我々は、繊維の技術だけでなく、有用な議論のための研究室のメンバーとの助けのために博士T. Helleday博士とE.ピーターマンに感謝。 WNは、国際がん研究のための協会からシニアの国際特別研究員による科学研究助成金（N301 165935）のためのポーランド国家委員会によってサポートされています。

シュワブら、EMBO J.、29（4）:806 - 18 5：メソッドは、次の出版物で使用されていたここで説明する。 1。 DT40細胞培養 材料：ウシ胎児血清（FBS）、ニワトリ血清、ペニシリン/ストレプトマイシン、2 -メルカプトエタノール、RPMI <ol><li>細胞培養の培地を準備する：RPMI培地に3％ニワトリ血清、1 ×ペニシリン/ストレプトマイシン及び10μM2 - メルカプトエタノールで7％FBSを追加。 </li><li> DT40細胞は、38で滅菌細胞培養フラスコ中で増殖させる℃、5％加湿インキュベーター中CO 2。 5 × 10 5細胞/ mlの6濃度に毎日のセルを分割する。 </li></ol> （2） インビボ標識で 材料：IDU、CldU <ol><li>ヌクレオチド類似体のストック溶液を準備します。培地に2.5 mMまで5 mmとCldUにIDUを溶かす。ヌクレオチドアナログになるまで熱を60〜簡単に解決策の両方° Cと渦UESは完全に溶解されています。 </li><li>指数関数的にDT40細胞の成長を25μMの最終濃度にIDUを加え、よく細胞懸濁液を混ぜる。 38℃および5％CO 2で20分間細胞をインキュベートする。 </li><li>最初のラベルとのインキュベーション後、250μMの最終濃度にCldUを追加し、前の手順で説明したように、細胞を扱います。 </li><li>氷冷PBSで細胞を洗浄し、冷PBSで7.5 × 10 5細胞/ mlの濃度で再懸濁します。氷上で標識された細胞を保管してください。 </li></ol>説明した標識手順は、単なる提案であり、具体的な質問に対処するために変更することができます。実験計画の詳細については、議論のセクションを参照してください。 3。拡散細胞溶解とDNA 材料：ガラススライド、繊維の溶解液<ol><li> 200mMのトリス- HCl、pH7.5中の50mM EDTAおよび0.5％SDS：繊維溶解液を準備する</li><liスライドガラスの一端に細胞懸濁液の&gt;スポットを2μl。 5分間、またはドロップのボリュームになるまで空気乾燥が大幅に減少したが、乾燥されていません。 </li><li>ピペットで7μlの溶解細胞懸濁液の上にソリューションと穏やかに溶液を混合し、ピペットチップを用いてかき混ぜる。続行する細胞溶解のための2分間インキュベートする。 </li><li>繊維がスライドに沿って広がるようにする15 °にスライドを傾けて。 </li><li>ファイバーソリューションは、スライドの下部に達すると、空気乾燥するために水平に置きます。乾燥後、薄い、不透明なラインは、スライドに沿って表示されるはずです。この時点で、ストレッチ繊維の始まりは、行がもう表示されません染色後のように鉛筆でマークする必要があります。このマークは、後で顕微鏡で繊維を見つけるのに役立ちます。 </li></ol> 4。免疫蛍光染色 材料：メタノール、酢酸、塩酸、PBSで5％BSA、染色瓶、抗BrdU（マウス）抗体、抗BrdU（ラット）抗体、ヒツジ抗マウスのCy3抗体、ヤギ抗ラットのAlexa Fluor ® 488抗体、Vectashieldマウンティング培地、カバーガラス、マニキュア<ol><li>メタノール/ 10分間染色瓶やインキュベートの酢酸（3:1）に浸しスライド。 </li><li> 80分で2.5 M HCl中でその後、浸漬蒸留H 2 Oでスライドを、洗う。 </li><li>洗浄は5分間PBSで3回スライド。 </li><li>染色のjarファイルからスライドを削除し、ペーパータオルで余分なPBSを収集する。水平にスライドを置き、各スライドの上にピペットを5％BSA。スライド上に均等にBSAを広げると20分間インキュベートするカバースリップで軽くスライドしてカバーしています。 </li><li> 1時25抗BrdU（マウス）と1:400抗BrdU（ラット）：以下の濃度で5％BSAで一次抗体を希釈する。 </li><li>それを削除するには、軽くガラススライドダウンカバースリップを移動します。カバースリップをスライドに付着する場合は、 - forceを適用しないでください。カバースリップが緩くなるまで、スライドをPBSで再水和しすることができますdは、容易に取り外すことができます。ペーパータオルで余分なBSAを収集し、水平にスライドを配置。各スライド上に一次抗体溶液のピペットで50μlの。スライド上に均等に抗体溶液を広げると2時間加湿チャンバー内でインキュベートするカバースリップで再びカバー。 </li><li>カバーグラスを除去した後、5分間、スライドをPBSで3回洗浄</li><li> 1:500ヒツジ抗マウスCy3および1:400ヤギ抗ラットのAlexa Fluor ® 488：以下濃度で5％BSAで二次抗体を希釈する。 </li><li>として一次抗体で説明した二次抗体の溶液50μlを適用します。 1時間の光とインキュベートからスライドを保護します。 </li><li>カバーグラスを除去した後、5分間、スライドをPBSで3回洗浄する。 </li><li>各スライドにVectashieldマウンティング培地のドロップを追加し、カバースリップを適用します。静かにカバーガラスを押して、紙タオルでその周囲に余分な水分を取り除く。透明な爪ポリスとシールのカバースリップhとそれらを乾燥させます。 -20℃でスライドを保存する</li></ol> 5。画像の取得 材料：蛍光顕微鏡、カメラ鉛筆のマークの近くにスライド上に液浸オイルのドロップを置き、繊維を位置決め開始。通常は、そこにメインの繊維束があるが、これらの繊維は、あまりにも絡み合い、後で分析することができない。繊維がはっきりと（図2）互いに分離されている領域を見つけるために離れてメインバンドルから移動します。我々はバイアスを避けるために、1つのカラーチャンネルを使用して画像を選択することになります。その後、我々は、各時点、濃度または細胞株の約10枚の写真がかかります。しかし、写真の数は、各画像にカウントすることができますどのように多くの繊維によって異なります。スライドの一つの領域は、代表的な繊維の長さまたは複製構造を提供しないかもしれないので、別の写真を撮ってスライドに沿って移動します。 6。データ分析材料：画像解析プログラム、例えば、ImageJは（ <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ） 画像解析プログラムに画像をインポートします。線維路の長さを測定および/または異なるレプリケーションの構造（図3）を数える。唯一はっきりと表示されていると画像のエッジ上に拡張されないようになる繊維を数える。我々は、典型的に約100の繊維の長さを測定し、150から200のレプリケーション構造をカウントし、我々は個々の実験を少なくとも3回繰り返します。 7。代表的な結果： 新しく複製されたDNAを抗体標識ヌクレオチド類似体の線として視覚化できます。我々の実験では継続的なフォークは、隣接する赤と緑の信号（図3）として表されます。新しい開始イベントはdividすることができます）1：二重標識のプロトコルはまた、私たちは、レプリケーションの構造の4つの主要なクラスを定義することができます<html>細胞は最初のラベルと番目のラベルとのインキュベーションの間に発射されているの起源とインキュベートしている間、起動された起源にED。前者は、隣接する緑 - 赤 - 緑信号と緑のラインの後者のみで構成されています。 2）の終了イベントは、隣接する赤、緑、赤の信号として現れます。 3）散在の起源は、密な間隔の起源とゲノム中のサイトです。このようなサイトでは、連続した起源と終了の信号で構成されています。実験的な設計に応じて4）、失速/折りたたみフォークはどちら赤のみ信号7または短い緑地8,9に続いて赤い線のように定義することができます。 条件を使用すると、野生型DT40細胞が0.4μm/分の平均フォークの速度を持って、ここで説明する。我々は、約63％進行中のフォーク、10％の起源、16％失速フォーク（赤のみトラクト）、8％の終端および3％散在繊維を検出することができます。 <html> Figure 1に&quot;/&gt; 図1（A）漫画の左側は、DNAのラベリング手順の最初のステップを描いている：。IDUが指数関数的にDT40細胞の成長に追加するには、容易に新たに合成される先行および遅行DNA鎖に取り込まれるヌクレオチドアナログをリードしています。これは、特定の抗体を用いて可視化することができる、と顕微鏡下で観察すると、赤色の線として表示されます。図の右側に示すように続いて、同じ手順がCldUで繰り返されます。第2ヌクレオチドアナログとのインキュベーション後、アクティブなフォークは、隣接する赤と緑道として表示されます。平均繊維長は、ヌクレオチド類似体のインキュベーション時間に比例します。 （B）溶解したDT40細胞からDNAを顕微鏡スライド上に重力によって引き伸ばされ、組み込まれたヌクレオチド類似体は、特異的な抗体と蛍光顕微鏡の使用により可視化される。 igure 2&quot;/&gt; 図2代表的な蛍光画像は、その後20分ごとに、IDUとCldUで標識された野生型DT40細胞から繊維を示しています。繊維のほとんどは、お互いから分離されているため、容易に分析することができます。白いバーは10μmを表す。 <img src="/files/ftp_upload/3255/3255fig3.jpg" alt="図3" /> 図は、3重標識の光ファイバ技術は1つが異なるレプリケーション構造を区別することができます、1 -積極的に複製フォーク、2 - DNA複製の新しいサイト（新しい起源の発火）、3 -フォークの終端（二収束フォーク）、4 -散在繊維（近接した起源の部位）と5 - ストールフォーク（赤のみの信号）。

