Die Autoren bedanken sich bei Dr. Gongpu Zhao und Danxia Ke für technische Unterstützung danken. Wir danken Drs. Edward Egelman und Niko Grigorieff für die gemeinsame Nutzung ihrer Bildverarbeitungssoftware. Wir erkennen auch die Mitarbeiter, die Strukturbiologie Kryo-EM-Anlage und Beowulf Cluster-und Grid an der University of Pittsburgh School of Medicine zu unterstützen. Diese Arbeit wurde von GM082251 und GM085043 unterstützt.

1. Frozen-hydratisiert EM Probenvorbereitung Da HIV-1 Capsid Protein (CA) Baugruppen 9 nur in hohen Salzkonzentrationen (1M NaCl)-Puffer, der starke Hintergrundgeräusche in Kryo-EM-Bilder beteiligt sind stabil, verwenden wir eine rasche Verdünnung und Rückseite Blot-Methode, um vorübergehend verringern das Salz Konzentration bei der Vorbereitung der gefrorenen hydratisierten EM Gitter. <ol><li> Glimmentladung die Kohlenstoff-Seite des 200-mesh R2 / 1 Quantifoil Kupfergittern unter 25mA für 25 Sekunden. </li><li> Verwenden Sie einen Vernebler, die Luftfeuchtigkeit in der Klimakammer, eine hausgemachte manuelle Schwerkraft Kolben, auf 80% zu bringen. </li><li> In der FEI Vitrobot Plunger Dewar, kühlen flüssigem Ethan mit flüssigem Stickstoff. Montieren Sie den Sprung-freezing Dewar auf die manuelle Schwerkraft Kolben. </li><li> Übernehmen 2,5 ul vormontiert CA-Lösung auf den Kohlenstoff Seite des Gitters, die auf einer Pinzette montiert ist, und laden Sie die Zange auf den Kolben mit dem Kohlenstoff Seite des Gitters abgewandten Sie. </li><li> Add 3 ul salzarme Verdünnungspuffer (100 mM NaCl) auf der Rückseite des Gitters und sofort Blot der Rückseite des Gitters mit einem Stück Filterpapier. Die gesamte Rückseite des Gitters sollte in engem Kontakt mit dem Filterpapier für ca. 6 Sekunden, bevor Sie das Filterpapier. Sofort stürzen die Gitter in flüssigem Ethan nach dem Entfernen des Filterpapiers. </li><li> Entfernen Sie die Zange aus dem Kolben und schnelle Übertragung des Gitters in eine Grid-Storage-Box. </li></ol> 2. Cryo-Elektronenmikroskopie von CA röhrenförmigen Baugruppen <ol><li> Legen Sie die gefrorenen hydratisierten Gitter in eine FEI Polara G2 Elektronenmikroskop Betrieb bei 200kV und ausgestattet mit einem Gatan 4Kx4K CCD-Kamera. </li><li> Unter low-dose-Suchmodus bei einer Vergrößerung von ~ 200x und mit einer Dosis &lt;0,001 E - / A 2, Bildschirm das gesamte Netz für Gebiete mit geeigneten Eis und speichern Sie die Positionen dieser Bereiche in einer Phase-Datei. </li><li> Rufen Sie die gespeicherten Positionen und weiteren Bildschirm diesen Bereichen bei einer Vergrößerung von 3.900 x in low-dose-Suchmodus. Wählen Sie die Bereiche mit einer gleichmäßigen, dünnen Schicht aus Eis, das gut getrennt, lange Rohre über Löcher, für die Datenerfassung. Speichern Sie die Positionen dieser Bereiche in einer zweiten Stufe Datei. </li><li> Wechseln Sie zu Belichtungssteuerung bei einer Vergrößerung von 59.000 x, Einsatz einer 100 um Objektivöffnung, und passen Sie das Ziel, Stigmatisierung und Strahlintensität für eine Dosis von ~ 15 e - / Å 2 pro Belichtung. </li><li> Zurück zur low-dose-Suchmodus, um eine gespeicherte Position zu verschieben und zu identifizieren und in der Mitte eine gute Röhre mit der CCD-Kamera. Wechseln