نشكر الدكاترة. جون هانكوك ، راي الشواية ، واندرو موريس أولغا Chumakova على دعمهم. وFlexStation 3 النظام هو جزء من مرفق التصوير Cytodynamic UTHSC. كما نشكر الدكاترة. Ardem Patapoutian وBandell مايكل من معهد سكريبس للأبحاث ومعهد جينوم لمؤسسة أبحاث نوفارتيس (GNF) لتوفير خط خلية HEK293 - hTRPA1 مستقرة. ويدعم هذا البحث في جزء من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (GM081658 لMXZ) وتكساس المركز الطبي لأمراض الجهاز الهضمي مركز (لسمو) وبعثة الاتصال / TIRR مؤسسة (سمو).

1. استعدادات في الخلية 96 - جيدا لوحات لHEK293 الخلايا trasfected عابر مع TRPA1 الإنسان [كدنا] <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزرع الخلايا HEK293 1-2 أيام في متوسطة Dulbecco من الضروري الحد الأدنى (DMEM) التي تحتوي على 4،5 ملغ / مل الجلوكوز (الحرارية العلمية ، SH3002201) ، على أن تستكمل مع الحرارة المعطل 10 ٪ مصل بقري جنيني (Invitrogen ، 16000-044) ، 50 وحدة / مل البنسلين و 50 ميكروغرام / مل الستربتوميسين (Invitrogen ، 15140-163). في يوم من ترنسفكأيشن ، ينبغي أن تصل كثافة الخلية 70-90 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معطف 96 - جيدا لوحات بواسطة pipetting 50 ميكرولتر بولي - L - الأورنيثين (سيغما P3655 ، 20 ميكروغرام / مل في الماء المقطر المعقم) إلى كل بئر ويحتضنها في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل. شطف كل مرة بشكل جيد مع التخزين المؤقت للفوسفات Dulbecco المالحة (DPBS) بدون المغنيسيوم والكالسيوم 2 + 2 + (الحرارية العلمية ، SH3002803). قد يكون غادر لوحة في الخلية هود الثقافة لبضع ساعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على كل جانب من لوحة 96 - جيدا ، وتمييع في أنبوب إيبندورف 1.5 مل 0.2 ميكروغرام [كدنا] في 25 ميكرولتر OPTI - MEM (Invitrogen ، 31985-070). رفع مستوى متناسب وفقا لعدد من الآبار لتكون transfected من [كدنا] نفسه. أيضا في تخفيف منفصلة Lipofectamine إيبندورف 1.5 - 0.4 مل أنبوب ميكرولتر 2000 (Invitrogen ، 11668-019) في 25 ميكرولتر OPTI - MEM لكل بئر أن transfected. نطاق هذا الأمر وفقا لعدد من الآبار لتكون transfected. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة لفترة وجيزة عام 2000 المخفف [كدنا] وLipofectamine والسماح لهم الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل حجم مساو من Lipofectamine المخفف 2000 إلى الأنبوب الذي يحتوي على المخفف [كدنا] ، دوامة ، والسماح للخليط الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة إلى 2 ساعة. خلال هذا الوقت ، نقل [كدنا] / 2000 Lipofectamine الخليط في 49 ميكرولتر / إضافة إلى لوحة بولي - L - الأورنيثين المغلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعرض للتريبسين الخلايا HEK293 (الخطوة 1.1) ، عد كثافة الخلايا باستخدام عدادة الكريات أو الكونتيسة خلية مكافحة الآلي (Invitrogen ، C10227) ، ونقل المبلغ المطلوب من الخلايا (عادة حول ~ 125،000-150،000 خلايا / جيد) إلى 15 مل العقيمة مخروطية القاع أنبوب الطرد المركزي. الطرد المركزي في × 1000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. Resuspend الخلايا في الخلايا 1،250،00-1،500،000 ~ / مل في مستنبت DMEM ، على أن تستكمل مع مصل الجنين بنسبة 10 ٪ للحرارة الأبقار المعطل ، ولكن بدون المضادات الحيوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء عن 98 لتعليق الخلية ميكرولتر كل بئر الذي يحتوي على [كدنا] Lipofectamine - 2000 باستخدام خليط pipetter الأقنية أو الصيدلي Microplate MicroFill (بيو تيك). دعونا نجلس في لوحة غطاء لما لا يقل عن 30 دقيقة قبل وضعه في حاضنة الثقافة ترطيب الخلية. احتضان ثاني أكسيد الكربون في 37 ° C ، 5 ٪ 2 لل20-44 ساعة. </li></ol> للتعبير عن خلايا HEK293 ستابلي TRPA1 <ol start="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع الخطوة 1.2 إلى 96 لوحات معطف جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقدم بسخاء محرض خط HEK293 - hTRPA1 الخلية الدكتور أ Patapoutian (معهد سكريبس للأبحاث) ، وحافظت على المدى المتوسط ​​نفس الخلايا HEK293 البرية من نوع (الخطوة 1.1) ولكن مع استكمال 5 ميكروغرام / مل blasticidin (Invitrogen ، A1113902) ، و 50 ميكروغرام / مل B هيغروميسين (Invitrogen ، 10687010). عندما تصل كثافة خلية حوالي 90 ٪ ، يعرض للتريبسين الخلايا ، عد كثافة الخلية ، وأجهزة الطرد المركزي المبلغ المطلوب من الخلايا في 1000 دورة في الدقيقة العاشرة لمدة 5 دقائق. Resuspend الخلايا في مناطق ذات كثافة الخلايا 1000000 ~ / مل في نفس الثقافة المتوسطة تستكمل مع الدوكسيسيكلين (فيشر ، BP26535 ، 0.25 ميكروغرام / مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء عن التعليق الخلية لبولي - L - الأورنيثين لوحات مغلفة ب 100 ميكرولتر / pipetter جيدا باستخدام الأقنية أو MicroFill (بيو تيك). دعونا نجلس في لوحة غطاء لما لا يقل عن 30 دقيقة قبل وضعه في حاضنة الثقافة ترطيب الخلية. احتضان عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2 لل16-24 ساعة. </li></ol> 2. الحلول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يستخدم محلول الملح مخزنة في هانك (HBSS) كحل خارج الخلية. أنه يحتوي على (مم) : 137 كلوريد الصوديوم و 5.4 بوكل ، 0.25 نا 2 هبو 4 ، 0.44 KH 2 PO 4 ، 1.3 CaCl 2 ، 1.0 MgSO 4 ، 1.0 MgCl 2 ، 10 السكر ، و 10 HEPES ، مع تعديل الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 باستخدام 1N هيدروكسيد الصوديوم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Fluo - 4 العازلة مقايسة يحتوي على 2 ملم في HBSS بالبروبنيسيد. جعل 250 ملم بالبروبنيسيد الأسهم (سيغما ، P8761) في هيدروكسيد الصوديوم N 0.5. لتمييع HBSS في نسبة 1:125. تعدل الحموضة إلى 7.4 باستخدام حمض الهيدروكلوريك 1 N. </li></ol> 3. تحميل زنزانة مع Fluo ، 04:00 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل 1 ملغ Fluo ، 04:00 (Invitrogen ، F14202) في DMSO 912 اللامائية ميكرولتر لجعل محلول المخزون من 1 ملم. و- Fluo 04:00 يمكن تخزين المخزون في حل -20 درجة مئوية لمدة لا تقل عن شهر واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج 10 ميكرولتر Fluo 1 ملم ، مع 10 04:00 Pluronic ميكرولتر F - 127 (Invitrogen ، P3000MP ، و 20 ٪ (W / V) في حل DMSO) ثم نقل المحتوى بالكامل إلى 5 العازلة Fluo - 4 مل مقايسة (الخطوة 2.2) تستكمل مع ألبومين المصل البقري بنسبة 0.1 ٪ (سيغما ، A9418). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا المزروعة في لوحات - 96 كذلك (الخطوة 1.7 أو 1.10) مع HBSS في 80 ميكرولتر / 2 مرات جيدا باستخدام غسالة microplate (مثل ELx405TM من بيو تيك). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة Fluo-4 AM تحميل الحل (الخطوة 3.2) في 50 ميكرولتر / pipetter جيدا باستخدام الأقنية أو MicroFill (بيو تيك) ، واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا 3 مرات مع العازلة مقايسة Fluo - 4 (الخطوة 2.2.) باستخدام غسالة microplate ELx405TM. بعد غسل الماضي ، ترك 80 ميكرولتر من المنطقة العازلة Fluo - 4 مقايسة في كل بئر. </li></ol> 4. إعداد لوحة المركبة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال الفترة من 1 ساعة تحميل الخلية ، وإعداد سلسلة من التخفيفات 3X للمنبهات (أو الخصوم) من 3X تركيزات النهائي المنشود في المنطقة العازلة Fluo - 4 مقايسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 250-300 ميكرولتر من الحلول مجمع المخفف لوحة المركب 96 - جيدا. الترتيبات اللازمة لالتخفيفات المتسلسلة من مركب والضوابط المقابلة الإيجابية والسلبية في نفس العمود لوحة المركب كلما كان ذلك ممكنا لأن FlexStation 3 يقرأ عمود واحد واحد في وقت واحد. </li></ol> 5. قراءة في لوحة FlexStation 3 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على نظام (FlexStation 3 ، الكمبيوتر ، والبرمجيات SoftMax برو 5.2) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ التجربة مع اسم ملف جديد. في تعيين ما يصل ، واختيار النمط FLEX وأدخل القيم التالية : </li></ol> البروتوكول رقم 1 ، تأثير ناهض <img src="/files/ftp_upload/3149/3149table1.jpg" alt="الجدول 1" /> البروتوكول رقم 2 ، تأثير مضاد <img src="/files/ftp_upload/3149/3149table2.jpg" alt="الجدول 2" /><ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان مربع معلومات جديدة ، لوحة لوحة المركبة والقراءة لالأدراج المناسبة في FlexStation 3 ثم انقر على &quot;قراءة&quot; الزر. سوف FlexStation 3 قراءة عمود واحد في وقت واحد وإضافة المركبات في نقاط زمنية مبرمجة دون مقاطعة القراءة. الامر يستغرق نحو 3 دقائق (5 دقائق عن البروتوكول رقم 2) على الانتهاء