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	<li>Caldwell, R. B., Fiedler, P., Schoetz, U., Buerstedde, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+function+analysis+using+the+chicken+B-cell+line+DT40.">Gene function analysis using the chicken B-cell line DT40.</a> Methods. Mol. Biol. 408, 193-210 (2007).</li><li>Petes, T. D., Williamson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+autoradiography+of+replicating+yeast+DNA.">Fiber autoradiography of replicating yeast DNA.</a> Exp. Cell. Res. 95, 103-110 (1975).</li><li>Takeuchi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+frequency+of+initiation+sites+of+DNA+replication+in+Werner's+syndrome+cells.">Altered frequency of initiation sites of DNA replication in Werner's syndrome cells.</a> Hum. Genet. 60, 365-368 (1982).</li><li>Jackson, D. A., Pombo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicon+clusters+are+stable+units+of+chromosome+structure:+evidence+that+nuclear+organization+contributes+to+the+efficient+activation+and+propagation+of+S+phase+in+human+cells.">Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells.</a> J. Cell. Biol. 140, 1285-1295 (1998).</li><li>Schwab, R. A., Blackford, A. N., Niedzwiedz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATR+activation+and+replication+fork+restart+are+defective+in+FANCM-deficient+cells.">ATR activation and replication fork restart are defective in FANCM-deficient cells.</a> EMBO. J. 29, 806-818 (2010).</li><li>Saribasak, H., Arakawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+cell+culture+conditions.">Basic cell culture conditions.</a> Subcell. Biochem. 40, 345-346 (2006).</li><li>Conti, C., Seiler, J. A., Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammalian+DNA+replication+elongation+checkpoint:+implication+of+Chk1+and+relationship+with+origin+firing+as+determined+by+single+DNA+molecule+and+single+cell+analyses.">The mammalian DNA replication elongation checkpoint: implication of Chk1 and relationship with origin firing as determined by single DNA molecule and single cell analyses.</a> Cell. Cycle. 6, 2760-2767 (2007).</li><li>Petermann, E., Orta, M. L., Issaeva, N., Schultz, N., Helleday, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyurea-stalled+replication+forks+become+progressively+inactivated+and+require+two+different+RAD51-mediated+pathways+for+restart+and+repair.">Hydroxyurea-stalled replication forks become progressively inactivated and require two different RAD51-mediated pathways for restart and repair.</a> Mol. Cell. 37, 492-502 (2010).</li><li>Edmunds, C. E., Simpson, L. J., Sale, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCNA+ubiquitination+and+REV1+define+temporally+distinct+mechanisms+for+controlling+translesion+synthesis+in+the+avian+cell+line+DT40.">PCNA ubiquitination and REV1 define temporally distinct mechanisms for controlling translesion synthesis in the avian cell line DT40.</a> Mol. Cell. 30, 519-529 (2008).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