Sie in den Fokus-Modus, stellen Sie den Fokus, und legen Sie einen defocus Wert, der normalerweise zwischen 0,5 bis 2,5 um. Wechseln Sie in die Belichtungssteuerung, stellen eine Belichtungszeit von 0,3-0,5 Sekunden, für eine Dosis von 15 E - / A 2, und sammeln Sie ein Bild. Die Bilder werden auf einem Teller Kamera gesammelt, und die Filme sollten die Möglichkeit für 10 Sekunden zu begleichen, bevor eine Belichtung aufgenommen wird. </li><li> Gehen Sie zum nächsten gespeicherten Position und wiederholen Sie Schritt 5, um weitere Bilder zu sammeln. </li><li> Die Filme werden in voller Stärke D19 für 12 Minuten entwickelt und digitalisiert mit einem Nikon Super Coolscan 9000 ED Scanner bei einer Pixelgröße von 6,35 um. Das Format der Bilddateien ist TIFF. </li></ol> 3. Helical Indizierung Eine spiralförmige Objekt kann durch zwei Parameter indiziert werden: Die Bessel Ordnung n, und Schicht Zeilennummer, l. Jede Schicht Linie in der Fourier-Transformation, wie sie aus (n, l), entspricht einer Reihe von Linien auf der Oberfläche Gitter der helikalen Objekt bezeichnet durch (h, k)-Indizes, mit der Notation aus einer 2D-Gitter. Für alle (h, k), ist eine (n hk, l hk) Schicht Linie eine lineare Kombination von zwei Basisvektoren (n = 10, l 10) und (n 01, l 01), die n und l-Werte sind Die beiden wichtigsten Schicht Linien (1, 0) und (0, 1). l kann aus der Schicht line Höhe entlang der Z-Achse in der Fourier-Transformation gemessen bezogen werden. Der Wert von n kann anhand der folgenden Gleichung 10 werden πRr ≈ J n ≈ 1,1 | n | -0,9 .....................( 1) wo J n der Bessel-Funktion, die die Intensität der n-ten Schicht Linie bestimmt ist, ist r der Radius der spiralförmigen Objekt, und R ist der Radius der maximalen Amplitude der Schicht Linie. Die Schicht Zeilennummer, l, ist n durch die Auswahl Regel 11 im Zusammenhang l = tn + um ....................( 2) wo t und u sind Konstanten der Helix. Für jede gegebene Helix, kann es genau u Einheiten werden in genau (oder sehr nahe) t complete dreht. <ol><li> Box aus einer relativ geraden und langen Rohr mit einheitlichem Durchmesser mit dem EMAN ist Programm 12 helixboxer und speichern Sie das Bild in MRC-Format. </li><li> Bestimmen Sie die spiralförmige wiederholen Abstand, c, mit einer Kreuzkorrelation basiertes Programm, wie &quot;imgccf &#39;, in der MRC-Paket 13. </li><li> Berechnen Sie die Fourier-Transformation mit einem neuen Feld Länge, die ein Integral der Wiederholung Abstand, c ist. </li><li> Wählen Sie zwei Haupt-Schicht Linien, die zwei grundlegende Oberfläche Gittervektoren (1,0) zu definieren und (0,1). </li><li> Messen Sie den Radius des Rohres, r, und die Höhe und Radius der beiden wichtigsten Schicht Linien in Fourier-Transformation, l 10, R 10, L 01 ​​R 01 bzw. (Abb. 1). </li><li> Berechnen Sie n 10 und n 01 nach Gleichung (1). </li><li> Da n-Werte nur Schätzungen sind, sind ein paar Kombinationen von n 10 und n 01 in späteren Schritten getestet (siehe Schritt 4.2) auf die richtige helikale Symmetrie mit dem Programmpaket IHRSR finden. </li><li> Berechnen Sie die Schraube Symmetrie von zwei reellen Zahlen beschrieben: die Rotation zwischen den Untereinheiten (Δφ) und die axiale