نشكر الدكتور T. Helleday والدكتور بيترمان E. للحصول على مساعدة تقنية من الألياف وكذلك أعضاء في مختبر للمناقشة مفيدة. معتمد من قبل WN الزمالة الدولية للبحوث كبار من الرابطة الدولية لبحوث السرطان واللجنة الدولة البولندية للبحث العلمي المنح (N301 165935).

وصف الأسلوب هنا تم استخدامه في المنشور التالي : شواب وآخرون ، EMBO J. ، 29 (4) :806 - 18 5. 1. DT40 خلية ثقافة المواد : مصل بقري جنيني (FBS) ، والدجاج المصل ، البنسلين / الستربتومايسين ، 2 - المركابتويثانول ، RPMI <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد خلية متوسطة الثقافة : إضافة FBS 7 ٪ و 3 ٪ مصل الدجاج ، 1X البنسلين / الستربتومايسين و 10 ميكرومتر 2 - المركابتويثانول لRPMI المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DT40 تزرع الخلايا في خلية ثقافة قوارير معقمة عند 38 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2 في حاضنة مرطب. انقسام الخلايا في كل يوم الى كثافة 5 × 10 5 خلية / مل 6. </li></ol> 2. العلامات في الجسم الحي المواد : إيدو ، CldU <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد حلول المخزون من نظائرها النوكليوتيدات : حل إيدو إلى 5 ملم وCldU إلى 2.5 ملم في المتوسط. الحرارة على حد سواء لفترة وجيزة الحلول إلى 60 درجة مئوية ، ودوامة حتى التناظرية النوكليوتيداتتذاب UES تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إيدو إضافة إلى التركيز النهائي من 25 ميكرومتر إلى تزايد أضعافا مضاعفة DT40 الخلايا وخلط تعليق الخلية جيدا. احتضان خلايا لمدة 20 دقيقة عند 38 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حضانة مع التسمية الأولى ، إضافة إلى التركيز CldU النهائي من 250 ميكرومتر وعلاج الخلايا كما هو موضح في الخطوة السابقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع الثلج الباردة برنامج تلفزيوني وresuspend منهم في تركيز 7.5 × 5 10 خلايا / مل في برنامج تلفزيوني الباردة. إبقاء الخلايا المسمى على الجليد. </li></ol> ووصف الإجراء الوسم هو مجرد اقتراح ويمكن تعديلها لمعالجة مسائل محددة. يرجى الرجوع إلى قسم المناقشة لمزيد من المعلومات حول التصميم التجريبي. 3. تحلل الخلية والحمض النووي نشر المواد : شرائح الزجاج والألياف حل تحلل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل تحلل الألياف : 50 مم وSDS EDTA 0.5 ٪ في 200 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 7.5 </li><li&gt; سبوت 2 ميكرولتر من تعليق لخلية واحدة من نهاية شريحة زجاجية. هو انخفاض كبير الهواء الجاف لمدة 5 دقائق أو حتى حجم الانخفاض ولكن لا تجف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 7 الماصة حل تحلل ميكرولتر على رأس خلية تعليق ويحرك برفق مع طرف الماصة لمزج الحلول. احتضان لمدة 2 دقيقة لتحلل الخلية والمضي قدما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الميل إلى 15 درجة الشرائح للسماح للألياف إلى الانتشار على طول الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة في حل الألياف قد وصل إلى الجزء السفلي من الشريحة ، وضعه أفقيا لتجف في الهواء. بعد التجفيف ، ينبغي رقيقة ، خط مبهمة تكون مرئية على الشريحة. عند هذه النقطة ، يجب أن تكون وضعت في بداية الألياف امتدت مع قلم رصاص وبعد تلوين الخط سوف لا تكون مرئية لفترة أطول. وسوف تساعد هذه العلامة في وقت لاحق لتحديد موقع الألياف تحت المجهر. </li></ol> 4. المناعي