我々は、単一分子レベルでのS相中にDNA合成に影響を与えるパラメータの定量分析を可能にする方法を説明します。過去10年間で、DNAの繊維のフルオログラフィー法の異なるバージョンは、生きた細胞内の個々の複製フォークの動きを可視化するために開発されました。すべてのこれらの技術の重要なパラメータは、十分に分離されたDNAの繊維を提供するガラス表面上にDNAの伸縮可能な限り最高を達成するために使用されるプロシージャです。これを達成するための重要なステップは、顕微鏡スライド上に細胞懸濁液だけでなく、溶解時間のインキュベーション時間です。これらのパラメータは、特定のラボでの温度と気流に依存し、経験的に決定されるべきである。 DNAの繊維の実験の実用的な部分は、通常1日以内に行われます。しかし、その後の画像の取得と解析は、より多くの時間がかかり、練習が必要です。 ラベリングのプロトコールは、広告することができます様々な科学的問題に答えることをapted：秒パルスラベリングの間のレプリケーションに干渉するエージェントを使用すると、フォークの伸長/複製ストレスに応答して失速を監視します。このシナリオでは、最初のラベルは、第2ヌクレオチドを​​過剰に添加されるとして洗浄す​​る必要はありません。また、複製を阻害する薬剤を組み合わせてまたは単に最初のラベルの添加後に使用することができます。これは最初のラベルと第二のヌクレオチドアナログが適用される前に削除される薬剤を必要とします。この手順では、1つは、複製ストレスの条件（すなわち、フォークが失速および/または崩壊）の下で複製フォークの安定性/回復に関する様々なDNA修復因子の重要性を決定することができます。注目すべきは、DNA複製プログラムの細目のより詳細な分析は、コーミングDNAと蛍光in situハイブリダイゼーションを組み合わせた代替アプローチを用いて行うことができた。しかし、これは技術的に、より困難であると高価が必要ですsive機器。 定性的および定量的DNA複製の明細を分析する能力は、DNA複製自体の欠陥だけでなく、複製フォークに関連付けられているゲノム不安定性を抑制する経路を調査するための不可欠なツールを提供しています。間違いなく、このアッセイは、さらに正常な細胞はがん細胞がこれらのメカニズムは、複製フォークを標的薬の毒性に抵抗するために利用する方法だけでな​​く、環境変化への対応/適応できるよう、レプリケーションを介したDNA修復のメカニズムに光を当てるのに役立ちます。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td>ウシ胎児血清金（FBS） </td><td> PAA </td><td> A15 - 151 </td><td></td></tr><tr><td>鶏血清</td><td>シグマ</td><td> C5405 </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td> PAA </td><td> P11 - 010 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> GIBCO </td><td> 21875 </td><td></td></tr><tr><td> 5 - ヨード-2&#39; - デオキシウリジン（IDU） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> I7125 </td><td></td></tr><tr><td> 5 - クロロ-2&#39; - デオキシ - ウリジン（CldU） </td><td>シグマ</td><td> C6891 </td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡はSuperFrostスライド</td><td> VWR </td><td> 631-0910 </td><td></td></tr><tr><td>カバーは​​、No1のをスリップ</td><td>科学的な実験室のsuppplies </td><td> MIC3234 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashieldマウンティング培地</td><td> H - 1000ベクトルラボ</td><td> H - 1000 </td><td></td></tr><tr><td>抗BrdU抗体（マウス） </td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 347580 </td><td></td></tr><tr><td>抗BrdU抗体（ラット） </td><td>アブカム</td><td> ab6326 </td><td></td></tr><tr><td>ヒツジ抗マウスCy3と</td><td>シグマ</td><td> C2181 </td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ラットのAlexa Fluor ® 488抗体</td><td>インビトロジェン</td><td> A110060 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of dna replication in the vertebrate model system dt40 using the dna fiber technique