Anstieg (Az) der Ein-Sterne-Helix (n = 1). Angesichts l 10, l 01, n 10 und n 01-Werte, können u und t durch die Prüfung einer Reihe von m-Werte (zum Beispiel, -50 &lt;m &lt;50) nach der Auswahl der Regel erhalten werden. Schließlich sind Δφ und Az berechnet Δφ = 360 t / u und Az = c / u. </li></ol> 4. Dreidimensionale Rekonstruktion <ol><li> Particle-Segmentierung <ol><li> Öffnen Sie eine Aufnahme mit spiralförmigen Partikel, über die grafische Programm Boxer, der ein Programm in der EMAN Paket ist. </li><li> Cut die spiralförmige Partikel in überlappende Segmente. In der Zentrale der Boxer, wählen Helix-Modus und die Parameter für den Boxsport: die Größe der Box sollte größer sein als der Durchmesser der Teilchen und der Wert für &#39;Olap &quot;sollte ~ 90% of the box groß sein. </li><li> Nach der linken Maustaste auf den beiden Enden der helikalen Partikel werden Boxer automatisch eine Reihe von Partikel-Boxen entlang der Helix Länge. </li><li> Speichern boxed Segmente sowie deren Koordinaten. </li></ol></li><li> Erste 3D-Rekonstruktion mit IHRSR Programme <ol><li> Invert den Kontrast der Kryo-EM-Bilder und gelten Tiefpassfilterung 14 (optional) vor der Verarbeitung mit dem iterativen helikale realen Raum Rekonstruktionsverfahren (IHRSR). </li><li> Öffnen Sie die grafische Oberfläche von IHRSR Programm durch Eingabe von &quot;Generator&quot;. Geben Sie die grafische Oberfläche mit allen Informationen für die boxed Partikel-Stack, einschließlich der Namen und den Pfad des Stapels, Anzahl der Bilder im Stapel, die Werte für die Symmetrie-Parameter, etc. Klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Fertig stellen&quot;, um den Wiederaufbau Skript zu erstellen, b25.spi. </li><li> Verwenden Sie eine feste oder Hohlzylinder als erste Referenz-und erlaubt das Verfahren Zyklus, bis es keine Änderungen in den definierten Schraube Symmetrie, was in der Regel nach wenigen Zyklen sind. Ein Recht helikale Symmetrie sollte eine stabil konvergente Wiederaufbau. Der Wiederaufbau in den letzten Zyklus erzeugt wird, als eine erste Referenz für weitere Verfeinerung verwendet werden. IHRSR führt 3D-Rekonstruktion mit SPIDER-Programme. </li></ol></li><li> Rekonstruktion mit Nachiteration 15 Die 3D-Rekonstruktion von IHRSR erzeugt wird jetzt als erste Referenz für weitere Verfeinerung verwendet. Während der Weiterbildung ist die helikale Symmetrie bei Δφ und Az, die aus der IHRSR Verfahren bestimmt sind festgelegt. <ol><li> Bestimmen Sie die Unschärfe und Astigmatismus in der Aufnahme mit Programmen CTFFIND3 und CTFTILT 16. </li><li> Multiplizieren Partikel Segmente durch die CTF mit SPIDER-Programme 17. Der Betrieb bezeichnet FT in der SPIDER-Suite wird verwendet, um die Fourier-Transformation (FFT) des 2D-Bild zu berechnen. Danach wird die FFT von CTF-Werte multipliziert, ermittelt in den vorherigen Schritten mit der Operation bezeichnet MU innerhalb der SPIDER-Suite. Der erhaltene Wert wird dann inverse wieder ein neues Bild (CTF-korrigiert) im realen Raum mit dem SPIDER Betrieb Form umgewandelt, wieder FT. </li><li> Führen Projektion Matching durch Vergleich Projektionen des Referenz-Volumes mit dem CTF-korrigierten Bilder, mit Multi-Referenz-Ausrichtung. Die