אנו מודים לד&quot;ר ט Helleday וד&quot;ר א Petermann לעזרה עם הטכניקה סיבים, כמו גם אנשי המעבדה לדיון מועיל. WN נתמך על ידי עמיתי מחקר בכיר הבינלאומי של האגודה הבינלאומית לחקר הסרטן ועל ידי הוועדה הפולנית הממלכתית עבור מענק המחקר המדעי (N301 165,935).

השיטה המתוארת כאן נעשה שימוש בפרסום הבא: שוואב ואח&#39;, EMBO ג&#39;, 29 (4) :806-18 5.. 1. DT40 תא תרבות חומרים: בסרום שור עוברית (FBS), עוף בסרום, פניצילין / סטרפטומיצין, 2-mercaptoethanol, RPMI <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן התרבות התא בינוני: להוסיף FBS 7%, עוף בסרום 3%, 1x פניצילין / סטרפטומיצין ו -10 מיקרומטר 2-mercaptoethanol עד בינוני RPMI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DT40 התאים גדלים צלוחיות תרבות סטרילי התא ב 38 ° C ו 5% CO 2 בתוך חממה humidified. פיצול תאים מדי יום צפיפות של 5 x 10 5 תאים / מ&quot;ל 6. </li></ol> 2. תיוג בשנת vivo חומרים: IdU, CldU <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו מלאי של פתרונות אנלוגים נוקלאוטיד: להמיס IdU עד 5 מ&quot;מ ו - 2.5 מ&quot;מ CldU בינוני. מחממים שתי פתרונות בקצרה עד 60 ° C ו מערבולת עד אנלוגי נוקלאוטידיםUES מתמוססים לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף IdU לריכוז סופי של 25 מיקרומטר עד גדל באופן אקספוננציאלי DT40 תאים לערבב את ההשעיה תא היטב. דגירה התאים למשך 20 דקות ב 38 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגרה עם התווית הראשונה, להוסיף CldU לריכוז סופי של 250 מיקרומטר ולטפל תאים כפי שמתואר בשלב הקודם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים עם קרח קר PBS ו resuspend אותם בריכוז של 7.5 x 10 5 תאים / מ&quot;ל בקור PBS. שמור את התאים שכותרתו על הקרח. </li></ol> ההליך המתואר תיוג הוא רק הצעה והוא יכול להיות שונה כדי לענות על שאלות ספציפיות. נא עיין בסעיף הדיון לקבלת מידע נוסף על עיצוב ניסיוני. 3. Cell ו-DNA תמוגה מתפשטת חומרים: שקופיות זכוכית, תמוגה פתרון סיבים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון תמוגה סיבים: 50 mM EDTA ו - SDS 0.5% ב 200 מ&quot;מ טריס-HCl, pH 7.5 </li><li&gt; 2 ספוט μl של השעיה התא בקצה אחד של שקופיות הזכוכית. אוויר יבש במשך 5 דקות או עד נפח של טיפת מופחת במידה ניכרת, אך לא יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 7 Pipet פתרון μl תמוגה על גבי ההשעיה תא ומערבבים בעדינות עם קצה פיפטה לערבב את הפתרונות. דגירה של 2 דקות תמוגה התא כדי להמשיך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטיה שקופיות ° 15 על מנת לאפשר הסיבים להתפשט לאורך השקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר פתרון סיבים הגיע לתחתית המגלשה, למקם אותו אופקית אוויר יבש. לאחר ייבוש, קו דק, אטום צריך להיות גלוי לאורך השקופית. בשלב זה, תחילת סיבים נמתח יש לסמן בעיפרון כמו אחרי מכתים הקו לא יהיה גלוי יותר. סימן זה יהיה מאוחר לעזור לאתר את סיבי מתחת למיקרוסקופ. </li></ol> 4. Immunofluorescence מכתים חומרים: מתנול, חומצה אצטית, HCl, BSA 5% ב-PBS, צנצנת מכתים, אנטי BrdU (העכבר) נוגדן,אנטי BrdU (עכברוש) נוגדנים, אנטי עכבר כבשים Cy3 נוגדן, אנטי עכברוש עז אלקסה נוגדן 488 פלואוריד, בינוני Vectashield הרכבה, coverslips, לק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגלשות לטבול מתנול / חומצה אצטית (03:01) בצנצנת מכתים ו דגירה במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות מזוקקים H 2 O, לטבול אז HCl 2.5 M עבור 80 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות שלוש פעמים PBS במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר שקופיות מתוך הצנצנת מכתים ולאסוף PBS עודף עם מגבת נייר. מניחים את השקופיות אופקית BSA pipet 5% על גבי שקופית. מכסים את השקופיות בעדינות עם coverslip להפיץ את BSA באופן שווה על פני השקופית ועל דגירה במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הנוגדנים העיקרי BSA 5% בכל הריכוזים הבאים: 1:25 אנטי BrdU (עכבר) ו 1:400 אנטי BrdU (חולדה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את coverslip מעדנות שקופיות הזכוכית כדי להסיר אותו. אין להפעיל כוח אם להחליק כיסוי במקלות לשקופית. שקופית ניתן rehydrated ב PBS עד coverslip הופך רפויד ניתן להסיר בקלות. איסוף עודפי BSA עם מגבת נייר במקום שקופיות אופקית. 