تلطيخ المواد : الميثانول ، وحمض الخليك ، حمض الهيدروكلوريك ، BSA 5 ٪ في برنامج تلفزيوني ، جرة تلطيخ ، ومكافحة BrdU (الماوس) الأضداد ،مكافحة BrdU (الجرذان) الضد والأغنام لمكافحة فأر Cy3 الأضداد ، الماعز مكافحة الفئران اليكسا فلور 488 الأضداد ، Vectashield المتوسطة المتصاعدة ، coverslips ، وطلاء الأظافر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الشرائح تزج في الميثانول / حامض الخليك (3:1) في جرة تلطيخ واحتضان لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل الشرائح في المقطر O 2 H ، ثم تزج في حمض الهيدروكلوريك 2.5 M لمدة 80 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل شرائح ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الشرائح من الجرة تلطيخ وجمع برنامج تلفزيوني الزائد بمنشفة ورقية. ضع الشرائح أفقيا وBSA الماصة 5 ٪ على رأس كل شريحة. تغطية الشرائح بلطف مع ساترة لنشر جيش صرب البوسنة بالتساوي على الشريحة واحتضان لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الأضداد الابتدائية في جيش صرب البوسنة 5 ٪ في التركيزات التالية : 1:25 مكافحة BrdU (الماوس) ، ومكافحة BrdU 1:400 (الجرذان). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل ساترة بلطف أسفل الشريحة الزجاجية لإزالته. لا تنطبق على استخدام القوة اذا زلة تغطية العصي إلى الشريحة. يمكن ممهى الشريحة في برنامج تلفزيوني حتى تصبح فضفاضة ساترة anد يمكن إزالتها بسهولة. جمع BSA الزائدة مع منشفة ورقية ومكان الشرائح أفقيا. الماصة 50 ميكروليتر من محلول الأجسام المضادة الأولية على كل شريحة. مرة أخرى مع تغطية ساترة لنشر حل الضد بالتساوي على الشريحة واحتضان في غرفة مرطب لمدة 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إزالة coverslips ، وتغسل الشرائح ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الأضداد الثانوية في جيش صرب البوسنة 5 ٪ في التركيزات التالية : 1:500 الأغنام مكافحة فأر Cy3 1:400 والماعز لمكافحة الجرذان اليكسا فلور 488. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق 50 ميكروليتر من محلول الأجسام المضادة الثانوية كما هو موضح للأضداد الأولية. حماية الشرائح من الضوء واحتضان لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إزالة coverslips ، وتغسل الشرائح ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة قطرة من المتوسط ​​Vectashield المتصاعدة على كل شريحة وتطبيق ساترة. اضغط بلطف coverslips وإزالة السوائل الزائدة حولها مع منشفة ورقية. coverslips الختم مع بوليس الأظافر الشفاف<html> ح والسماح لهم الجافة. تخزين الشرائح في -20 درجة مئوية. </li></ol> 5. اقتناء الصور المواد : مضان المجهر والكاميرا ضع قطرة من النفط الغمر على شريحة قريبة من العلامة قلم رصاص وبدء تحديد موقع الألياف. عادة ، هناك حزمة من الألياف الرئيسي ، ولكن هذه الألياف في شباكها جدا ولا يمكن تحليلها في وقت لاحق. الابتعاد عن حزمة الرئيسي للعثور على المناطق التي يتم فيها فصل واضح الألياف عن بعضها البعض (الشكل 2). سوف نختار الصور باستخدام قناة واحدة فقط اللون من أجل تجنب التحيز. ثم ، ونحن نأخذ ما يقرب من 10 صور في كل مرة نقطة ، وتركيز أو خط خلوي. ومع ذلك ، فإن عددا من الصور يعتمد على عدد الألياف ويمكن الاعتماد على كل صورة. تتحرك على طول الشريحة لالتقاط الصور المختلفة ، ومنطقة واحدة من شريحة قد لا توفر أطوال الألياف ممثل أو هياكل تكرارها. 