Variation in der Out-of-plane Neigungswinkel ist zu + / -10 ° begrenzt und beprobt in 1 °-Schritten. Führen Sie Einschränkungen, z. B. hohe Korrelationskoeffizienten, in-plane Winkel nahe 0 ° oder 180 ° haben und begrenzt x-Schichten, für die Ausrichtung Parameter der einzelnen Segmente. Include in der Rekonstruktion nur jene Segmente, die die Einschränkungen zu befriedigen. </li><li> Nach jedem iterative Verfeinerung Zyklus wird eine 3D-Rekonstruktion unter Verwendung Rückprojektion und durch die Summe geteilt über die CTF2. </li><li> Impose die helikale Symmetrie zu einem symmetrisierten Volumen zu generieren. Die iterative Verfeinerung ist beendet, wenn keine weitere Verbesserung der Auflösung der neuen 3D-Rekonstruktion erfolgt. </li><li> Die Bildverarbeitungs-Paket SPIDER ist für die meisten der Verfeinerung Schritte verwendet. Eine Reihe von Operationen werden von SPIDER-Skripte, die vom Benutzer erstellten Batch-Steuerung Dateien mit Sequenzen von Operationen und Parameter-Werte kontrolliert werden. Die endgültige Rekonstruktion errechnet Programme in SPIDER-Suite. </li></ol></li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Eine einzige HIV-1 CA A92E Rohr (Abb. 1a) wurde boxed out und seine Fourier-Transformation (Abb. 1b) wurde für Helix Indexierung berechnet. Für Schicht Linien (1, 0) und (0, 1), l 10 = 28, l 01 = 37, R 10 = 55, R 01 = 44. Angesichts einer Röhre Radius von 211.57Å, angenähert wir n 10 =- 12, n 01 = 11 (hier die Händigkeit wurde vorgegeben). Mit einer Wiederholung Abstand von 5195.48Å, die Schraube Symmetrie der Röhre wurde als Az bestimmt = 6.8093Å, Δφ = 328,88 °. Az und Δφ wurden 7.1321Å und 328,86 verfeinert ° mit IHRSR (Abb. 2a) und der erste Wiederaufbau ist in Abb.. 2b. Die endgültige Rekonstruktion (Abb. 3), nach iterative Verfeinerung, verbesserte sich die Dichte Karte deutlich von der ersten Modells mit IHRSR (Abb. 2b) berechnet. <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Indizierung von HIV-1 CA Schraubenfeder. (A) Eine einzelne HIV-1 CA A92E Rohr Bild. Scale-bar, 30 nm auf. (B) Die Fourier der Röhre in (A) gezeigt, zu verwandeln. Die spiralförmige Indizes (n 10 =- 12, n 01 = 11) bezeichnet werden. Die Pfeilspitze zeigt auf die Schicht Linie bei 23a-Auflösung. <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Eine erste Rekonstruktion mit IHRSR. (A) Schrauben Symmetrie Bestimmung für jeden iterativen Zyklus. Δφ und Az, ausgehend von der ursprünglichen Werte, die stabile Werte konvergieren nach 10 Nachiteration Zyklen. (B) Die ersten 3D-density map nach 10 iterative Zyklen. <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Die 3D-density map nach der iterative Verfeinerung. (AC) Die Dichte Karte CA Rohre als drei orthogonalen Schnitten dargestellt: parallel zur Rohrachse und nahe an der Oberfläche (A), die senkrecht zur Rohrachse (B), und parallel zur und durch die Rohrachse (C) . Scale-Bars, 10 nm auf. (D) Surface Rendering der 3D-density map bei 1.8s konturierte umschließenden 100% vol.