הפרויקט מתואר נתמכה על ידי מספר גרנט R01HD050725 מהמכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם לתייג התוכן הוא באחריות הבלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצגים את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם או המכונים הלאומיים לבריאות. אנו מודים לחברי במעבדה Godenschwege כמו גם ברברה Schreader עבור קלט שלהם כתב היד ווידאו.

1. Dissection של חוט העצב הגחון Dissection ואת צבע המילוי של GF יכול להתבצע בטמפרטורת החדר. עבור לנתיחה כל הצעדים קר (4 ° C) מלוחים יש להשתמש כדי להאט את חילוף החומרים של התא לנוירונים להמשיך בפעילותם יותר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי זבובים בוגרים (4 ימים ומעלה) עם CO 2 או לצנן אותם על הקרח עד שהם משותקים. הרדמה עם קרח ידרוש זמן רב יותר (עד 30 דקות) אבל ישמור על זבובים משותקת למשך זמן ארוך יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום אחד לטוס צלחת פטרי Sylgard מצופה. דיסקציה זה מחייב שימוש בהגדלה גבוהה (80-100x) stereomicroscope לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מספריים Vannas, להסיר את הרגליים, חוטם, וכנפיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים גס סיכות חרקים קנס (סיכות minutien) כדי לכוון את הצד הגבי לטוס למעלה בצלחת Sylgard. הצמד את הבטן הראשון ולאחר מכן להאריך את חיה מעט על ידי הנחת שתי סיכות מכל צד של הצוואר, מאחורי הראש, כך הצוואר נמתח מעט נגיש (ראה איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע את לעוף טרי מלח, תסיסנית קר. הנפוץ ביותר salines תסיסנית מספיקים לנתיחה, אולם כאן השתמשנו מלוחים המתואר גו ו אודוד, 2006 4. בועת אוויר יקיפו את לעוף. מוציאים את האוויר בעזרת מזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע חתך קצר, לרוחב לתוך סוף הגבי של הבטן. החל החתך, להפוך רדוד, ישר לחתוך לאורך קו האמצע הגבי של הבטן לכיוון החזה. ואז להמשיך לחתוך רדוד, האורך של החזה באופן מדויק ככל האפשר לאורך קו האמצע לעבר החיבור. זה קריטי כדי לבצע חתכים הרדוד שלא לפגוע VNC (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש שתי סיכות חרקים בסדר בזהירות לפתוח את בית החזה. מורחים הגוף חצאים בנפרד באמצעות סיכות המקום סיכות דרך השרירים טיסה (איור 2). החזה לא אמור להיפתח עוד כפי מתואר באיור 2, כדי למנוע קריעה של לציפורן. כדי להבטיח אוריינטציה ישר של VNC הסיכות יש להציב אותו בעמדה קדמית האחורי בכל צד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גישה VNC להזרקה לצבוע הדמיה נכונה עשויה להיות חסום על ידי האיברים הפנימיים. לכן, להשתמש במלקחיים ומספריים כדי להסיר את הבטן, המעיים, הלב, אברי הרבייה. משוך את בלוטות הרוק שוכב על שני הצדדים של VNC. שוטפים את לנתיחה בזהירות עם מלוחים טריים להסיר רקמת שומן צף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את השומן בגוף מתחת חיבור צוואר הרחם (CVC). שומן נראה לעין הטובה ביותר בהגדלה גבוהה. שימוש במלקחיים בסדר בזהירות לתפוס את הרקמה מהצד למשוך אותו החוצה. </li></ol> דיסקציה יכול להתבצע בתוך 5 עד 10 דקות. באמצעות מלוחים טריים, הקור גזור, מערכת העצבים ניזוק יישאר בחיים לפחות שעה אחת. 2. תאיים GF למלא מומלץ לבצע את צבע מילוי בהקדם האפשרי לאחר הניתוח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת Sylgard עם לטוס גזור תחת מיקרוסקופ זקופה עם במה קבועה (איור 3) ו - מטרה אוויר 10x. מרכז המדגם עם סיום האחורי של הזבוב ממוקם כלפי בעל אלקטרודה צבע המילוי. השתמש התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) במצב ולהתמקד CVC. אקסונים גדול של GFS צריך להיות בבירור על פני השטח הגבי של CVC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המדולל לוציפר צהוב מלח CH dilithium ב H2O deionized ריכוז של 1%. משוך אלקטרודה זכוכית בורוסיליקט עם נימה התנגדות של כ. 60-80 MΩ. הטיפ של אלקטרודת זכוכית צריך להיות ארוכות וחדות. מלאו את קצה האלקטרודה בתמיסת 1% צהוב לוציפר ידי הצבת אלקטרודה עם בקצה השני קצה האלקטרודה לתוך פתרון הצהוב לוציפר עבור כ. 30-60 שניות. ואז למילוי האלקטרודה עם 3M LiCl שימוש