50 Pipet μl של הפתרון נוגדן ראשוני על כל שקופית. מכסים שוב עם coverslip להפיץ את הפתרון נוגדנים באופן שווה על פני השקופית ועל דגירה בתא humidified למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסרת coverslips, לשטוף את השקופיות שלוש פעמים PBS במשך 5 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את נוגדנים משני BSA 5% בכל הריכוזים הבאים: 1:500 כבשים אנטי עכבר Cy3 ו 1:400 עז אנטי עכברוש אלקסה פלואוריד 488. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלת 50 μl של הפתרון נוגדנים משני כמתואר עבור נוגדנים ראשוניים. הגנו על שקופיות אור דגירה במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסרת coverslips, לשטוף את השקופיות שלוש פעמים PBS במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף ירידה של המדיום Vectashield גובר על כל שקופית ולהחיל coverslip. לחץ בעדינות על coverslips ולהסיר את הנוזלים העודפים מסביב עם מגבת נייר. חותם coverslips שקוף עם מסמר פוליס<html> שעות ולתת להם יבש. אחסן את השקופיות ב -20 ° C. </li></ol> 5. תמונה הרכישה חומרים: מצלמה פלואורסצנטי, מיקרוסקופ מניחים טיפת שמן טבילה לשקופית קרוב כדי לסמן את העיפרון ולהתחיל באיתור סיבים. בדרך כלל, יש צרור סיבים הראשי, אבל סיבים אלה הם הסתבכו מדי ולא ניתן לנתח מאוחר יותר. להתרחק צרור הראשי כדי למצוא אזורים שבהם סיבים מופרדים בבירור זה מזה (איור 2). היינו לבחור תמונות רק באמצעות ערוץ אחד צבע כדי למנוע הטיה. לאחר מכן, היינו לוקחים כ 10 תמונות של כל קו הזמן, נקודת ריכוז או התא. עם זאת, מספר התמונות תלוי איך סיבים רבים ניתן לספור על כל תמונה. תתקדמי השקופית כדי לקחת את התמונות השונות, כמו אזור אחד של שקופית לא יכול לספק אורכי סיב נציג או שכפול מבנים. 6. ניתוח נתונים &quot;Jove_content&quot;&gt; חומרים: ניתוח תמונה תוכנית, למשל ImageJ ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) ייבוא ​​תמונות לתוך תוכנית ניתוח התמונה. מדוד את אורכי של קטעי סיבים ו / או לספור את המבנים שכפול שונים (איור 3). רק לספור סיבים אשר גלויים לעין ואשר לא להאריך מעבר לקצה של התמונה. אנחנו בדרך כלל למדוד את אורך של כ 100 סיבים לספור 150-200 מבנים שכפול והיינו חוזרים ניסויים בודדים לפחות שלוש פעמים. 7. נציג תוצאות: ה-DNA משוכפל חדש ניתן דמיינו כקווים של נוגדן הנקרא אנלוגים נוקלאוטיד. בניסויים שלנו מזלג מתמשך מיוצג אותות אדום וירוק סמוך (איור 3). פרוטוקול תיוג כפול גם מאפשר לנו להגדיר ארבע כיתות העיקריים של שכפול מבנים: 1) אירועים חדשים ייזום ניתן divid<html> עורך אל המקורות כי ירו בעוד התאים הודגרו עם התווית הראשונה המקורות כי ירו במהלך הדגירה עם התווית השנייה. הראשון מורכב ירוק אדום ירוק אותות השכנות השנייה של קו ירוק בלבד. 2) אירועים סיום להתבטא אדום ירוק אדום אותות סמוכים. 3) מקורות וביניהם אתרים בגנום עם מקורות צפופים. אתרים אלה כוללים מקורות ברציפות אותות סיום. 4) בהתאם לעיצוב הניסוי, נתקע / מזלגות התמוטט יכול להיות מוגדר כאיתות רק 7 אדום או קו אדום ואחריו בדרכי ירוק קצר 8,9. שימוש בתנאים המתוארים כאן, תאים מסוג בר DT40 יש מזלג מהירות ממוצעת של 0.4 מיקרומטר / min. אנחנו יכולים לזהות כ 63% מזלגות מתמשך, מקורותיה 10%, מזלגות נתקע 16% (שטחים רק אדום), הפסקות 8% סיבים שזורים 3%. <html> יור 1 &quot;/&gt; . איור 1 (א) בצד השמאלי של הקריקטורה מתארת ​​את השלב הראשון של ההליך תיוג DNA: הוספת IdU אל DT40 התאים גדל באופן אקספוננציאלי מוביל את אנלוגי נוקלאוטיד להיות משולב בקלות לתוך המוביל מסונתז החדש ואת מפגרת גדילי דנ&quot;א. זה יכול להיות דמיינו באמצעות נוגדן ספציפי, יופיע קו אדום כאשר הוא מוצג תחת מיקרוסקופ. כתוצאה מכך, הליך אותו הוא חזר עם CldU כפי שמוצג בצד ימין של הדמות. לאחר הדגרה עם אנלוגי נוקלאוטידים השני, מזלג פעיל יהיה גלוי כמו בדרכי אדום ירוק הסמוך. אורך סיב ממוצע הוא יחסי זמן הדגירה של אנלוגים של נוקלאוטידים. (ב) דנ&quot;א DT40 תאים lysed נמתח על ידי כוח הכבידה לשקופית מיקרוסקופ ואת אנלוגים נוקלאוטיד משולבים הם דמיינו ידי שימוש בנוגדנים ספציפיים מיקרוסקופ פלואורסצנטי. igure 2 &quot;/&gt; באיור 2. תמונה הקרינה נציג מראה סיבים בר DT40 תאים סוג שכותרתו לאחר מכן במשך 20 דקות כל אחד עם IdU ו CldU. רוב הסיבים מופרדים היטב אחד מהשני ולכן יכול להיות מנותח בקלות. הבר לבן מייצג 10 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/3255/3255fig3.jpg" alt="איור 3" /> . איור 3 הטכניקה תיוג פעמיים סיבים מאפשר להבחין בין מבנים שכפול שונים; 1 - מזלגות שכפול פעיל, 2 - אתרים חדשים של שכפול הדנ&quot;א (ירי מקורות חדשים), 3 - הפסקות מזלג (שני מזלגות מתכנסים), 4 - סיבים שזורים (אתרים של מקורות צפופים) ו 5 - מזלגות נתקע (אות רק אדום).