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir präsentieren eine Reihe von Protokollen ein einfacher Ansatz bieten, um 3D-Strukturen von Helix Objekte zu erhalten. Mit dem beschriebenen Verfahren haben wir eine 3D-Struktur von HIV-1 Capsid Montage aus einer einzigen Röhre Bild (176 Segmente). Höhere Auflösung Strukturen können durch darunter mehr Bilddaten erreicht werden. Es gibt mehrere kritische Punkte zur optimalen Datenerfassung und-analyse: Erstens, bei der Vorbereitung eines Kryo-EM-Probe sollte die Probelösung entfernt ausgelöscht werden, so dass eine gleichmäßige, dünne Schicht aus Lösung, die etwas dicker als die Stichprobengröße ist. Es gibt verschiedene Möglichkeiten, um die Probe-Blot. Bei bakteriellen Zellen und röhrenförmigen Proben, wie zum Beispiel HIV-1 CA Montage, Löschpapier aus einseitig, vor allem aus der Rückseite, am besten geeignet ist. Zweitens muss die Händigkeit der Helix bestimmt werden, da dies nicht durch spiralförmige Indizierung oder Rekonstruktion durchgeführt werden. Eine gängige Praxis ist, Gefrierätztechnik, von Rotary Shadowing 18 bis Händigkeit bestimmen gefolgt verwenden. Händigkeit kann auch post-Rekonstruktion bestimmt werden, wenn die Auflösung der Dichte Karte ist ausreichend hoch, die 3D Atommodelle der einzelnen Komponenten sollten gut in der Dichte Karte, wenn eine korrekte Händigkeit angenommen. Andernfalls sollte die Händigkeit angenommen werden. Drittens sollte ein Wiener-Filter bei der Bildverarbeitung eingesetzt werden, sowohl für Phase und Amplitude Korrektur, um rauscharme Verstärkung zu reduzieren. Da die CTF aus einem einzigen Bild hat immer Nulldurchgänge, ist ein Teil der Informationen im reziproken Raum verloren. Daher ist es notwendig, mehrere Projektion Daten-Sets enthalten zur 3D-Rekonstruktion, die jeweils abgebildeten an verschiedenen defocus Werte.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Quelle </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Glow-Entladeeinrichtung 100X </td><td> Glow-Entladeeinrichtung 100X </td><td></td></tr><tr><td> Tecnai Polara F30 Mikroskop mit einem Field Emission Gun </td><td> FEI, Portland, OR </td><td></td></tr><tr><td> Gatan 4K x 4K-CCD-Kamera </td><td> Gatan, Pleasanton, CA </td><td></td></tr><tr><td> Plunge-Gefriereinrichtung </td><td></td><td> Hausgemachte manuelle Schwerkraft Kolben </td></tr><tr><td> Quantifoil R2 / 1 200 mesh holely-Kohlenstoff Kupfergittern </td><td> Quantifoil Micro Tools, Jena, Deutschland </td><td></td></tr><tr><td> EM Software EMAN </td><td> <a href="http://blake.bcm.edu/EMAN/">http://blake.bcm.edu/EMAN/</a> </td><td></td></tr><tr><td> EM Software IHRSR </td><td> <a href="http://people.virginia.edu/~ehe2n/">http://people.virginia.edu/ ~ ehe2n /</a> </td><td> Programme von Edward H. Egelman </td></tr><tr><td> EM Software Spinne </td><td> <a href="http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html">http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html</a> </td><td></td></tr><tr><td> MRC basierten Helix-Software </td><td> <a href="http://www.riken.jp/biostrmech/index.html">http://www.riken.jp/biostrmech/index.html</a> </td><td> Programme von Koji Yonekura </td></tr><tr><td> CTFFIND3/CTFTILT und Real-Raum spiralförmige Veredelung Software </td><td> <a href="http://emlab.rose2.brandeis.edu/software">http://emlab.rose2.brandeis.edu/software</a> </td><td></td></tr></tbody></table>

