وقد تم تمويل هذا البحث من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة AI062732 K08 ، K12 HD001401 و1UL1RR024139 02 - بحوث الصحية ومنح الطفل من مؤسسة تشارلز هود لحاء SB - M. ومؤسسة الأبحاث في جامعة ولاية نيويورك في ستوني بروك.

1. EBV الأسهم إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة فرعية المتنامية باطراد B95 - 8 خلايا (آي تي سي سي # CRL 1612 ؛ 13) في الخلايا 3 × 5 / 10 مل في 75cm 2 قارورة الثقافة الأنسجة باستخدام تقنية معقمة. وتزرع في الخلايا التي تحتوي على 1640 RPMI كاملة المعطل للحرارة بنسبة 10 ٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، البنسلين / الستربتوميسين في 100U/ml و 100 ميكروغرام / لتر ، على التوالي ، وباء الامفوتريسين عند 0.5 ميكروغرام / لتر عند 37 درجة مئوية في وجود 5 ٪ من ثاني أكسيد الكربون 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثمان وأربعين ساعة في وقت لاحق ، والخلايا في resuspend RPMI كاملة جديدة 1640 الخلايا في 1 6 × 10 / مل. للحث على إنتاج الفيروس ، وتحفيز الخلايا مع خلات 20ng/ml phorbol tetradecanoyl (TPA) لمدة 1 ساعة في الحاضنة القياسية 2 CO. غسل الخلايا ثلاث مرات مع RPMI 1640 لإزالة طن سنويا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا في الحجم الأصلي للRPMI كاملة 1640 (من 1.2) ووضع في قارورة CO 2 الحاضنة لمدة 96 ساعة. وقد تبين أن هذه الطريقة لإنتاج التتر عالية من المساواة الفيروسات المعدية6 جسيمات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في ز × 600 لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية في فصل EBV المحتوية طاف الثقافة من الخلايا. تصفية طاف من خلال مرشح 0.45 ميكرون ، قسامة ، وتخزينها في -70 درجة مئوية لمدة أكثر من عام. بديل هو الحصول على طاف B95 - 8 من الخلايا التي تحتوي على EBV من ATCC (VR - 1492) واستخدامها في التخفيف الموصى بها من قبل آي تي ​​سي سي. </li></ol> 2. عزل الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى (PBMC) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعادل 10 مل من الدم المانحة الى حقنة heparinized أو أنبوب الدم heparinized. تمييع الدم PBS مع 20 مل في درجة حرارة الغرفة في أنبوب مخروطية 50 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأساس الذي تقوم عليه الدم المخفف مع 15 مل المتوسطة Hypaque Ficoll فصل الخلايا اللمفاوية. الطرد المركزي في ز × 225 بدون فرامل في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الغلالة الشهباء ونقل في أنبوب جديد 50 مل المخروطية. زيادة حجم إلى 50 مل مع برنامج تلفزيوني وتدور في 600 XG في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بوص قبالة طاف. غسل الخلايا عن طريق إعادة التعليق بيليه في برنامج تلفزيوني مل 50 و الغزل في ز × 600 في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. يغسل مرتين بطريقة مماثلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل Resuspend الخلايا في 1 مل من RPMI كاملة. 5 ميكرولتر من استخدام الخلايا لإعداد تخفيف 10/01 في الزرقاء التريبان. عدد الخلايا الحية باستخدام عدادة الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط مستوى الصوت باستخدام RPMI كاملة في 25 سم 2 الأنسجة قارورة الثقافة للحصول على تركيز خلية من 2 × 10 مل / 6. </li></ol> 3. العدوى بفيروس EBV <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة FK506 (AG العلمية) إلى تعليق خلية من 2.6 إلى تركيز النهائي من 20 نانومتر. دورق مكان في CO 2 في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد من على وجه السرعة قسامة EBV. إزالة قارورة من الحاضنة وEBV إضافة إلى الخلايا في 10/01 التخفيف. عادة ، وهذا يوفر وزارة الداخلية التخفيف من 5-10. قارورة دوامة لخلط ووضعه تستقيم في CO 2 حاضنة في 37 درجة مئوية. </li></ol> علما عشرفي الخطوة 4 ، يقوم على التنبؤ بنتائج ناجحة ، هو خطوة اختيارية. إذا الخطوة 4 هو المراد تنفيذها ، وسوف تحتاج لاحتضان an قارورة إضافية من الامم المتحدة وإصابة PBMC في الخلايا 6 × 2 / 10 مل والسيطرة عليها. 