במזרק המילטון עוזב בועת אוויר בין צבע ו LiCl. חבר את האלקטרודה למלא לצבוע לשלב את הראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מצופה כסף כלוריד תיל אלקטרודה לתוך הקרקע מלוחים והמקום האלקטרודה למלא לצבוע מעל במקביל לטוס VNC באמצעות micromanipulator הידראולי 3D. אלקטרודה מילוי צבע צריך להיות מחובר מגבר המאפשר העברת זרם כדי לשחרר שלילי או חיובי צבעים טעונה מן האלקטרודה ידי העברת יתר או depolarizing הנוכחי, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף ל עדשה 40X טבילה במים ולהוריד את קצה האלקטרודה למלא צבע על אחד GFS. אקסונים GF שכב קרוב לפני השטח הגבי של CVC. השתמש תנועה קדימה (לכיוון הראש) להכניס את האלקטרודה לתוך GF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי מקור האור שלכם לאור epifluorescent ולעבור מסנן צהוב לוציפר. החלת הנוכחית hyperpolarizing אל האלקטרודה למלא לצבוע עם המגבר להזריק הצהוב לוציפר לתוך GF. הכמות של צבע המוזרק יכול להיות נשלט על ידי הכמות הדואר הנוכחי עבר, כמו גם משך הזמן הנוכחי הוא עבר. כדי למנוע את שפיכת צבע מתוך מתוך הזריקה או נזק GF, מומלץ להזריק באמצעות זרם נמוכה (כ 3-5 NA) במשך 1-5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל הנוכחי עד למסוף GF ב VNC ניתן לראות בבירור (איור 4 א). עבור מכתים טרנס סינפטיים של נוירונים postsynaptic, להמשיך להעביר הנוכחית עד לצבוע ניתן גם לראות בנוירונים postsynaptic. כבה הנוכחית להסיר את האלקטרודה למלא לצבוע. </li></ol> 3. נציג תוצאות: לצבוע נציג למלא עבור GF אחד עם לוציפר צהוב מוצג באיור 4 א. התמונה נרכשה כמו ערימה תמונה תוכנה אלמנטים Nikon באמצעות מצלמה במקום רכוב על המיקרוסקופ. בחודש הנוכחי זה מדגם עברה דרך האלקטרודה למשך כ 2 דקות. GF הוא מילא ביסודיות את הטרמינל GF גדול החזה מסומן היטב (איור 4A, אליפסה). אין נוירונים postsynaptic נראים במקרה הזה, למרות לוציפר צהוב הוא קטן מספיק כדי לעבור דרך צמתים הפער. אם הצבע לא מוזרק מספיק זמן לתוך GF אז טרנס הסינפטי ממלא של נוירונים postsynaptic לא יכול היה לראות כי האות חלש מדי כדי להתגלות. נוירונים postsynaptic של GFS (איור 4B, ראשי חץ) ניתן דמיינו בצורה מהימנה יותר אפילו באמצעות קליעים נותבים נוירונים קטנים יותר, כגון Neurobiotin. הזרקת Neurobiotin 7% פתרון M 2 אצטט אשלגן עם זרם depolarizing 2 דקות מספיקה כדי תווית נוירונים postsynaptic בתוקף. Neurobiotin ניתן דמיינו עבור מיקרוסקופיה confocal באמצעות streptavidin מצמידים את צובעת של אורכי גל שונים. מכיוון Neurobiotin אינו צבע פלואורסצנטי, שיתוף הזרקת Rhodamin-dextran או hydrazides אלקסה בפתרון זהה, יכול לשמש כדי לפקח על הזרקה מוצלחת לתוך GF (איור 4C, מן Boerner ו Godenschwege, 2010 5). <img src="/files/ftp_upload/3080/3080fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. ציור סכמטי של זבוב הנצפים רוחבית. החזה מוצג עם חתך אורכי לדמיין את המבנים הפנימיים. במהלך הניתוח, שרירי הגב טיסה האורך (DLMs, כחול) נחתכו ללא פגיעה בחוט עצב הגחוני (VNC, אדום עמוק), הנמצאת הגחון לשרירים הטיסה. בטן (ירוק) נמצא מעל VNC. <img src="/files/ftp_upload/3080/3080fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. התצוגה הגבי של זבוב גזור. שני הפינים ממוקמים מאחורי הראש כדי למקם את לעוף. סיכות מודבקת באמצעות השרירים טיסה (DLM) להחזיק בית החזה פתוח. איברים פנימיים הוצאו לחשוף את חוט העצבים הגחוני (VNC). <img src="/files/ftp_upload/3080/3080fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. ההתקנה דיי למלא. <img src="/files/ftp_upload/3080/3080fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4.) Z-השלכה של החלק האחורי של VNC להציג אחת GF מלא לוציפר צהוב. התמונה נרכשה מיד לאחר צבע מילוי עם מצלמה במקום. ב wild-type חיות הטרמינל (אליפסה) של בית החזה נראה בבירור. ב) תמונה Confocal של צבע GF להתמלא Neurobiotin ב לעוף wild-type. שני GFS (חיצים) ו נוירונים postsynaptic על GFS (ראשי חץ) מסומנים. Neurobiotin היה דמיינו עם streptavidin מצמידים את Cy3. ג) Confocal תמונה של wild-type GFS מלא Alexa555.