structure of hiv-1 capsid assemblies by cryo-electron microscopy and iterative helical real-space reconstruction

Cryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM), mit Bildverarbeitung kombiniert, ist eine zunehmend mächtiges Werkzeug zur Strukturaufklärung von makromolekularen Proteinkomplexen und Baugruppen. In der Tat haben einzelne Partikel Elektronenmikroskopie 1 und zweidimensionale (2D) Elektronenkristallographie 2 haben sich relativ Routine Methoden und eine Vielzahl von Strukturen gelöst mit diesen Methoden. Zur gleichen Zeit hat der Bildverarbeitung und dreidimensionale (3D) Rekonstruktion der Helix-Objekte schnell entwickelt, vor allem, die iterative helikale Realraum Wiederaufbau (IHRSR)-Methode 3, die einzelnen Partikel-Analyse-Tools verwendet in Verbindung mit helikalen Symmetrie. Viele biologische Einheiten Funktion in filamentösen oder spiralförmige Formen, einschließlich Aktinfilamente 4, Mikrotubuli 5, Amyloid-Fasern 6, Tabak-Mosaik-Virus 7 und Bakterien Geißeln 8, und weil ein 3D-Dichte Karte eine spiralförmige Einheit aus einer Projektion erreicht werden kann Bild, im Vergleich zu den vielen Bildern für die 3D-Rekonstruktion eines nichthelikalen Objekt erforderlich, mit dem IHRSR Methode, Strukturanalyse eines solchen flexiblen und ungeordneten spiralförmigen Anordnungen ist nun erreichbar. In diesem Video-Artikel bieten wir Ihnen detaillierte Protokolle für die Erlangung eines 3D-Dichte Karte eine helikale Protein Montage (HIV-1 Capsid 9 ist unser Beispiel), einschließlich der Protokolle für die Kryo-EM Probenvorbereitung, niedrige Dosis Datenerhebung durch Kryo-EM, Indexierung von Schraubenfedern Beugungsmuster und Bildverarbeitungs-und 3D-Rekonstruktion mit IHRSR. Im Vergleich zu anderen Techniken, bietet Kryo-EM optimale Probe Erhaltung unter nahezu natürlichen Bedingungen. Die Proben werden in einer dünnen Schicht aus glasigem Eis eingebettet, durch schnelles Einfrieren und abgebildet in Elektronenmikroskopen bei der Temperatur flüssigen Stickstoffs, unter niedrig dosiertem Bedingungen, um die Strahlung zu minimieren. Beispielbilder sind unter nahezu natürlichen Bedingungen zu Lasten der Low-Signal und geringem Kontrast in der aufgezeichneten Aufnahmen erhalten. Glücklicherweise hat der Prozess der helikalen Wiederaufbau weitgehend automatisiert, mit Ausnahme der Indizierung der spiralförmigen Beugungsmuster. Hier beschreiben wir einen Ansatz zur Index Helix-Struktur und bestimmen helikale Symmetrie (helikale Parameter) aus digitalisierten Aufnahmen, ein wesentlicher Schritt für die 3D-helikale Wiederaufbau. Kurz gesagt, erhalten wir einen ersten 3D-density map durch die Anwendung der IHRSR Methode. Diese erste Karte wird dann iterativ durch die Einführung von Beschränkungen für die Ausrichtung Parameter der einzelnen Segmente und damit die Kontrolle ihrer Freiheitsgrade verfeinert. Eine weitere Verbesserung ist durch die Korrektur für die contrast transfer function (CTF) des Elektronenmikroskops (Amplitude und Phase-Korrektur) und durch die Optimierung der helikale Symmetrie der Anordnung erreicht.