6. تحليل البيانات &quot;jove_content&quot;&gt; المواد : صورة برنامج التحليل ، على سبيل المثال ImageJ ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) استيراد الصور في صورة برنامج التحليل. قياس أطوال مساحات الألياف و / أو عدد النسخ هياكل مختلفة (الشكل 3). العد فقط الألياف التي هي واضحة للعيان والتي لا تمتد فوق حافة الصورة. عادة يمكننا قياس طول الألياف حوالي 100 شخص وعدد النسخ هياكل 150-200 ، وكنا نكرر تجارب فردية على الأقل ثلاث مرات. 7. ممثل النتائج : الحمض النووي يمكن تصور تكرارها حديثا كخطوط من الأجسام المضادة المسماة نظائرها النوكليوتيدات. في تجاربنا ويمثل شوكة الجارية والمتاخمة إشارات حمراء وخضراء (الشكل 3). بروتوكول وضع العلامات المزدوجة كما يتيح لنا تحديد أربع فئات رئيسية للهياكل النسخ المتماثل : 1) يمكن البدء divid أحداث جديدة<html> إد في أصول التي كانت تطلق في حين حضنت الخلايا مع التسمية الأولى وأصولها التي أطلقت خلال الحضانة مع التسمية الثانية. السابقة تتألف من إشارات خضراء والاحمر والاخضر المجاورة والأخير من الخط الأخضر فقط. 2) إنهاء الأحداث تظهر كإشارات الاحمر والاخضر والاحمر المجاور. 3) يتخلل أصول من المواقع في الجينوم مع أصول متباعدة عن كثب. وتتألف هذه المواقع من أصول واشارات متتالية الانهاء. 4) اعتمادا على تصميم تجريبي ، المتوقفة / يمكن إما انهارت الشوك لا يمكن تعريفها بأنها إشارة حمراء واحد فقط (7) أو خط أحمر تليها المسالك الخضراء 8،9 قصيرة. استخدام الشروط المذكورة هنا ، نوع الخلايا البرية DT40 لها سرعة تفرع متوسط ​​قدره 0.4 ميكرون / دقيقة. يمكننا الكشف عن حوالي 63 ٪ الشوك الجارية والأصول 10 ٪ ، 16 ٪ الشوك المتوقفة (مساحات فقط حمراء) ، الإنهاءات 8 ٪ و 3 ٪ ألياف تتخللها. <html> لدى عودتهم 1 &quot;/&gt; الشكل 1 (أ) والجانب الأيسر من الرسوم المتحركة يصور الخطوة الأولى من الحمض النووي الداخلي العلامات : إضافة إلى الخلايا إيدو DT40 المتزايد باطراد يقود التماثلية النوكليوتيدات لإدراجها بسهولة في قيادة المركبة حديثا ومتخلفة جدائل الحمض النووي. ويمكن تصور هذا باستخدام الأجسام المضادة المحددة ، وسوف تبدو وكأنها خط أحمر عند عرضها تحت المجهر. بعد ذلك ، يتم تكرار نفس الإجراء مع CldU كما هو مبين على الجانب الأيمن من الشكل. بعد حضانة مع التماثلية والنوكليوتيدات الثانية ، ومن شأن الشوكة تكون مرئية نشط باعتباره السبيل الاحمر والاخضر المجاورة. طول الألياف متوسط ​​يتناسب مع فترة حضانة لنظائرها النوكليوتيدات. (ب) ويمتد من الحمض النووي من خلايا DT40 lysed بواسطة الجاذبية على شريحة المجهر ونظائرها أدرجت النوكليوتيدات هي تصور عن طريق استخدام أجسام مضادة محددة ، والفحص المجهري مضان. igure 2 &quot;/&gt; الشكل 2. صورة ممثل مضان يظهر ألياف من الخلايا البرية DT40 النوع المسمى لاحقا مع وCldU إيدو لمدة 20 دقيقة لكل منهما. كذلك يتم فصل معظم الألياف عن بعضها البعض وبالتالي يمكن تحليلها بسهولة. شريط أبيض تمثل 10 ميكرون. <img src="/files/ftp_upload/3255/3255fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> . الشكل 3 تقنية الألياف المزدوج الوسم يسمح احد للتمييز بين الهياكل النسخ المختلفة ؛ 1 -- شوك تكرار بنشاط ، 2 -- مواقع جديدة لتكرار الحمض النووي (اطلاق النار من أصول جديدة) ، 3 -- إنهاء شوكة (اثنان تتلاقى الشوك) ، 4 -- يتخلل الألياف (من أصول مواقع متباعدة عن كثب) و 5 -- شوك المتوقفة (إشارة حمراء فقط).