<ol>
	<li>Power, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thoracico-abdominal+nervous+system+of+an+adult+insect+Drosophila+melanogaster.">The thoracico-abdominal nervous system of an adult insect Drosophila melanogaster.</a> J. Comp. Neurol. 88, 347-409 (1948).</li><li>Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, T. A., Phelan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+an+escape:+development+and+function+of+the+Drosophila+giant+fibre+system.">Making an escape: development and function of the Drosophila giant fibre system.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 17, 31-41 (2006).</li><li>Boerner, J., Duch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Average+shape+standard+atlas+for+the+adult+Drosophila+ventral+nerve+cord.">Average shape standard atlas for the adult Drosophila ventral nerve cord.</a> J. Comp. Neurol. 518, 2437-2455 (2010).</li><li>Gu, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+synaptic+transmission+in+adult+Drosophila+Kenyon+cells+in+sity.">Cholinergic synaptic transmission in adult Drosophila Kenyon cells in sity.</a> J. Neurosci. 26, 265-272 (2006).</li><li>Boerner, J., Godenschwege, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+for+the+Drosophila+ventral+nerve+cord+standard+in+neuronal+circuit+reconstruction+and+in-depth+analysis+of+mutant+morphology.">Application for the Drosophila ventral nerve cord standard in neuronal circuit reconstruction and in-depth analysis of mutant morphology.</a> J. Neurogent. 24, 158-1567 (2010).</li><li>Godenschwege, T. A., Kristiansen, L. V., Uthaman, S. B., Hortsch, M., Murphey, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conderved+role+for+Drosophila+Neuroglian+and+human+L1-CAM+in+central-synapse+formation.">A conderved role for Drosophila Neuroglian and human L1-CAM in central-synapse formation.</a> Curr. Biol. 16, 12-23 (2006).</li><li>Uthaman, S. B., Godenschwege, T. A., Murphey, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+distinct+from+highwire+for+the+Drosophila+ubiquitin+conjugase+bendless+in+synaptic+growth+and+maturation.">A mechanism distinct from highwire for the Drosophila ubiquitin conjugase bendless in synaptic growth and maturation.</a> J. Neurosci. 28, 8615-8623 (2008).</li><li>Storkebaum, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dominant+mutations+in+the+tyrosyl-tRNA+synthetase+gene+recapitulate+in+Drosophila+features+of+human+Charcot-Marie-Tooth+neuropathy.">Dominant mutations in the tyrosyl-tRNA synthetase gene recapitulate in Drosophila features of human Charcot-Marie-Tooth neuropathy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 11782-11787 (2009).</li><li>Allen, M. J., Godenschwege, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+recordings+from+the+Drosophila+giant+fiber+system+(GFS).">Electrophysiological recordings from the Drosophila giant fiber system (GFS).</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2010, pdb.prot5453-pdb.prot5453 (2010).</li><li>Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+Recordings+from+the+Giant+Fiber+Pathway+of+D.+melanogaster.">Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