من قراءة عمود واحد والجهاز سوف تستمر لقراءة العمود التالي مع اضافات المجمع يقوم المبرمج من قبل المستخدم في الخطوة 5.2 حتى تتم قراءة كافة الأعمدة. </li></ol> 6. تحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن معالجة البيانات التجريبية مباشرة باستخدام SoftMax برو 5.2 البرامج أو نسخ ولصق في أي برنامج جدول بيانات ، مثل Microsoft Excel. هي التي شيدت تركيز استجابة منحنى حمض ناهض الفلوفيناميك TRPA1 (FFA) باستخدام ما يلي الروتينية تركيب المربعات الصغرى. <img src="/files/ftp_upload/3149/3149eq1.jpg" alt="المعادلة 1" /> حيث Y هو استجابة لوحظ ، Y ماكس هو استجابة طبيعية القصوى ، C هو تركيز الدواء المقابلة ، والمفوضية الأوروبية 50 هو الذي أثار تركيز استجابة نصف القصوى ، و n هو معامل H هيل واضح. تركيز تثبيط منحنى لمجمع المفترضة خصم TRPA1 هو الحصول على باستخدام تركيز ثابت من الاتحاد الاسترالي (100 ميكرون) ، وزيادة التركيز تدريجيا من قيمة 50 ألف مركب IC مجمع يحسب ألف متر مربع لأقل من قبل المناسب لما يلي المعادلة. <img src="/files/ftp_upload/3149/3149eq2.jpg" alt="المعادلة 2" /> حيث Y هو استجابة لاحظ وتطبيع Y أقصى استجابة قصوى ، [النمل] هو مركب المقابلة والتركيز ، وIC 50 هو تركيز الخصم الذي ينتج نصف القصوى تثبيط FFA - أثار ردا على ذلك ، و n H هو هيل واضح معامل. </li></ol> 7. ممثل النتائج : TRPA1 هو كا 2 قناة الموجبة + - نفاذة ، وتفعيل الأمر الذي يؤدي إلى تدفق الكالسيوم التي يمكن الكشف عنها بواسطة كا 2 + حساسة للصباغة ، Fluo - 4 (1-2). تم استخدام خط الخلية HEK293 - hTRPA1 مستقرة لدراسة العلاقات التركيز والاستجابة للمنبهات وTRPA1 الخصوم. تم تحميل الخلايا مع Fluo ، 04:00 ، وضعت في 80 ميكرولتر من مقايسة العازلة ، وقراءة باستخدام FlexStation 3. بعد تسجيل مضان الأساس لمدة 30 ثانية ، تم إضافة 40 ميكرولتر من التخفيف المتسلسل للناهض TRPA1 ، FFA ، كل في 3X التركيز النهائي المطلوب ، إلى الخلايا من خلال القنوات المتعددة pipetter إدراجها كجزء من وحدة fluidics من FlexStation 3. وتم رصد التغيرات مضان لS. 180 إضافية وأعرب عن التغيرات النسبية Fluo - 4 مضان لكل كذلك ΔF = (F -- 0 F) ، حيث F و F 0 قيم مضان في وقت وبداية الفائدة من القراءة ، على التوالي. وتظهر آثار ممثل دوام التألق للتغيرات في استجابة لسلسلة من تركيزات FFA في الشكل. 1. مذكرة لتركيزات مشاركة FFA الأربعة ، على الرغم من أن مستويات الاستجابة القصوى متشابهة ، وتفعيل حركية أسرع بوضوح في أعلى مما كانت عليه في تركيزات أقل FFA. لذلك ، لتمييز هذه الاختلافات ، فإن تركيز -- شيد العلاقة استجابة عن طريق قياس معدلات الأولية (المنحدر) من الزيادة على مضان إضافة تركيزات مختلفة من FFA (الشكل 2). تأثير half القصوىوقد تقرر تركيز إيف (EC 50) من الاتحاد الاسترالي لتكون 55.4 ميكرومتر (ن = 3). أجرينا لاختبار المفترضة TRPA1 خصم ، مجمع A ، تجربة مماثلة باستخدام بروتوكول # 2 (الخطوة 2). في هذه الحالة ، وأضيفت سلسلة من التخفيفات للخصم في 30 ثانية (40 ميكرولتر من تركيزات 3X النهائي المطلوب) ، وأضاف في وقت لاحق FFA 180 ق (60 ميكرولتر في 300 ميكرومتر لتركيز النهائي من 100 ميكرومتر). مجمع وتخفيض الجرعة بشكل تابع استجابة الخلايا لTRPA1 FFA مع تركيز المثبطة half القصوى (IC 50) من 4.3 ميكرومتر (ن = 3) (الشكل 2). <img src="/files/ftp_upload/3149/3149fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1. التركيز تعتمد على تفعيل TRPA1 الإنسان من قبل الاتحاد الاسترالي. واثار زيادة FFA - استحضر من مضان على مر الزمن (وترد ردود فقط في أول 60 ق لتوضيح أفضل للحركية السريعة للردود FFA - أثار). يرجى ملاحظة أنه في تركيزات أعلى FFA أثارت الزيادة مع مضان. الحركية أسرع بكثير مما كان عليه في تركيزات أقل ، على الرغم من أن مستويات الذروة كانت مشابهة مضان <img src="/files/ftp_upload/3149/3149fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2 تركيز -- الاستجابة لعلاقات الاتحاد الاسترالي التغير بفعل مضان والمركبة والتي يسببها تثبيط استجابة FFA في TRPA1 الإنسان أعربت ستابلي HEK293 في الخلايا. تم تحديد العلاقة استجابة FFA عن طريق قياس معدلات الأولية (المنحدر) من زيادة مضان على تطبيع إضافة تركيزات مختلفة من الاتحاد الاسترالي -- Δ ، والتركيز. يا والتركيز والاستجابة علاقة تثبيط FFA - أثار ردا الكالسيوم قبل خصم TRPA1 المفترضة ، A. مجمع