<ol>
	<li>Caldwell, R. B., Fiedler, P., Schoetz, U., Buerstedde, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+function+analysis+using+the+chicken+B-cell+line+DT40.">Gene function analysis using the chicken B-cell line DT40.</a> Methods. Mol. Biol. 408, 193-210 (2007).</li><li>Petes, T. D., Williamson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+autoradiography+of+replicating+yeast+DNA.">Fiber autoradiography of replicating yeast DNA.</a> Exp. Cell. Res. 95, 103-110 (1975).</li><li>Takeuchi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+frequency+of+initiation+sites+of+DNA+replication+in+Werner's+syndrome+cells.">Altered frequency of initiation sites of DNA replication in Werner's syndrome cells.</a> Hum. Genet. 60, 365-368 (1982).</li><li>Jackson, D. A., Pombo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicon+clusters+are+stable+units+of+chromosome+structure:+evidence+that+nuclear+organization+contributes+to+the+efficient+activation+and+propagation+of+S+phase+in+human+cells.">Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells.</a> J. Cell. Biol. 140, 1285-1295 (1998).</li><li>Schwab, R. A., Blackford, A. N., Niedzwiedz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATR+activation+and+replication+fork+restart+are+defective+in+FANCM-deficient+cells.">ATR activation and replication fork restart are defective in FANCM-deficient cells.</a> EMBO. J. 29, 806-818 (2010).</li><li>Saribasak, H., Arakawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+cell+culture+conditions.">Basic cell culture conditions.</a> Subcell. Biochem. 40, 345-346 (2006).</li><li>Conti, C., Seiler, J. A., Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammalian+DNA+replication+elongation+checkpoint:+implication+of+Chk1+and+relationship+with+origin+firing+as+determined+by+single+DNA+molecule+and+single+cell+analyses.">The mammalian DNA replication elongation checkpoint: implication of Chk1 and relationship with origin firing as determined by single DNA molecule and single cell analyses.</a> Cell. Cycle. 6, 2760-2767 (2007).</li><li>Petermann, E., Orta, M. L., Issaeva, N., Schultz, N., Helleday, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyurea-stalled+replication+forks+become+progressively+inactivated+and+require+two+different+RAD51-mediated+pathways+for+restart+and+repair.">Hydroxyurea-stalled replication forks become progressively inactivated and require two different RAD51-mediated pathways for restart and repair.</a> Mol. Cell. 37, 492-502 (2010).</li><li>Edmunds, C. E., Simpson, L. J., Sale, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCNA+ubiquitination+and+REV1+define+temporally+distinct+mechanisms+for+controlling+translesion+synthesis+in+the+avian+cell+line+DT40.">PCNA ubiquitination and REV1 define temporally distinct mechanisms for controlling translesion synthesis in the avian cell line DT40.</a> Mol. Cell. 30, 519-529 (2008).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