מערכת העצבים יכולה להיות גזור ללא חילוץ אותו מהגוף לעוף. זו שני יתרונות, הראשון, דיסקציה גורמת נזק מועט במערכת העצבים, ושנית, עצבים ביותר להישאר מחוברים אל השרירים ואיברי חישה. ביצוע הנתיחה, כפי שתואר, מכין את המדגם עבור ישר תיוג, צבע לפנים של GFS. נוח, motoneurons postsynaptic של GFS ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> Sylgard 184 אלסטומר סיליקון Kit </td><td> Dow Corning </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dissection מיקרוסקופ </td><td> AmScope </td><td> SM-2TZ </td><td></td></tr><tr><td> Vannas Superfine מספריים </td><td> האקדמית מכשירים </td><td> VS1023 </td><td></td></tr><tr><td> דומון מלקחיים Dumontstar 55 </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 11295-51 </td><td></td></tr><tr><td> אוסטרליץ סיכות חרקים </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 26002-10 </td><td> Ø 0.1mm </td></tr><tr><td> בורוסיליקט אלקטרודות זכוכית </td><td> העולם מכשירי דיוק </td><td> 1B100F-4 </td><td></td></tr><tr><td> אנכי פיפטה פולר 700c </td><td> דוד Kopf מכשירים </td><td> דגם 700C </td><td></td></tr><tr><td> לוציפר צהוב CH dilithium מלח </td><td> סיגמא </td><td> L0259 </td><td> 1% H 2 O </td></tr><tr><td> שלב מיקרוסקופ קבוע מצלמה זקופה &amp; </td><td> ניקון </td><td> FN-1 &amp; DS-U2 מצלמה </td><td></td></tr><tr><td> תוכנית פלואוריד המטרה האוויר 10X </td><td> ניקון </td><td> CFI תוכנית פלואוריד 10X NA 0.3 WD 16mm </td><td></td></tr><tr><td> פלואוריד במים 40X טבילה המטרה </td><td> ניקון </td><td> CFI פלואוריד 40X W NA 0.80 WD 2.0mm </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulator הידראולי 3D </td><td> Narishige הבינלאומי </td><td> דגם MW0-3 </td><td></td></tr><tr><td> מגבר </td><td> קבלת מכשירים, Inc </td><td> דגם 5A </td><td></td></tr></tbody></table>

whole mount preparation of the adult drosophila ventral nerve cord for giant fiber dye injection