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Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um eine dreidimensionale (3D) Struktur der spiralförmig montiert Moleküle mittels Kryo-Elektronenmikroskopie erhalten. In diesem Protokoll, verwenden wir HIV-1 Capsid Baugruppen für die detaillierte 3D-Rekonstruktion Verfahren zum Erreichen einer Dichte Karte durch die iterative helikale Realraum Rekonstruktion Methode zu illustrieren.

Aufbau des HIV-1 Capsid Assemblies durch Kryo-Elektronenmikroskopie und Iterative Helical Real-Raum Wiederaufbau

Cryo-electron microscopy (cryo-EM), combined with image processing, is an increasingly powerful tool for structure determination of macromolecular protein ...

structure-hiv-1-capsid-assemblies-cryo-electron-microscopy-iterative

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.3K Aufrufe.  University of Pittsburgh School of Medicine. Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um eine dreidimensionale (3D) Struktur der spiralförmig montiert Moleküle mittels Kryo-Elektronenmikroskopie erhalten. In diesem Protokoll, verwenden wir HIV-1 Capsid Baugruppen für die detaillierte 3D-Rekonstruktion Verfahren zum Erreichen einer Dichte Karte durch die iterative helikale Realraum Rekonstruktion Methode zu illustrieren.

Serie: Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

Assessment of Immunologically Relevant Dynamic Tertiary Structural Features of the HIV-1 V3 Loop Crown R2 Sequence by ab initio Folding

The antigenic diversity of HIV-1 has long been an obstacle to vaccine design, and this variability is especially pronounced in the V3 loop of the virus' surface envelope glycoprotein. We previously proposed that the crown of the V3 loop, although dynamic and sequence variable, is constrained throughout the population of HIV-1 viruses to an immunologically relevant &beta;-hairpin tertiary structure. Importantly, there are thousands of different V3 loop crown sequences in circulating HIV-1 viruses, making 3D structural characterization of trends across the diversity of viruses difficult or impossible by crystallography or NMR. Our previous successful studies with folding of the V3 crown1, 2 used the ab initio algorithm 3 accessible in the ICM-Pro molecular modeling software package (Molsoft LLC, La Jolla, CA) and suggested that the crown of the V3 loop, specifically from positions 10 to 22, benefits sufficiently from the flexibility and length of its flanking stems to behave to a large degree as if it were an unconstrained peptide freely folding in solution. As such, rapid ab initio folding of just this portion of the V3 loop of any individual strain of the 60,000+ circulating HIV-1 strains can be informative. Here, we folded the V3 loop of the R2 strain to gain insight into the structural basis of its unique properties. R2 bears a rare V3 loop sequence thought to be responsible for the exquisite sensitivity of this strain to neutralization by patient sera and monoclonal antibodies4, 5. The strain mediates CD4-independent infection and appears to elicit broadly neutralizing antibodies. We demonstrate how evaluation of the results of the folding can be informative for associating observed structures in the folding with the immunological activities observed for R2.

Assessment of Immunologically Relevant Dynamic Tertiary Structural Features of the HIV-1 V3 Loop Crown R2 Sequence by ab initio Folding

The crown region of different V3 loop sequences of the surface envelope glycoprotein (gp120) of HIV-1 can be structurally characterized in many cases by in silico folding of positions 10 to 22 of the loop using a state-of-the-art ab initio folding algorithm. Here we demonstrate the folding and evaluation of this region of the V3 loop from the R2 strain of HIV-1, a uniquely neutralization sensitive strain with puzzling functional properties.

Bewertung von immunologisch relevanten dynamischen tertiären strukturellen Merkmale der HIV-1 V3-Loop Crown R2 Sequence durch Ab initio Folding

The antigenic diversity of HIV-1 has long been an obstacle to vaccine design, and this variability is especially pronounced in the V3 loop of the virus' ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

Genotypische Inference von HIV-1 Tropismus mit Populations-basierte Sequenzierung von V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) such investigations can take several days1,2 and are therefore not suited for a rapid diagnosis of plant virus diseases. Microwave fixation can be used to drastically reduce sample preparation time for TEM investigations with similar ultrastructural results as observed after conventionally sample preparation3-5. Many different custom made microwave devices are currently available which can be used for the successful fixation and embedding of biological samples for TEM investigations5-8. In this study we demonstrate on Tobacco Mosaic Virus (TMV) infected Nicotiana tabacum plants that it is possible to diagnose ultrastructural alterations in leaves in about half a day by using microwave assisted sample preparation for TEM. We have chosen to perform this study with a commercially available microwave device as it performs sample preparation almost fully automatically5 in contrast to the other available devices where many steps still have to be performed manually6-8 and are therefore more time and labor consuming. As sample preparation is performed fully automatically negative staining of viral particles in the sap of the remaining TMV-infected leaves and the following examination of ultrastructure and size can be performed during fixation and embedding.

This study describes a method that allows the rapid and clear diagnosis of plant virus diseases in about half a day by using a combination of microwave assisted plant sample preparation for transmission electron microscopy and negative staining methods.