نحن تصف الطريقة التي تسمح للتحليل الكمي من المعلمات التي تؤثر على الحمض النووي خلال مرحلة التوليف - S في مستوى جزيء واحد. على مدى السنوات العشر الماضية ، تم وضع صيغ مختلفة للتصوير تألقي تقنية الحمض النووي الألياف لتصور حركة الشوك المتماثل الفردية داخل الخلايا الحية. المعلمة حاسما في كل هذه التقنيات هي الإجراءات المتبعة لتحقيق أفضل ما يمكن من الحمض النووي التي تمتد على الأسطح الزجاجية توفير ألياف الحمض النووي جيدا المشتتة. خطوة حاسمة لتحقيق هذا هو الوقت المناسب للحضانة وقف الخلية على الشريحة المجهر ، فضلا عن الوقت تحلل. هذه المعايير تعتمد على درجة الحرارة وتدفق الهواء في مختبر خاص ، وينبغي أن تحدد تجريبيا. عادة يتم إنجاز الجزء العملي للتجربة ألياف الحمض النووي خلال يوم واحد. ومع ذلك ، بعد اكتساب صورة والتحليل هو أكثر استهلاكا للوقت وتتطلب الممارسة. يمكن أن يكون بروتوكول وضع العلامات الإعلانيةapted للرد على المشاكل العلمية المختلفة : استخدام عامل الذي يتداخل مع تكرار خلال وضع العلامات نبض second مراقبين استطالة شوكة / المماطلة في الاستجابة للإجهاد تنسخي. وأضاف في هذا السيناريو ، التسمية الأولى لا تحتاج إلى أن تكون جرفت كما النوكليوتيدات الثانية في الزائدة. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام الأدوية التي تعوق تطبيقها في تركيبة أو بعد إضافة التسمية الأولى. وهذا يتطلب التسمية الأولى ويطبق الدواء المراد إزالتها قبل التماثلية والنوكليوتيدات الثانية. هذا الإجراء يسمح احد لتحديد أهمية العوامل المختلفة إصلاح الحمض النووي على الاستقرار شوكة تنسخي / الانتعاش في ظل ظروف الضغط تنسخي (أي شوكة المماطلة و / أو انهيار). الجدير بالذكر أنه يمكن إجراء تحليل أكثر تفصيلا للتفاصيل ال DNA برنامج النسخ المتماثل مع استخدام أساليب بديلة لجمع الحمض النووي تمشيط ومضان والتهجين في الموقع. هذا ومع ذلك ، من الناحية التقنية أكثر تحديا ويتطلب expenSIVE المعدات. القدرة على تحليل نوعيا وكميا تفاصيل تكرار الحمض النووي يوفر أداة أساسية لتحقيق عيوب في تكرار الحمض النووي في حد ذاته ، وكذلك الممرات التي تقمع عدم الاستقرار الجيني المرتبطة الشوك تكرارها. مما لا شك فيه ، فإن هذا الاختبار على مزيد من المساعدة لتسليط الضوء على آليات النسخ بوساطة إصلاح الحمض النووي التي تسمح للخلايا الطبيعية للرد / التكيف مع التغيرات البيئية وكذلك كيفية الاستفادة من هذه الخلايا السرطانية آليات لمقاومة سمية العقاقير التي تستهدف الشوك تكرارها.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم الكاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليق (اختياري) </th></tr><tr><td> مصل بقري جنيني الذهب (FBS) </td><td> PAA </td><td> A15 - 151 </td><td></td></tr><tr><td> مصل الدجاج </td><td> سيغما </td><td> C5405 </td><td></td></tr><tr><td> البنسلين / الستربتوميسين </td><td> PAA </td><td> P11 - 010 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Gibco </td><td> 21875 </td><td></td></tr><tr><td> - 5 - Iodo 2&#39; - deoxyuridine (إيدو) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> I7125 </td><td></td></tr><tr><td> - 5 - كلورو 2&#39; - ديوكسي يوريدين (CldU) </td><td> سيغما </td><td> C6891 </td><td></td></tr><tr><td> مجهر الشرائح SuperFrost </td><td> VWR </td><td> 631-0910 </td><td></td></tr><tr><td> تغطية زلات NO1 </td><td> suppplies المختبر العلمي </td><td> MIC3234 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield تصاعد المتوسطة </td><td> H - 1000 ناقل المختبر </td><td> H - 1000 </td><td></td></tr><tr><td> مكافحة BrdU الأضداد (الماوس) </td><td> العلوم البيولوجية دينار بحريني </td><td> 347580 </td><td></td></tr><tr><td> مكافحة BrdU الأضداد (الجرذان) </td><td> Abcam </td><td> ab6326 </td><td></td></tr><tr><td> الأغنام مكافحة فأر Cy3 </td><td> سيغما </td><td> C2181 </td><td></td></tr><tr><td> الماعز مكافحة الفئران اليكسا فلور 488 الأضداد </td><td> Invitrogen </td><td> A110060 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of dna replication in the vertebrate model system dt40 using the dna fiber technique