כדי לנתח את המורפולוגיה axonal ו הדנדריטים של נוירונים, זה הכרחי כדי לקבל תיוג מדויק של מבנים עצביים. הכנת דוגמאות שכותרתו היטב עם מעט שום נזק לרקמות מאפשרת לנו לנתח מורפולוגיה תאים להשוות דגימות בודדות זה לזה, ולכן מאפשרת זיהוי של אנומליות מוטציה. בשיטה לנתיחה הפגינו את מערכת העצבים נשאר בעיקר בתוך הזבוב הבוגר. דרך חתך הגב, הבטן החזה נפתחים ואת רוב האיברים הפנימיים יוסרו. רק בצד הגבי של חוט העצב הגחוני (VNC) ואת החיבור צוואר הרחם (CVC) המכיל את האקסונים גדולה של סיבי ענק (GFS) 1 חשופים, בעוד המוח המכיל את גוף התא GF ו נשאר דנדריטים 2 בראש שלם . בהכנה זו רוב העצבים של VNC צריך להישאר מחוברים השרירים שלהם. בעקבות לנתיחה, ממלאים את תאיים של סיבים הענק (GF) עם פלורסנט לצבוע מודגם. ב CVC האקסונים GF ממוקמות על פני השטח הגבי, ולכן ניתן דמיינו בקלות תחת מיקרוסקופ עם ניגודיות ההפרש התערבות (DIC) אופטיקה. זה מאפשר הזרקה של אקסונים GF עם צבע באתר זה לתווית GF כולו כולל אקסונים ומסופי שלהם VNC. שיטה זו גורמת מכתים אמין וחזק של GFS המאפשר הנוירונים להיות צילמו מיד לאחר מילוי עם מיקרוסקופ epifluorescent. לחלופין, האות ניאון ניתן לשפר באמצעות נהלים אימונוהיסטוכימיה תקן 3 מתאים מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה confocal.

Watch this Scientific Journal Video about Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection at JoVE.com

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

<em&gt; In vivo</em&gt; דיסקציה של המבוגר<em&gt; תסיסנית</em&gt; העצב הגחוני (VNC) הוא הוכיח. שיטה זו לנתיחה מסוים גורם נזק קטן של VNC המאפשר תיוג הבאים של נוירונים סיב ענק עם צבע פלואורסצנטי עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה.

הר הכנה שלמים של המבוגר תסיסנית עצבי חוט הגחון עבור הזרקת סיבים ענק דיי

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

whole-mount-preparation-adult-drosophila-ventral-nerve-cord-for-giant

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

18.9K Views.  Florida Atlantic University.  In vivo דיסקציה של המבוגר תסיסנית העצב הגחוני (VNC) הוא הוכיח. שיטה זו לנתיחה מסוים גורם נזק קטן של VNC המאפשר תיוג הבאים של נוירונים סיב ענק עם צבע פלואורסצנטי עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה.

Video: Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

ויזואליזציה של מערכת העצבים כולה עובריים-Mount תסיסנית עוברים

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" (or "startle") response during the adult stage is mediated by the multi-component neuronal circuit called the Giant Fiber System (GFS). The comparative large size of the neurons, their distinctive morphology and simple connectivity make the GFS an attractive model system for studying neuronal circuitry. The GFS pathway is composed of two bilaterally symmetrical Giant Fiber (GF) interneurons whose axons descend from the brain along the midline into the thoracic ganglion via the cervical connective. In the mesothoracic neuromere (T2) of the ventral ganglia the GFs form electro-chemical synapses with 1) the large medial dendrite of the ipsilateral motorneuron (TTMn) which drives the tergotrochanteral muscle (TTM), the main extensor for the mesothoracic femur/leg, and 2) the contralateral peripherally synapsing interneuron (PSI) which in turn forms chemical (cholinergic) synapses with the motorneurons (DLMns) of the dorsal longitudinal muscles (DLMs), the wing depressors. The neuronal pathway(s) to the dorsovental muscles (DVMs), the wing elevators, has not yet been worked out (the DLMs and DVMs are known jointly as indirect flight muscles - they are not attached directly to the wings, but rather move the wings indirectly by distorting the nearby thoracic cuticle) (King and Wyman, 1980; Allen et al., 2006). The di-synaptic activation of the DLMs (via PSI) causes a small but important delay in the timing of the contraction of these muscles relative to the monosynaptic activation of TTM (~0.5 ms) allowing the TTMs to first extend the femur and propel the fly off the ground. The TTMs simultaneously stretch-activate the DLMs which in turn mutually stretch-activate the DVMs for the duration of the flight. The GF pathway can be activated either indirectly by applying a sensory (e.g."air-puff" or "lights-off") stimulus, or directly by a supra-threshold electrical stimulus to the brain (described here). In both cases, an action potential reaches the TTMs and DLMs solely via the GFs, PSIs, and TTM/DLM motoneurons, although the TTMns and DLMns do have other, as yet unidentified, sensory inputs. Measuring "latency response" (the time between the stimulation and muscle depolarization) and the "following to high frequency stimulation" (the number of successful responses to a certain number of high frequency stimuli) provides a way to reproducibly and quantitatively assess the functional status of the GFS components, including both central synapses (GF-TTMn, GF-PSI, PSI-DLMn) and the chemical (glutamatergic) neuromuscular junctions (TTMn-TTM and DLMn-DLM). It has been used to identify genes involved in central synapse formation and to assess CNS function.