<ol>
	<li>Hu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+TRPA1+channels+by+fenamate+nonsteroidal+anti-inflammatory+drugs.">Activation of TRPA1 channels by fenamate nonsteroidal anti-inflammatory drugs.</a> Pflugers Arch. 459, 579-592 (2010).</li><li>Hu, H., Bandell, M., Petrus, M. J., Zhu, M. X., Patapoutian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+activates+damage-sensing+TRPA1+ion+channels.">Zinc activates damage-sensing TRPA1 ion channels.</a> Nat Chem Biol. 5, 183-190 (2009).</li><li>Perney, T. M., Hirning, L. D., Leeman, S. E., Miller, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+calcium+channels+mediate+neurotransmitter+release+from+peripheral+neurons.">Multiple calcium channels mediate neurotransmitter release from peripheral neurons.</a> Proc Natl Acad Sci. 83, 6656-6659 (1986).</li><li>Mason, S. A., MacLeod, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+action+potential+duration+and+calcium+regulation+in+males+and+females.">Cardiac action potential duration and calcium regulation in males and females.</a> Biochem Biophys Res Commun. 388, 565-570 (2009).</li><li>Raat, N. J., Wetzels, G. E., DeMey, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-contraction+relationship+in+rat+mesenteric+arterial+smooth+muscle.+Effects+of+exogenous+and+neurogenic+noradrenaline.">Calcium-contraction relationship in rat mesenteric arterial smooth muscle. Effects of exogenous and neurogenic noradrenaline.</a> Pflugers Arch. 436, 262-269 (1998).</li><li>Alagarsamy, S., Johnson, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+calcium+channel+involvement+in+NMDA-induced+activation+of+NOS.">Voltage-dependent calcium channel involvement in NMDA-induced activation of NOS.</a> Neuroreport. 6, 2250-2254 (1995).</li><li>Su, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPM7+regulates+cell+adhesion+by+controlling+the+calcium-dependent+protease+calpain.">TRPM7 regulates cell adhesion by controlling the calcium-dependent protease calpain.</a> J Biol Chem. 281, 11260-11270 (2006).</li><li>Dubinsky, J. M., Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+concentrations+during+"chemical+hypoxia"+and+excitotoxic+neuronal+injury.">Intracellular calcium concentrations during "chemical hypoxia" and excitotoxic neuronal injury.</a> J Neurosci. 11, 2545-2551 (1991).</li><li>George, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+channel+activation+augments+NMDA+receptor+function+and+promotes+neurite+outgrowth+in+immature+cerebrocortical+neurons.">Sodium channel activation augments NMDA receptor function and promotes neurite outgrowth in immature cerebrocortical neurons.</a> J Neurosci. 29, 3288-3301 (2009).</li><li>Price, K. L., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FlexStation+examination+of+5-HT3+receptor+function+using+Ca2++-+and+membrane+potential-sensitive+dyes:+advantages+and+potential+problems.">FlexStation examination of 5-HT3 receptor function using Ca2+ - and membrane potential-sensitive dyes: advantages and potential problems.</a> J Neurosci Methods. 149, 172-177 (2005).</li><li>Laude, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+functional+assays+of+recombinant+IP3+receptors.">Rapid functional assays of recombinant IP3 receptors.</a> Cell Calcium. 38, 45-51 (2005).</li><li>Marincsak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+analgesic+drug,+tramadol,+acts+as+an+agonist+of+the+transient+receptor+potential+vanilloid-1.">The analgesic drug, tramadol, acts as an agonist of the transient receptor potential vanilloid-1.</a> Anesth Analg. 106, 1890-1896 (2008).</li><li>Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+high+throughput+screening+assays+against+three+subtypes+of+Ca(v)3+T-type+channels+using+molecular+and+pharmacologic+approaches.+Assay+Drug+Dev+Technol.">Validation of high throughput screening assays against three subtypes of Ca(v)3 T-type channels using molecular and pharmacologic approaches. Assay Drug Dev Technol.</a> 5, 191-203 (2007).</li><li>Christensen, B. N., Kochukov, M., McNearney, T. A., Taglialatela, G., Westlund, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton-sensing+G+protein-coupled+receptor+mobilizes+calcium+in+human+synovial+cells.">Proton-sensing G protein-coupled receptor mobilizes calcium in human synovial cells.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 289, C601-C608 (2005).</li><li>Boulay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+expression+of+a+novel+mammalian+homolog+of+Drosophila+transient+receptor+potential+(Trp)+involved+in+calcium+entry+secondary+to+activation+of+receptors+coupled+by+the+Gq+class+of+G+protein.">Cloning and expression of a novel mammalian homolog of Drosophila transient receptor potential (Trp) involved in calcium entry secondary to activation of receptors coupled by the Gq class of G protein.</a> J Biol Chem. 272, 29672-29680 (1997).</li><li>Nanda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+screening+of+adrenergic+receptors+by+measuring+intracellular+calcium+using+the+FlexStation+scanning+fluorimeter.">Functional screening of adrenergic receptors by measuring intracellular calcium using the FlexStation scanning fluorimeter.</a> Biotechnol J. 4, 417-422 (2009).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