الحفاظ على الاستقرار شوكة تكرار أمر في غاية الأهمية لتقسيم الخلايا للحفاظ على سلامة والوقاية من المرض. العمليات التي ينطوي ليس فقط ضمان المؤمنين الجينوم الازدواجية في مواجهة الحمض النووي من التلف الداخلية والخارجية ولكن أيضا منع عدم الاستقرار الجيني ، وهو عامل المسبب للمرض معترف بها في مجال التنمية الورم. هنا ، نحن تصف المجهري المستندة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة مضان طريقة لتصور تكرار الحمض النووي في الخلية خط B - DT40 الطيور. هذا الخط الخلية يوفر أداة قوية لتحقيق وظيفة البروتين في الجسم الحي بواسطة الهندسة الوراثية المعكوسة في خلايا الفقاريات 1. تصوير تألقي في الحمض النووي الألياف DT40 خلايا تفتقر إلى جين معين يسمح احد لتوضيح وظيفة هذا المنتج الجيني في تكرار الحمض النووي واستقرار الجينوم. الطرق التقليدية لتحليل ديناميات شوكة تكرارها في خلايا الفقاريات تعتمد على قياس المعدل العام للتوليف الحمض النووي من السكان البالغ عددهم نبض الخلايا المسمى. هذا هو النهج الكمي ، ولا تسمح للتحليل النوعي للمعلمات التي تؤثر في تركيب الحامض النووي. في المقابل ، يمكن أن يتبع معدل حركة نشطة من الشوك مباشرة عند استخدام تقنية الحمض النووي الألياف 2-4. في هذا النهج ، هو المسمى DNA الوليدة في الجسم الحي بواسطة إدماج النيوكليوتيدات المهلجنة (الشكل 1A). بعد ذلك ، يتم تمدد الألياف الفردية على شريحة المجهر ، وأساء إلى تكرار الحمض النووي المسمى مساحات محددة مع الأجسام المضادة والتي تصور المجهري مضان (الشكل 1B). يتم تحديد بدء النسخ المتماثل وكذلك اتجاهها تفرع عن طريق استخدام اثنين من نظائرها على التوالي تعديل مختلف. وعلاوة على ذلك ، فإن النهج المزدوج الوسم يسمح التحليل الكمي من المعلمات التي تؤثر على الحمض النووي التوليف خلال المرحلة - S ، أي تكرار هياكل مثل شوك الجارية والمتوقفة ، والنسخ الأصلية الكثافة وكذلك إنهاء الشوكة. أخيرا ، يمكن أن يكون الإجراء التجريبي إنجازإد في غضون يوم ، ويتطلب معدات المختبرات العامة وفقط المجهر مضان.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique at JoVE.com