複製フォークの安定の維持は可能性を維持し、病気を防ぐためにセルを分割するための最も重要なのです。関連するプロセスは、腫瘍の開発で認識原因となる要因を内因性と外因性DNA損傷の顔に忠実なゲノムの重複を確保するだけでなく、ゲノム不安定性を防ぐことだけ。 ここで、我々は、シンプルでコスト効率の良い蛍光顕微鏡ベースの鳥B -細胞株DT40のDNA複製を可視化する方法を説明します。この細胞株は、脊椎動物細胞1の逆遺伝学によるin vivoでのタンパク質の機能を調査する強力なツールが用意されています。特定の遺伝子を欠損DT40細胞におけるDNAの繊維のフルオログラフィーは1つがDNA複製とゲノムの安定性におけるこの遺伝子産物の機能を解明することができます。脊椎動物の細胞内で複製フォークの動態を分析する従来の方法は、パルス標識した細胞の集団におけるDNA合成の全体的な速度を測定することに依存しています。これは定量的なアプローチであり、DNA合成に影響を与えるパラメータの定性分析のために許可されていません。 DNAの繊維技術2-4を使用しているときとは対照的に、アクティブなフォークの動きの速度を直接追跡することができる。このアプローチでは、発生期のDNAは、ハロゲン化ヌクレオチドの取り込み（図1A）によって生体内でラベルが付けられています。その後、個々の繊維は顕微鏡のスライド上に引き伸ばされている、と標識DNAの複製の路は、特異的な抗体で染色し、蛍光顕微鏡（図1Bの）によって可視化されています。複製だけでなく、フォークの方向性の開始は​​、異なる2つの修正されたアナログの連続した​​使用によって決定されます。さらに、デュアルラベルをつける方法は、S期の間にDNA合成に影響を与えるパラメータの定量分析を可能にする、などの継続的かつストールフォーク、複製起点の密度だけでなく、フォークの終了など、すなわち複製構造。最後に、実験手順は、達成することができます。日以内ED、そして唯一の一般的な臨床検査機器や蛍光顕微鏡が必要です。

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Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

DT40、モデル脊椎動物の遺伝学的システムは、タンパク質の機能を解析する強力なツールが用意されています。ここでは、単一分子レベルでのDT40細胞におけるS期の間にDNA合成に影響を与えるパラメータの定性的な分析を可能にするシンプルな方法を説明します。

DNAの繊維技術を用いた脊椎動物のモデルシステムのDT40のDNA複製の可視化

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

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Research

JoVE Journal

Biology

39.7K ビュー.  University of Oxford. DT40、モデル脊椎動物の遺伝学的システムは、タンパク質の機能を解析する強力なツールが用意されています。ここでは、単一分子レベルでのDT40細胞におけるS期の間にDNA合成に影響を与えるパラメータの定性的な分析を可能にするシンプルな方法を説明します。

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Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

蛍光顕微鏡による可視化単分子のDNAの複製

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

生物学

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

人間のDNA修復タンパク質の遺伝的研究は、モデルシステムとして酵母を使用

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the environment, but also determines body shape and plays a role in motility4-6. Several layers secreted by epidermal cells comprise the cuticle, including an outermost lipid layer7.
Circumferential ridges in the cuticle called annuli pattern the length of the animal and are present during all stages of development8. Alae are longitudinal ridges that are present during specific stages of development, including L1, dauer, and adult stages2,9. Mutations in genes that affect cuticular collagen organization can alter cuticular structure and animal body morphology5,6,10,11. While cuticular imaging using compound microscopy with DIC optics is possible, current methods that highlight cuticular structures include fluorescent transgene expression12, antibody staining13, and electron microscopy1. Labeled wheat germ agglutinin (WGA) has also been used to visualize cuticular glycoproteins, but is limited in resolving finer cuticular structures14. Staining of cuticular surface using fluorescent dye has been observed, but never characterized in detail15. We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. This optimized protocol for DiI staining is a simple, robust method for high resolution fluorescent visualization of annuli, alae, vulva, male tail, and hermaphrodite tail spike in C. elegans.

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. With this optimized protocol, alae and annular cuticular structures are stained by DiI and observed using compound microscopy.