كا 2 + الخلايا تلعب أدوارا مهمة في العديد من الظروف الفسيولوجية والمرضية ، مثل الإفراج العصبي (3) ، القلب إمكانات العمل (4) ، وتقلص العضلات الخلية (5) ، الخلية نقل الإشارة (6-7) ، وموت الخلايا excitotoxic ( 8). قياس مستويات الكالسيوم داخل الخلايا + 2 يساعد على توضيح التغي?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليقات (اختياري) </th></tr><tr><td> FlexStation 3 </td><td> الأجهزة الجزيئية </td><td> FLEX3 </td><td></td></tr><tr><td> 96 - حسنا الماصة FlexStation ونصائح </td><td> الأجهزة الجزيئية </td><td> 9000-0912 </td><td></td></tr><tr><td> 96 - حسنا لوحات </td><td> غرينر بيو واحد </td><td> 655090 </td><td></td></tr><tr><td> 96 - حسنا واضحة لوحات مسطحة القاع </td><td> Costar </td><td> 3595 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12430-104 </td><td></td></tr><tr><td> OPTI - MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-070 </td><td></td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-019 </td><td></td></tr><tr><td> Fluo ، 04:00 </td><td> Invitrogen </td><td> F14202 </td><td></td></tr><tr><td> PluronicF - 127 </td><td> Invitrogen </td><td> P3000MP </td><td></td></tr><tr><td> بولي - L - الأورنيثين </td><td> سيغما </td><td> P36551 </td><td></td></tr><tr><td> بالبروبنيسيد </td><td> سيغما </td><td> P8761 </td><td></td></tr><tr><td> ألبومين المصل البقري </td><td> سيغما </td><td> A9418 </td><td></td></tr></tbody></table>