<ol>
	<li>Caldwell, R. B., Fiedler, P., Schoetz, U., Buerstedde, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+function+analysis+using+the+chicken+B-cell+line+DT40.">Gene function analysis using the chicken B-cell line DT40.</a> Methods. Mol. Biol. 408, 193-210 (2007).</li><li>Petes, T. D., Williamson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+autoradiography+of+replicating+yeast+DNA.">Fiber autoradiography of replicating yeast DNA.</a> Exp. Cell. Res. 95, 103-110 (1975).</li><li>Takeuchi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+frequency+of+initiation+sites+of+DNA+replication+in+Werner's+syndrome+cells.">Altered frequency of initiation sites of DNA replication in Werner's syndrome cells.</a> Hum. Genet. 60, 365-368 (1982).</li><li>Jackson, D. A., Pombo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicon+clusters+are+stable+units+of+chromosome+structure:+evidence+that+nuclear+organization+contributes+to+the+efficient+activation+and+propagation+of+S+phase+in+human+cells.">Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells.</a> J. Cell. Biol. 140, 1285-1295 (1998).</li><li>Schwab, R. A., Blackford, A. N., Niedzwiedz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATR+activation+and+replication+fork+restart+are+defective+in+FANCM-deficient+cells.">ATR activation and replication fork restart are defective in FANCM-deficient cells.</a> EMBO. J. 29, 806-818 (2010).</li><li>Saribasak, H., Arakawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+cell+culture+conditions.">Basic cell culture conditions.</a> Subcell. Biochem. 40, 345-346 (2006).</li><li>Conti, C., Seiler, J. A., Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammalian+DNA+replication+elongation+checkpoint:+implication+of+Chk1+and+relationship+with+origin+firing+as+determined+by+single+DNA+molecule+and+single+cell+analyses.">The mammalian DNA replication elongation checkpoint: implication of Chk1 and relationship with origin firing as determined by single DNA molecule and single cell analyses.</a> Cell. Cycle. 6, 2760-2767 (2007).</li><li>Petermann, E., Orta, M. L., Issaeva, N., Schultz, N., Helleday, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyurea-stalled+replication+forks+become+progressively+inactivated+and+require+two+different+RAD51-mediated+pathways+for+restart+and+repair.">Hydroxyurea-stalled replication forks become progressively inactivated and require two different RAD51-mediated pathways for restart and repair.</a> Mol. Cell. 37, 492-502 (2010).</li><li>Edmunds, C. E., Simpson, L. J., Sale, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCNA+ubiquitination+and+REV1+define+temporally+distinct+mechanisms+for+controlling+translesion+synthesis+in+the+avian+cell+line+DT40.">PCNA ubiquitination and REV1 define temporally distinct mechanisms for controlling translesion synthesis in the avian cell line DT40.</a> Mol. Cell. 30, 519-529 (2008).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