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

DT40 ، وهو نظام الفقاريات نموذج الجيني ، ويوفر أداة قوية لتحليل وظيفة البروتين. نحن هنا وصف طريقة بسيطة تسمح التحليل النوعي من المعلمات التي تؤثر على الحمض النووي التوليف خلال المرحلة - S DT40 في الخلايا على مستوى جزيء واحد.

تصور تكرار الحمض النووي في DT40 النظام النموذجي الفقارية باستخدام تقنيات الحمض النووي الألياف

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

visualization-dna-replication-vertebrate-model-system-dt40-using-dna

Research

JoVE Journal

Biology

39.6K Views.  University of Oxford. DT40 ، وهو نظام الفقاريات نموذج الجيني ، ويوفر أداة قوية لتحليل وظيفة البروتين. نحن هنا وصف طريقة بسيطة تسمح التحليل النوعي من المعلمات التي تؤثر على الحمض النووي التوليف خلال المرحلة - S DT40 في الخلايا على مستوى جزيء واحد.

Video: Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

تصور تكرار الحمض النووي جزيء واحدة مع مضان المجهري

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

الدراسات الجينية البشرية البروتينات إصلاح الحمض النووي باستخدام خميرة كنظام النموذجي

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the environment, but also determines body shape and plays a role in motility4-6. Several layers secreted by epidermal cells comprise the cuticle, including an outermost lipid layer7.
Circumferential ridges in the cuticle called annuli pattern the length of the animal and are present during all stages of development8. Alae are longitudinal ridges that are present during specific stages of development, including L1, dauer, and adult stages2,9. Mutations in genes that affect cuticular collagen organization can alter cuticular structure and animal body morphology5,6,10,11. While cuticular imaging using compound microscopy with DIC optics is possible, current methods that highlight cuticular structures include fluorescent transgene expression12, antibody staining13, and electron microscopy1. Labeled wheat germ agglutinin (WGA) has also been used to visualize cuticular glycoproteins, but is limited in resolving finer cuticular structures14. Staining of cuticular surface using fluorescent dye has been observed, but never characterized in detail15. We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. This optimized protocol for DiI staining is a simple, robust method for high resolution fluorescent visualization of annuli, alae, vulva, male tail, and hermaphrodite tail spike in C. elegans.

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. With this optimized protocol, alae and annular cuticular structures are stained by DiI and observed using compound microscopy.

تصور انواع معينة ايليجانس</emالهياكل البشرة> استخدام الصبغة الحيوية محبة للدهون ، صلاح الغيدان

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH has become a major tool for analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations of the technique have been published. In this article we describe a protocol which has been optimized for robustness, reproducibility, and ease of use. Brightly fluorescent directly labeled probes are generated by nick-translation with amino-allyldUTP followed by chemical coupling of the dye. 3D DNA FISH is performed using a freeze-thaw step for cell permeabilization and a heating step for simultaneous denaturation of probe and nuclear DNA. The protocol is applicable to a range of cell types and a variety of probes (BACs, plasmids, fosmids, or Whole Chromosome Paints) and allows for high-throughput automated imaging. With this method we routinely investigate nuclear localization of up to three chromosomal regions.

We describe a robust and versatile protocol for analyzing nuclear architecture by 3D DNA FISH using directly labeled fluorescent probes.

قوية FISH DNA 3D استخدام مجسات إعتبر مباشرة

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

التصوير في الوقت الحقيقي من واحدة المهندسة رنا النصوص في الخلايا الحية عن طريق Ratiometric ثنائي الجزيء منارات

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

التضخيم، الجيل التالي من التسلسل، والحمض النووي الجينوم رسم خرائط مواقع التكامل فيروسات الرجعية

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

التصور-المربوطة السطحية الكبيرة جزيئات الحمض النووي مع الحمض النووي البروتين الفلوري ملزم الببتيد

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

عزل الترشيح من الأحماض النووية: وبسيطة وسريعة استخراج الحمض النووي الطريقة

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA insults. Genotoxic agents can damage the DNA backbone, break it, or modify the chemical nature of individual bases. Following DNA insult, DNA damage response (DDR) pathways are activated and proteins involved in the repair are recruited. A plethora of factors are involved in sensing the type of damage and activating the appropriate repair response. Failure to correctly activate and recruit DDR factors can lead to genomic instability, which underlies many human pathologies including cancer. Studies of DDR proteins can provide insights into genotoxic drug response and cellular mechanisms of drug resistance.
There are two major ways of visualizing&#160;proteins in vivo: direct observation, by tagging the protein of interest with a fluorescent protein and following it by live imaging, or indirect immunofluorescence on fixed samples. While visualization of fluorescently tagged proteins allows precise monitoring over time, direct tagging in N- or C-terminus can interfere with the protein localization or function. Observation of proteins in their unmodified, endogenous version is preferred. When DNA repair proteins are recruited to the DNA insult, their concentration increases locally and they form groups, or &#8220;foci&#8221;, that can be visualized by indirect immunofluorescence using specific antibodies.
Although detection of protein foci does not provide a definitive proof of direct interaction, co-localization of proteins in cells indicates that they regroup to the site of damage and can inform of the sequence of events required for complex formation. Careful analysis of foci spatial overlap in cells expressing wild type or mutant versions of a protein can provide precious clues on functional domains important for DNA repair function. Last, co-localization of proteins indicates possible direct interactions that can be verified by co-immunoprecipitation in cells, or direct pulldown using purified proteins.

Following DNA damage, human cells activate essential repair pathways to restore the integrity of their genome. Here, we describe the method of indirect immunofluorescence as a means to detect DNA repair proteins, analyze their spatial and temporal recruitment, and help interrogate protein-protein interaction at the sites of DNA damage.