, San Francisco, U.S.A. This is a high quality assay based on sophisticated recombinant tests. The acceptance for this test for daily routine is rather low outside of the U.S.A., since the European physicians rather tend to work with decentralized expert laboratories, which also provide concomitant resistance testing. These laboratories have undergone several quality assurance evaluations, the last one being presented in 20111.
For several years now, we have performed tropism determinations based on sequence analysis from the HIV env-V3 gene region (V3)2. This region carries enough information to perform a reliable prediction. 
The genotypic determination of coreceptor usage presents advantages such as: shorter turnover time (equivalent to resistance testing), lower costs, possibility to adapt the results to the patients' needs and possibility of analysing clinical samples with very low or even undetectable viral load (VL), particularly since the number of samples analysed with VL&lt;1000 copies/&mu;l roughly increased in the last years (Fig. 3).
The main steps for tropism testing (Fig. 4) demonstrated in this video: 
1. Collection of a blood sample 
 2. Isolation of the HIV RNA from the plasma and/or HIV proviral DNA from blood mononuclear cells 
 3. Amplification of the env region 
 4. Amplification of the V3 region 
 5. Sequence reaction of the V3 amplicon 
 6. Purification of the sequencing samples 
 7. Sequencing the purified samples 
 8. Sequence editing 
 9. Sequencing data interpretation and tropism prediction

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

The prediction of the coreceptor usage of HIV-1 is required for the administration of a new class of antiretroviral drugs, i.e. coreceptor antagonists. It can be performed by sequence analysis of the env gene and subsequent interpretation through an internet based interpretation system (geno2pheno[coreceptor]).

Bir Genotipik Yöntemi&#39;ne Dizi Analizi ile HIV-1 coreceptor Kullanımı (tropizm) Tahmin

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

HIV-1 Çekirdek in vitro Uncoating

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

HIV-1 Enfekte CD4 Doğuştan Algılama Değerlendirilmesi<sup&gt; +</sup&gt; Bir kullanılması plazmositoid dendritik hücreler tarafından T Hücreleri<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-kültür sistemi.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

Bir Hücre temelli bir ELISA testi kullanarak, HIV-1 zarf trimerik Glikoproteinler konformasyonel Değerlendirilmesi

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

HIV-1 pozitif Bireylerin Plazma eksozomlann izolasyonu

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an essential step for virus particle formation, since a defect in Gag membrane binding results in severe impairment of viral particle production. To gain mechanistic details of Gag-lipid membrane interactions, in vitro methods based on NMR, protein footprinting, surface plasmon resonance, liposome flotation centrifugation, or fluorescence lipid bead binding have been developed thus far. However, each of these in vitro methods has its limitations. To overcome some of these limitations and provide a complementary approach to the previously established methods, we developed an in vitro assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes take place in a &#34;cell-like&#34; environment. In this assay, Gag binding to lipid membranes is visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique. Here we describe the background and the protocols to obtain myristoylated full-length Gag proteins and GUV membranes necessary for the assay and to detect Gag-GUV binding by microscopy.

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique.

Dev ünilamellar vesikül (GUV) membranlanna bağlanan, HIV-1 Gag Görselleştirme

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

Ölçümü<em&gt; İn Vitro</em&gt; HIV-1 Preintegration Kompleksleri Entegrasyon Etkinliği

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...