אנו מתארים שיטה המאפשרת ניתוח כמותי של פרמטרים המשפיעים על סינתזת דנ&quot;א בשלב S-ברמה מולקולה בודדת. בעשר השנים האחרונות, גרסאות שונות של הטכניקה סיב DNA fluorography שפותחו כדי לחזות את תנועת מזלגות שכפול בודדים בתוך תאים חיים. פרמטר קריטי כל הטכניקות הללו היא הליך המשמש כדי להשיג את הטוב ביותר האפשרי מתיחה של ה-DNA על משטחי זכוכית מתן היטב מופרדים סיבי ה-DNA. צעד חיוני כדי להשיג את זה הזמן הדגירה של ההשעיה תא בשקופית מיקרוסקופ, כמו גם זמן תמוגה. פרמטרים אלה תלויים זרימת האוויר ואת הטמפרטורה במעבדה מסוימת, יש לקבוע באופן אמפירי. החלק המעשי של הניסוי סיב ה-DNA נעשה בדרך כלל בתוך יום אחד. עם זאת, רכישת תמונה ניתוח שלאחר מכן הוא יותר זמן רב ודורש תרגול. פרוטוקול תיוג יכול להיות המודעהapted לענות על בעיות מדעיות שונות: באמצעות סוכן המפריע שכפול במהלך תיוג את הדופק second מפקחת התארכות מזלג / השתהות בתגובה ללחץ replicative. בתרחיש זה, את התווית הראשונה לא צריך להיות דהוי כמו נוקלאוטיד השני הוא הוסיף עודף. לחלופין, תרופות המעכבות שכפול ניתן להשתמש בשילוב או רק לאחר תוספת של התווית הראשונה. זה דורש את התווית הראשונה את התרופה להסירו לפני אנלוגי נוקלאוטידים השני הוא מיושם. הליך זה מאפשר לקבוע את החשיבות של גורמים שונים לתקן את ה-DNA על יציבות replicative מזלג / התאוששות בתנאים של לחץ replicative (מזלג כלומר השתהות ו / או קריסה). ראויים לציון, ניתוח מפורט יותר של פרטי התוכנית שכפול ה-DNA יכול להתבצע תוך שימוש גישות חלופיות שילוב סריקות ה-DNA ואת הקרינה הכלאה באתרה. זה לעומת זאת, היא טכנית יותר מאתגרת ומחייבת expenאלימה עם ציוד. היכולת לנתח איכותית וכמותית פרטי שכפול הדנ&quot;א מספק כלי הכרחי לחקירת פגמים בשכפול ה-DNA עצמו, כמו גם את המסלולים, כי לדכא יציבות גנומית הקשורים מזלגות שכפול. אין ספק, assay זה יהיה עוד יותר לעזור לשפוך אור על מנגנוני תיקון, שכפול ה-DNA בתיווך המאפשרים לתאים נורמליים להגיב / להסתגל לשינויים סביבתיים, כמו גם כמה תאים סרטניים לנצל מנגנונים אלה להתנגד רעילות של תרופות מיקוד מזלגות שכפול.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> עוברית זהב בסרום שור (FBS) </td><td> PAA </td><td> ת 15-151 </td><td></td></tr><tr><td> עוף בסרום </td><td> סיגמא </td><td> C5405 </td><td></td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> PAA </td><td> P11-010 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Gibco </td><td> 21875 </td><td></td></tr><tr><td> 5-Iodo-2&#39;-deoxyuridine (IdU) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I7125 </td><td></td></tr><tr><td> 5-כלורו-2&#39;-deoxy-uridine (CldU) </td><td> סיגמא </td><td> C6891 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ שקופיות SuperFrost </td><td> VWR </td><td> 631-0910 </td><td></td></tr><tr><td> כיסוי תלושי No1 </td><td> מדעי המעבדה suppplies </td><td> MIC3234 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield בינוני הרכבה </td><td> H-1000-Vector מעבדה </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> נוגדן Anti-BrdU (עכבר) </td><td> BD Biosciences </td><td> 347580 </td><td></td></tr><tr><td> נוגדן Anti-BrdU (חולדה) </td><td> Abcam </td><td> ab6326 </td><td></td></tr><tr><td> כבשים אנטי עכבר Cy3 </td><td> סיגמא </td><td> C2181 </td><td></td></tr><tr><td> אנטי עכברוש עז אלקסה פלואוריד 488 נוגדן </td><td> Invitrogen </td><td> A110060 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of dna replication in the vertebrate model system dt40 using the dna fiber technique