の可視化線虫（Caenorhabditis elegans）</em親油性生体染色色素、DIIを使用する>キューティクルの構造

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage checkpoint signaling as a surveillance mechanism to sense DNA damage and direct cellular responses to DNA damage. There are several groups of proteins called sensors, transducers and effectors involved in DNA damage checkpoint signaling (Figure 1). In this complex signaling pathway, ATR (ATM and Rad3-related) is one of the major kinases that can respond to DNA damage and replication stress. Activated ATR can phosphorylate its downstream substrates such as Chk1 (Checkpoint kinase 1). Consequently, phosphorylated and activated Chk1 leads to many downstream effects in the DNA damage checkpoint including cell cycle arrest, transcription activation, DNA damage repair, and apoptosis or senescence (Figure 1). When DNA is damaged, failing to activate the DNA damage checkpoint results in unrepaired damage and, subsequently, genomic instability. The study of the DNA damage checkpoint will elucidate how cells maintain genomic integrity and provide a better understanding of how human diseases, such as cancer, develop.
Xenopus laevis egg extracts are emerging as a powerful cell-free extract model system in DNA damage checkpoint research. Low-speed extract (LSE) was initially described by the Masui group1. The addition of demembranated sperm chromatin to LSE results in nuclei formation where DNA is replicated in a semiconservative fashion once per cell cycle.
The ATR/Chk1-mediated checkpoint signaling pathway is triggered by DNA damage or replication stress 2. Two methods are currently used to induce the DNA damage checkpoint: DNA damaging approaches and DNA damage-mimicking structures 3. DNA damage can be induced by ultraviolet (UV) irradiation, &gamma;-irradiation, methyl methanesulfonate (MMS), mitomycin C (MMC), 4-nitroquinoline-1-oxide (4-NQO), or aphidicolin3, 4. MMS is an alkylating agent that inhibits DNA replication and activates the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint 4-7. UV irradiation also triggers the ATR/Chk1-dependent DNA damage checkpoint 8. The DNA damage-mimicking structure AT70 is an annealed complex of two oligonucleotides poly-(dA)70 and poly-(dT)70. The AT70 system was developed in Bill Dunphy's laboratory and is widely used to induce ATR/Chk1 checkpoint signaling 9-12.
Here, we describe protocols (1) to prepare cell-free egg extracts (LSE), (2) to treat Xenopus sperm chromatin with two different DNA damaging approaches (MMS and UV), (3) to prepare the DNA damage-mimicking structure AT70, and (4) to trigger the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint in LSE with damaged sperm chromatin or a DNA damage-mimicking structure.

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Xenopus egg extract is a useful model system to investigate the DNA damage checkpoint. This protocol is for the preparation of Xenopus egg extracts and DNA damage checkpoint inducing reagents. These techniques are adaptable to a variety of DNA damaging approaches in the study of the DNA damage checkpoint signaling.

用いたDNA損傷チェックポイントの研究<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;卵抽出

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH has become a major tool for analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations of the technique have been published. In this article we describe a protocol which has been optimized for robustness, reproducibility, and ease of use. Brightly fluorescent directly labeled probes are generated by nick-translation with amino-allyldUTP followed by chemical coupling of the dye. 3D DNA FISH is performed using a freeze-thaw step for cell permeabilization and a heating step for simultaneous denaturation of probe and nuclear DNA. The protocol is applicable to a range of cell types and a variety of probes (BACs, plasmids, fosmids, or Whole Chromosome Paints) and allows for high-throughput automated imaging. With this method we routinely investigate nuclear localization of up to three chromosomal regions.

We describe a robust and versatile protocol for analyzing nuclear architecture by 3D DNA FISH using directly labeled fluorescent probes.

直接標識プローブを用いた堅牢な3DのDNA FISH

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

レシオメトリック二分子ビーコンを使用して、生細胞における単エンジニアのRNA転写物のリアルタイムイメージング

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

レトロウイルス統合サイトの増幅、次世代シーケンシング、およびゲノムDNAのマッピング

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

ペプチドを結合蛍光タンパク質のDNAを用いた表面係留大型DNA分子の可視化

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

核酸の濾過単離：簡易迅速DNA抽出方法

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...