Mikrowelle Assisted Schnelle Diagnose von Plant Virus Erkrankungen durch Transmission Electron Microscopy

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by the majority of HIV strains in order to infect the human immune cells (Fig. 1). Other HIV isolates use a different coreceptor, the CXCR4. Which receptor is used, is determined in the virus by the Env protein (Fig. 2). Depending on the coreceptor used, the viruses are classified as R5 or X4, respectively. MVC binds to the CCR5 receptor inhibiting the entry of R5 viruses into the target cell. During the course of disease, X4 viruses may emerge and outgrow the R5 viruses. Determination of coreceptor usage (also called tropism) is therefore mandatory prior to administration of MVC, as demanded by EMA and FDA. 
The studies for MVC efficiency MOTIVATE, MERIT and 1029 have been performed with the Trofile assay from Monogram, San Francisco, U.S.A. This is a high quality assay based on sophisticated recombinant tests. The acceptance for this test for daily routine is rather low outside of the U.S.A., since the European physicians rather tend to work with decentralized expert laboratories, which also provide concomitant resistance testing. These laboratories have undergone several quality assurance evaluations, the last one being presented in 20111.
For several years now, we have performed tropism determinations based on sequence analysis from the HIV env-V3 gene region (V3)2. This region carries enough information to perform a reliable prediction. 
The genotypic determination of coreceptor usage presents advantages such as: shorter turnover time (equivalent to resistance testing), lower costs, possibility to adapt the results to the patients' needs and possibility of analysing clinical samples with very low or even undetectable viral load (VL), particularly since the number of samples analysed with VL&lt;1000 copies/&mu;l roughly increased in the last years (Fig. 3).
The main steps for tropism testing (Fig. 4) demonstrated in this video: 
1. Collection of a blood sample 
 2. Isolation of the HIV RNA from the plasma and/or HIV proviral DNA from blood mononuclear cells 
 3. Amplification of the env region 
 4. Amplification of the V3 region 
 5. Sequence reaction of the V3 amplicon 
 6. Purification of the sequencing samples 
 7. Sequencing the purified samples 
 8. Sequence editing 
 9. Sequencing data interpretation and tropism prediction

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

The prediction of the coreceptor usage of HIV-1 is required for the administration of a new class of antiretroviral drugs, i.e. coreceptor antagonists. It can be performed by sequence analysis of the env gene and subsequent interpretation through an internet based interpretation system (geno2pheno[coreceptor]).

Vorhersage von HIV-1 Korezeptor Usage (Tropismus) durch Sequenzanalyse mit einem Genotypische Ansatz

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

In vitro Uncoating von HIV-1-Kerne

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

Beurteilung der Innate Sensing von HIV-1-infizierten CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zellen durch Plasmazytoide Dendritische Zellen unter Verwendung eines<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Co-Kultursystem.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

Konformationsänderungen Auswertung der HIV-1-Trimeric Hüllglycoproteine ​​mit eine Handy-basierte ELISA-Test

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

Isolierung der Exosomen aus dem Plasma von HIV-1-positiven Individuen

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an essential step for virus particle formation, since a defect in Gag membrane binding results in severe impairment of viral particle production. To gain mechanistic details of Gag-lipid membrane interactions, in vitro methods based on NMR, protein footprinting, surface plasmon resonance, liposome flotation centrifugation, or fluorescence lipid bead binding have been developed thus far. However, each of these in vitro methods has its limitations. To overcome some of these limitations and provide a complementary approach to the previously established methods, we developed an in vitro assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes take place in a &#34;cell-like&#34; environment. In this assay, Gag binding to lipid membranes is visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique. Here we describe the background and the protocols to obtain myristoylated full-length Gag proteins and GUV membranes necessary for the assay and to detect Gag-GUV binding by microscopy.

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique.

Visualisierung von HIV-1 Gag Bindung an Riesen unilamellare Vesikeln (GUV) Membranes

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

Messung von<em&gt; In Vitro</em&gt; Integration Aktivität von HIV-1 Preintegration Komplexe

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...