שמירה על יציבות מזלג השכפול הוא בעל חשיבות עליונה לחלוקת תאים לשמר חיוניות ולמנוע מחלות. התהליכים המעורבים לא רק להבטיח שכפול הגנום נאמן מול נזק לדנ&quot;א אנדוגני אקסוגני, אלא גם למנוע אי יציבות גנומית, גורם סיבתי מוכר התפתחות הגידול. כאן, אנו מתארים מיקרוסקופיה מבוססי פלואורסצנציה פשוטה וחסכונית שיטה לחזות שכפול הדנ&quot;א בקו B-cell העופות DT40. קו זה התא מספק כלי רב עוצמה כדי לחקור את תפקוד החלבון in vivo על ידי גנטיקה הפוכה בתאים חוליות 1. Fluorography DNA הסיבים DT40 תאים חסר גן מסוים מאפשר להבהיר את הפונקציה של המוצר הזה גנים שכפול דנ&quot;א יציבות הגנום. שיטות מסורתיות כדי לנתח את הדינמיקה מזלג שכפול תאים חוליות להסתמך על מדידת קצב הכוללת של סינתזת דנ&quot;א אוכלוסייה של הדופק שכותרתו תאים. זוהי גישה כמותית אינו מאפשר ניתוח איכותי של פרמטרים המשפיעים על סינתזה של DNA. לעומת זאת, קצב התנועה של מזלגות פעיל ניתן בעקבות ישירות כאשר באמצעות סיב DNA טכניקה 2-4. בגישה זו, ה-DNA המתהווה מתויג in vivo על ידי שילוב של נוקלאוטידים הלוגניים (איור 1A). לאחר מכן, סיבים בודדים נמתחים לשקופית מיקרוסקופ, ו שכפול ה-DNA קטעי שכותרתו מגואלות נוגדנים ספציפיים דמיינו ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 1B). ייזום של שכפול, כמו גם כיווניות מזלג נקבעת על ידי שימוש רצופות של שני אנלוגים שונה אחרת. יתר על כן, הגישה תיוג כפול מאפשר ניתוח כמותי של פרמטרים המשפיעים על סינתזת ה-DNA בשלב-S, כלומר שכפול מבנים כגון מזלגות שוטף נתקע, מוצא צפיפות שכפול, כמו גם הפסקות מזלג. לבסוף, את הליך הניסוי ניתן להשיגעורך תוך יום, ודורש רק ציוד מעבדה כללי מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique at JoVE.com