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

The Giant Fiber System is a simple neuronal circuit of adult Drosophila melanogaster containing the largest neurons in the fly. We describe the protocol for monitoring synaptic transmission through this pathway by recording post synaptic potentials in dorsal longitudinal (DLM) and tergotrochanteral (TTM) muscles following direct stimulation of the Giant Fiber interneurons.

הקלטות אלקטרו מתוך מסלול של סיבים ענק ד melanogaster</em

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" ...

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We developed a novel nanoinjection/electrophysiology assay that allows the detection of bioactive modulatory effects of compounds on the function of a neuronal circuit that mediates the escape response in Drosophila melanogaster3,4. Our in vivo assay, which uses the Drosophila Giant Fiber System (GFS, Figure 1) allows screening of different types of compounds, such as small molecules or peptides, and requires only minimal quantities to elicit an effect. In addition, the Drosophila GFS offers a large variety of potential molecular targets on neurons or muscles. The Giant Fibers (GFs) synapse electrically (Gap Junctions) as well as chemically (cholinergic) onto a Peripheral Synapsing Interneuron (PSI) and the Tergo Trochanteral Muscle neuron (TTMn)5. The PSI to DLMn (Dorsal Longitudinal Muscle neuron) connection is dependent on D&alpha;7 nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs)6. Finally, the neuromuscular junctions (NMJ) of the TTMn and the DLMn with the jump (TTM) and flight muscles (DLM) are glutamatergic7-12. Here, we demonstrate how to inject nanoliter quantities of a compound, while obtaining electrophysiological intracellular recordings from the Giant Fiber System13 and how to monitor the effects of the compound on the function of this circuit. We show specificity of the assay with methyllycaconitine citrate (MLA), a nAChR antagonist, which disrupts the PSI to DLMn connection but not the GF to TTMn connection or the function of the NMJ at the jump or flight muscles.
Before beginning this video it is critical that you carefully watch and become familiar with the JoVE video titled "Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster " from Augustin et al7, as the video presented here is intended as an expansion to this existing technique. Here we use the electrophysiological recordings method and focus in detail only on the addition of the paired nanoinjections and monitoring technique.

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

A rapid in vivo assay to test for neuromodulatory compounds using the Giant Fiber System (GFS) of Drosophila melanogaster is described. Nanoinjections in the head of the animal along with electrophysiological recordings of the GFS can reveal bioactivity of compounds on neurons or muscles.

Nanoinjection לזווג ו Assay Electrophysiology למסך עבור bioactivity של תרכובות באמצעות תסיסנית melanogaster סיבים הענק מערכת