cell-based calcium assay for medium to high throughput screening of trp channel functions using flexstation 3

FlexStation الجزيئية في أجهزة &quot;3 هو قارئ الفوق microplate متعددة قادرة على قياس النمط مضان الآلي في لوحات متعددة جيدا. ومن المثالي لشاشات عالية الإنتاجية المتوسطة لفي بيئات أكاديمية. أنه يحتوي على نقل السوائل وحدة متكاملة مجهزة pipetter متعدد القنوات وجهاز يقرأ عمود واحد في وقت واحد لرصد التغيرات مضان من مجموعة متنوعة من الكواشف الفلورسنت. على سبيل المثال ، استخدمت FlexStation 3 إلى دراسة وظيفة كا 2 + المنفذة للقنوات الأيونات ومستقبلات البروتين G - يقترن ذلك عن طريق قياس التغيرات في مستويات الكالسيوم داخل الخلايا الحرة + 2. عابر مستقبلات محتملة (الحزب) قنوات هي عائلة كبيرة من القنوات غير انتقائية الموجبة التي تلعب أدوارا مهمة في العديد من الوظائف الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض. معظم القنوات الحزب والكالسيوم ونفاذية لحث على تنشيط تدفق الكالسيوم. في هذا الفيديو ، وندلل على تطبيق FlexStation 3 لدراسة الوضع الدوائي للقناة TRPA1 ، جهاز استشعار الجزيئية للمنبهات الضارة العديدة. ويتم قياس يتم تحميل خلايا HEK293 عابر أو التعبير عن الإنسان ستابلي TRPA1 القنوات ، ونمت في لوحات 96 - جيدا ، مع كا 2 + حساسة صبغة الفلورسنت ، Fluo - 4 ، والتغييرات في الوقت الحقيقي ومضان في هذه الخلايا قبل وأثناء تطبيق ناهض TRPA1 باستخدام وضع FLEX من FlexStation 3. وقد درست أيضا تأثير مضاد TRPA1 المفترضة. يتم نقل البيانات من البرنامج برو SoftMax تركيز على بناء علاقات والاستجابة TRPA1 تفعيل ومثبطات.

Watch this Scientific Journal Video about Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3 at JoVE.com

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

هذا الفيديو يوفر بروتوكول مفصلة لدراسة الوضع الدوائي من القنوات TRPA1 الإنسان باستخدام FlexStation 3. البروتوكول يشمل تفاصيل إعداد الخلية ، وتحميل وتشغيل صبغ القارئ microplate ، FlexStation 3.

الخلية المستندة إلى الفحص الكالسيوم لمتوسطة إلى فحص وظائف إنتاجية عالية باستخدام قناة الحزب FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

cell-based-calcium-assay-for-medium-to-high-throughput-screening-trp

Research

JoVE Journal

Bioengineering

21.0K Views.  The University of Texas Health Science Center at Houston. هذا الفيديو يوفر بروتوكول مفصلة لدراسة الوضع الدوائي من القنوات TRPA1 الإنسان باستخدام FlexStation 3. البروتوكول يشمل تفاصيل إعداد الخلية ، وتحميل وتشغيل صبغ القارئ microplate ، FlexStation 3.