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

DT40, מערכת החולייתנים מודל גנטי, מספק כלי רב עוצמה כדי לנתח את תפקוד החלבון. כאן אנו מתארים שיטה פשוטה המאפשרת ניתוח איכותני של פרמטרים המשפיעים על סינתזת דנ&quot;א בשלב S-של DT40 תאים ברמת מולקולה בודדת.

ויזואליזציה של שכפול ה-DNA של DT40 דגם מערכת החולייתנים באמצעות טכניקה סיב ה-DNA

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

visualization-dna-replication-vertebrate-model-system-dt40-using-dna

Research

JoVE Journal

Biology

39.7K Views.  University of Oxford. DT40, מערכת החולייתנים מודל גנטי, מספק כלי רב עוצמה כדי לנתח את תפקוד החלבון. כאן אנו מתארים שיטה פשוטה המאפשרת ניתוח איכותני של פרמטרים המשפיעים על סינתזת דנ"א בשלב S-של DT40 תאים ברמת מולקולה בודדת.

Video: Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

חזותי יחיד מולקולת הדנ&quot;א שכפול עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

מחקרים גנטיים של חלבונים תיקון דנ&quot;א אנושי באמצעות שמרים כמודל למערכת

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the environment, but also determines body shape and plays a role in motility4-6. Several layers secreted by epidermal cells comprise the cuticle, including an outermost lipid layer7.
Circumferential ridges in the cuticle called annuli pattern the length of the animal and are present during all stages of development8. Alae are longitudinal ridges that are present during specific stages of development, including L1, dauer, and adult stages2,9. Mutations in genes that affect cuticular collagen organization can alter cuticular structure and animal body morphology5,6,10,11. While cuticular imaging using compound microscopy with DIC optics is possible, current methods that highlight cuticular structures include fluorescent transgene expression12, antibody staining13, and electron microscopy1. Labeled wheat germ agglutinin (WGA) has also been used to visualize cuticular glycoproteins, but is limited in resolving finer cuticular structures14. Staining of cuticular surface using fluorescent dye has been observed, but never characterized in detail15. We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. This optimized protocol for DiI staining is a simple, robust method for high resolution fluorescent visualization of annuli, alae, vulva, male tail, and hermaphrodite tail spike in C. elegans.

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. With this optimized protocol, alae and annular cuticular structures are stained by DiI and observed using compound microscopy.