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

עכבר לשחזור Sciatic עצב קראש והערכה לאחר ההתחדשות של ניתוח הר שלם שריר

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Here we present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the lipophilic tracer 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)1. The comparison of axonal pathways of wild-type with those of mouse lines in which genes are mutated allows testing for a functional role of candidate proteins in the control of axonal branching which is an essential mechanism in the wiring of the nervous system. Axonal branching enables an individual neuron to connect with multiple targets, thereby providing the physical basis for the parallel processing of information. Ramifications at intermediate target regions of axonal growth may be distinguished from terminal arborization. Furthermore, different modes of axonal branch formation may be classified depending on whether branching results from the activities of the growth cone (splitting or delayed branching) or from the budding of collaterals from the axon shaft in a process called interstitial branching2 (Fig. 1).
The central projections of neurons from the DRG offer a useful experimental system to study both types of axonal branching: when their afferent axons reach the dorsal root entry zone (DREZ) of the spinal cord between embryonic days 10 to 13 (E10 - E13) they display a stereotyped pattern of T- or Y-shaped bifurcation. The two resulting daughter axons then proceed in rostral or caudal directions, respectively, at the dorsolateral margin of the cord and only after a waiting period collaterals sprout from these stem axons to penetrate the gray matter (interstitial branching) and project to relay neurons in specific laminae of the spinal cord where they further arborize (terminal branching)3. DiI tracings have revealed growth cones at the dorsal root entry zone of the spinal cord that appeared to be in the process of splitting suggesting that bifurcation is caused by splitting of the growth cone itself4 (Fig. 2), however, other options have been discussed as well5.
This video demonstrates first how to dissect the spinal cord of E12.5 mice leaving the DRG attached. Following fixation of the specimen tiny amounts of DiI are applied to DRG using glass needles pulled from capillary tubes. After an incubation step, the labeled spinal cord is mounted as an inverted open-book preparation to analyze individual axons using fluorescence microscopy.

The stereotyped projections of sensory afferents into the rodent spinal cord offer an easily accessible experimental system to study axonal branching through the tracing of single axons.

DiI-תיוג של נוירונים DRG לחקר axonal מסעף בהכנת הר שלם של חוט השדרה עובריים בעכבר

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

ניתוח של השריר Transversus Abdominis לניתוח צומת נוירומוסקולרי הר שלם

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

הר immunolabeling השלם של חוש הריח קולטן נוירונים<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אנטנה

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional afferent fibers monitor other characteristics of the muscle environment, including metabolite buildup, temperature, and nociceptive stimuli. Overall, abnormal activation of sensory neurons can lead to movement disorders or chronic pain syndromes. We describe the isolation of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and nerve for in vitro study of stretch-evoked afferent responses in the adult mouse. Sensory activity is recorded from the nerve with a suction electrode and individual afferents can be analyzed using spike sorting software. In vitro preparations allow for well controlled studies on sensory afferents without the potential confounds of anesthesia or altered muscle perfusion. Here we describe a protocol to identify and test the response of muscle spindle afferents to stretch. Importantly, this preparation also supports the study of other subtypes of muscle afferents, response properties following drug application and the incorporation of powerful genetic approaches and disease models in mice.

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons are involved in proprioceptor signaling and also report on metabolic state and injury related events. We describe an adult mouse in vitro muscle-nerve preparation for studies on stretch-activated muscle afferents.

<em&gt; במבחנה</emהכנת שרירים עצבים&gt; עכבר למבוגרים ללימוד מאפייני ירי afferents השריר

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

ההר שלם Dissection וImmunofluorescence של מבוגרי עכבר השבלול

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to network properties. We show how to prepare viable oblique slices of the spinal cord of young mice (P2 - P11). In this preparation, the motoneurons retain&#160;their axons coming out from the ventral roots of the&#160;spinal cord. Stimulation of these axons elicits back-propagating action potentials invading the motoneuron&#160;somas and exciting the motoneuron&#160;collaterals within the spinal cord. Recording of antidromic action potentials is an immediate, definitive and elegant way to characterize motoneuron identity, which surpasses&#160;other identification methods. Furthermore, stimulating the motoneuron collaterals is a simple and reliable way to excite the collateral targets of the motoneurons within the spinal cord, such as other motoneurons or Renshaw cells. In this protocol, we present antidromic recordings from the motoneuron somas as well as Renshaw cell excitation, resulting from ventral root stimulation.

We show how to prepare oblique slices of the spinal cord in young mice. This preparation allows for the stimulation of the ventral roots.

הכנת פרוסות קורד אלכסון שדרה עבור גחון רוט גירוי

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...