Video: Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

[ميكروأرس] البوليمر لاكتشاف إنتاجية عالية من المواد الحيوية

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection in US hospitals1. These opportunistic infections pose a growing threat for an increasing number of compromised individuals, and carry unacceptably high mortality rates. This is in part due to the limited arsenal of antifungal drugs, but also to the emergence of resistance against the most commonly used antifungal agents. Further complicating treatment is the fact that a majority of manifestations of candidiasis are associated with the formation of biofilms, and cells within these biofilms show increased levels of resistance to most clinically-used antifungal agents2. Here we describe the development of a high-density microarray that consists of C. albicans nano-biofilms, which we have named CaBChip3. Briefly, a robotic microarrayer is used to print yeast cells of C. albicans onto a solid substrate. During printing, the yeast cells are enclosed in a three dimensional matrix using a volume as low as 50 nL and immobilized on a glass substrate with a suitable coating. After initial printing, the slides are incubated at 37 &deg;C for 24 hours to allow for biofilm development. During this period the spots grow into fully developed "nano-biofilms" that display typical structural and phenotypic characteristics associated with mature C. albicans biofilms (i.e. morphological complexity, three dimensional architecture and drug resistance)4. Overall, the CaBChip is composed of ~750 equivalent and spatially distinct biofilms; with the additional advantage that multiple chips can be printed and processed simultaneously. Cell viability is estimated by measuring the fluorescent intensity of FUN1 metabolic stain using a microarray scanner. This fungal chip is ideally suited for use in true high-throughput screening for antifungal drug discovery. Compared to current standards (i.e. the 96-well microtiter plate model of biofilm formation5), the main advantages of the fungal biofilm chip are automation, miniaturization, savings in amount and cost of reagents and analyses time, as well as the elimination of labor intensive steps. We believe that such chip will significantly speed up the antifungal drug discovery process.

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

We have developed a high-density microarray platform consisting of 3D nano-biofilms of C. albicans called CaBChip. The susceptibility profile of drugs tested on a CaBChip is comparable to the conventional 96-well plate model, suggesting that the fungal chip is ideally suited for true high-throughput screening of antifungal drugs.

المبيضات البيض بيوفيلم رقاقة (كاليفورنيا BChip) لالفرز الفائق الإنتاجية مضاد للمخدرات

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

عالية الإنتاجية مولد بروتين تعبير باستخدام منصة ميكروفلويديك

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Generation of Scalable, Metallic High-Aspect Ratio Nanocomposites in a Biological Liquid Medium

The goal of this protocol is to describe the synthesis of two novel biocomposites with high-aspect ratio structures. The biocomposites consist of copper and cystine, with either copper nanoparticles (CNPs) or copper sulfate contributing the metallic component. Synthesis is carried out in liquid under biological conditions (37 &#176;C) and the self-assembled composites form after 24 hr. Once formed, these composites are highly stable in both liquid media and in a dried form. The composites scale from the nano- to micro- range in length, and from a few microns to 25 nm in diameter. Field emission scanning electron microscopy with energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX) demonstrated that sulfur was present in the NP-derived linear structures, while it was absent from the starting CNP material, thus confirming cystine as the source of sulfur in the final nanocomposites. During synthesis of these linear nano- and micro-composites, a diverse range of lengths of structures is formed in the synthesis vessel. Sonication of the liquid mixture after synthesis was demonstrated to assist in controlling average size of the structures by diminishing the average length with increased time of sonication. Since the formed structures are highly stable, do not agglomerate, and are formed in liquid phase, centrifugation may also be used to assist in concentrating and segregating formed composites.

Here we present a protocol to synthesize novel, high-aspect ratio biocomposites under biological conditions and in liquid media. The biocomposites scale from nanometers to micrometers in diameter and length, respectively. Copper nanoparticles (CNPs) and copper sulfate combined with cystine are the key components for the synthesis.

جيل من تحجيم، لامع عالية الارتفاع Nanocomposites نسبة في البيولوجية السائل المتوسطة

The goal of this protocol is to describe the synthesis of two novel biocomposites with high-aspect ratio structures. The biocomposites consist of copper ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

باستخدام Tomoauto: بروتوكول لإنتاجية عالية الآلي البرد الإلكترون التصوير المقطعي

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as contributing to antimicrobial resistance. One possible avenue for the reduction of device-associated infections is the identification of bacteria-repellent polymer coatings for these devices, which would prevent bacterial binding at the initial attachment step. A method for the identification of such repellent polymers, based on the parallel screening of hundreds of polymers using a microarray, is described here. This high-throughput method resulted in the identification of a range of promising polymers that resisted binding of various clinically relevant bacterial species individually and also as multi-species communities. One polymer, PA13 (poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide)), demonstrated significant reduction in attachment of a number of hospital isolates when coated onto two commercially available central venous catheters. The method described could be applied to identify polymers for a wide range of applications in which modification of bacterial attachment is important.