ויזואליזציה של Caenorhabditis elegans לציפורן מבנים באמצעות דיי ויטל lipophilic, DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

לכידה סלקטיבית של 5-hydroxymethylcytosine מהדנ&quot;א הגנומי

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage checkpoint signaling as a surveillance mechanism to sense DNA damage and direct cellular responses to DNA damage. There are several groups of proteins called sensors, transducers and effectors involved in DNA damage checkpoint signaling (Figure 1). In this complex signaling pathway, ATR (ATM and Rad3-related) is one of the major kinases that can respond to DNA damage and replication stress. Activated ATR can phosphorylate its downstream substrates such as Chk1 (Checkpoint kinase 1). Consequently, phosphorylated and activated Chk1 leads to many downstream effects in the DNA damage checkpoint including cell cycle arrest, transcription activation, DNA damage repair, and apoptosis or senescence (Figure 1). When DNA is damaged, failing to activate the DNA damage checkpoint results in unrepaired damage and, subsequently, genomic instability. The study of the DNA damage checkpoint will elucidate how cells maintain genomic integrity and provide a better understanding of how human diseases, such as cancer, develop.
Xenopus laevis egg extracts are emerging as a powerful cell-free extract model system in DNA damage checkpoint research. Low-speed extract (LSE) was initially described by the Masui group1. The addition of demembranated sperm chromatin to LSE results in nuclei formation where DNA is replicated in a semiconservative fashion once per cell cycle.
The ATR/Chk1-mediated checkpoint signaling pathway is triggered by DNA damage or replication stress 2. Two methods are currently used to induce the DNA damage checkpoint: DNA damaging approaches and DNA damage-mimicking structures 3. DNA damage can be induced by ultraviolet (UV) irradiation, &gamma;-irradiation, methyl methanesulfonate (MMS), mitomycin C (MMC), 4-nitroquinoline-1-oxide (4-NQO), or aphidicolin3, 4. MMS is an alkylating agent that inhibits DNA replication and activates the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint 4-7. UV irradiation also triggers the ATR/Chk1-dependent DNA damage checkpoint 8. The DNA damage-mimicking structure AT70 is an annealed complex of two oligonucleotides poly-(dA)70 and poly-(dT)70. The AT70 system was developed in Bill Dunphy's laboratory and is widely used to induce ATR/Chk1 checkpoint signaling 9-12.
Here, we describe protocols (1) to prepare cell-free egg extracts (LSE), (2) to treat Xenopus sperm chromatin with two different DNA damaging approaches (MMS and UV), (3) to prepare the DNA damage-mimicking structure AT70, and (4) to trigger the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint in LSE with damaged sperm chromatin or a DNA damage-mimicking structure.

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Xenopus egg extract is a useful model system to investigate the DNA damage checkpoint. This protocol is for the preparation of Xenopus egg extracts and DNA damage checkpoint inducing reagents. These techniques are adaptable to a variety of DNA damaging approaches in the study of the DNA damage checkpoint signaling.

חקר מחסום הניזק לדנ&quot;א באמצעות<em&gt; Xenopus</em&gt; תמציות ביצה

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH has become a major tool for analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations of the technique have been published. In this article we describe a protocol which has been optimized for robustness, reproducibility, and ease of use. Brightly fluorescent directly labeled probes are generated by nick-translation with amino-allyldUTP followed by chemical coupling of the dye. 3D DNA FISH is performed using a freeze-thaw step for cell permeabilization and a heating step for simultaneous denaturation of probe and nuclear DNA. The protocol is applicable to a range of cell types and a variety of probes (BACs, plasmids, fosmids, or Whole Chromosome Paints) and allows for high-throughput automated imaging. With this method we routinely investigate nuclear localization of up to three chromosomal regions.

We describe a robust and versatile protocol for analyzing nuclear architecture by 3D DNA FISH using directly labeled fluorescent probes.

דגי ה-DNA 3D חזקים באמצעות בדיקות שכותרתו ישירות

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

הדמיה בזמן אמת של יחיד תכנון הנדסי RNA תמלילים בתאים חיים באמצעות משואות bimolecular רציומטרי

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

הגברה, רצף הדור הבא, ואת הגנום מיפוי ה- DNA של אתרי אינטגרצית retroviral

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

ויזואליזציה של מולקולות DNA גדולות קשור Surface עם DNA חלבון פלואורסצנטי כריכת פפטיד

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...