A high-throughput microarray method for the identification of polymers which reduce bacterial surface binding on medical devices is described.

عالية الإنتاجية تحديد البكتيريا البوليمرات طارد للمستلزمات الطبية

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous microscale cryogels (microcryogels), which can be loaded with a variety of cell types to form 3D microtissues. Herein, we present the protocol to fabricate versatile 3D microtissues and their applications in regenerative therapy and drug screening. Size and shape-controllable microcryogels can be fabricated on an array chip, which can be harvested off-chip as individual cell-loaded carriers for injectable regenerative therapy or be further assembled on-chip into 3D microtissue arrays for high-throughput drug screening. Due to the high elastic nature of these microscale cryogels, the 3D microtissues exhibit great injectability for minimally invasive cell therapy by protecting cells from mechanical shear force during injection. This ensures enhanced cell survival and therapeutic effect in the mouse limb ischemia model. Meanwhile, assembly of 3D microtissue arrays in a standard 384-multi-well format facilitates the use of common laboratory facilities and equipment, enabling high-throughput drug screening on this versatile 3D cell culture platform.

This protocol describes the fabrication of elastic 3D macroporous microcryogels by integrating microfabrication with cryogelation technology. Upon loading with cells, 3D microtissues are generated, which can be readily injected in vivo to facilitate regenerative therapy or assembled into arrays for in vitro high-throughput drug screening.

ميكروتيسويس 3D للعلاج عن طريق الحقن بالتجدد وفحص المخدرات الفائق

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain selection and by developing bioprocess parameters. Shake flasks have been used for this purpose. They, however, lack the capability to control the process parameters such as pH and dissolved oxygen (DO). This limitation can be overcome with the help of an automated micro-bioreactor. These bioreactors mimic cultivation at a larger scale. One of the major advantages of this system is the integration of the Design of Experiment (DOE) in the software. This integration enables establishing a design where multiple process parameters can be varied simultaneously. The critical process parameters and optimum bioprocess conditions can be analyzed within the software. The focus of the work presented here is to introduce the user to the steps involved in process design in the software and incorporation of the DOE within the cultivation run.

Here, we present a detailed procedure to run a Design of Experiment in an automated micro-bioreactor followed by cell harvest and protein quantification using a Protein A column.

عملية التحسين باستخدام الإنتاجية العالية الإنتاجية المفاعلات الحيوية الدقيقة الآلية في زراعة الخلايا المبيض الهامستر الصينية

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. The tomato-P. syringae pv. tomato pathosystem is widely used to dissect the genetic basis of plant innate responses and disease resistance. While disease was successfully managed for many decades through the introduction of the Pto/Prf gene cluster from Solanum pimpinellifolium into cultivated tomato, race 1 strains of P. syringae have evolved to overcome resistance conferred by the Pto/Prf gene cluster and occur worldwide.
Wild tomato species are important reservoirs of natural diversity in pathogen recognition, because they evolved in diverse environments with different pathogen pressures. In typical screens for disease resistance in wild tomato, adult plants are used, which can limit the number of plants that can be screened due to their extended growth time and greater growth space requirements. We developed a method to screen 10-day-old tomato seedlings for resistance, which minimizes plant growth time and growth chamber space, allows a rapid turnover of plants, and allows large sample sizes to be tested. Seedling outcomes of survival or death can be treated as discrete phenotypes or on a resistance scale defined by amount of new growth in surviving seedlings after flooding. This method has been optimized to screen 10-day-old tomato seedlings for resistance to two P. syringae strains and can easily be adapted to other P. syringae strains.

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

The seedling flood assay facilitates rapid screening of wild tomato accessions for the resistance to the Pseudomonas syringae bacterium. This assay, used in conjunction with the seedling bacterial growth assay, can assist in further characterizing the underlying resistance to the bacterium, and can be used to screen mapping populations to determine the genetic basis of resistance.

تعريف عالي الإنتاجية للمقاومة لـ Pseudomonas syringae pv. الطماطم في الطماطم باستخدام الشتلات الفيضانات أساي

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

توليد الظروف البيئية الديناميكية باستخدام جهاز Microfluidic عالي الإنتاجية

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...