4. تحديد السكان تكاثر الخلايا (خطوة اختيارية) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد نظام مراقبة الأصول الميدانية العازلة : PBS + 5 ٪ FBS. تخزين عند 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل الأضداد التالية يمزج في 50 ميكرولتر حجم كل لتلطيخ الخلايا في الخطوة 4.6. وينبغي بذل التخفيفات في الضد العازلة التي تحتوي على نظام مراقبة الأصول الميدانية للمفتش 1mg/ml الماوس (سيغما) لمنع غير محددة وملزمة من قبل الأجسام المضادة. <ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> واحد ملطخة PE الأضداد المضادة للCD23 مترافق (1 / 50 التخفيف) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> واحد ملطخة FITC الأضداد المضادة للCD58 مترافق (1 / 50 التخفيف) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> واحد ملطخة PE - Cy5 الأضداد المضادة للCD19 مترافق (1 / 50 التخفيف) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الثلاثي الملون لCD58 ، CD23 ، CD19 و (1 / 50 تمييع لكل منهما) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> واحد ملطخة السيطرة PE isotype مترافقالمتطابقة الضد لCD23 - PE (في نفس تركيز مكافحة CD23 الضد) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> واحد ملطخة FITC مترافق isotype الضد تحكم مطابقة لFITC - CD58 (في نفس تركيز مكافحة CD58 الضد) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> واحد ملطخة PE - Cy5 السيطرة isotype مترافق الضد مطابقة لCD19 - PE - Cy5 (في نفس تركيز مكافحة CD19 الضد) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الثلاثي ملطخة جميع الأضداد isotype السيطرة على ثلاثة. </li></ol> مخزن مؤقتا يمزج في 4 درجات مئوية في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في ثلاثة أيام من التعرض لمرحلة ما بعد EBV ، برفق القارورة دوامة الحصول على تعليق الخلية أكثر اتساقا. إزالة 2ml من قارورة في أنبوب إيبندورف 2ml. تدور في أنبوب microcentrifuge في 3000 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح خلايا وطاف في resuspend العازلة FACS في 5 × 6-1 أكتوبر 7 × 10 خلية / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة eight aliquots 50μl في أنابيب إيبندورف فرد أو 96 - V - جيدا وحة القاع. تدور أنابيب أو لوحة في 1500 س زلمدة 3 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل أنابيب طاف ودوامة / لوحة. Resuspend الخلايا في كل أنبوب / جيد في 50 ميكرولتر من FACS العازلة التي تحتوي على الأجسام المضادة المناسبة التخفيفات أعد في 4.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان أنابيب / لوحة على الجليد في الظلام لمدة 30 دقيقة. خلايا الطرد المركزي في 3000 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق ، وإزالة طاف ، وإضافة 200 ميكرولتر من FACS العازلة. الطرد المركزي وإزالة الخلايا مرة أخرى لإكمال طاف يغسل. كرر اثنين من أكثر يغسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا Resuspend في 200 FACS ميكرولتر العازلة والحصول على البيانات باستخدام تدفق عداد الكريات ، والحصول على 20000 / الأحداث الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل البيانات باستخدام WinMDI (مجانية لتحليل بيانات نظام مراقبة الأصول الميدانية على جهاز الكمبيوتر). بوابة على الخلايا الحية باستخدام التشكيلات مبعثر إلى الأمام والجانب. ثم ، والخلايا الحية بوابة للتعبير عن CD19 + (B علامة الخلية) بعد مقارنة مع الخلايا ملطخة الضد isotype تحكم مطابقة لمكافحة CD19 الأجسام المضادة. مؤامرة CD19 + باء الخلايا الحية مع كثافة مضان لCD23 على محور س وكثافة مضان لCD58 على المحور الصادي. تحديد CD23 CD58 + + والخلايا عن طريق مقارنة EBV المعرضة للخلايا ملطخة المتطابقة السيطرة isotype الأضداد. وجود خلايا CD23 CD58 + مرحبا في EBV المعرضة للثقافة (الشكل 2C) يتنبأ ثمرة نجاح EBV المصابين نمو الخلايا المتحولة. في المقابل ، CD23 CD58 + مرحبا الخلايا لا تظهر عندما لا تتعرض الخلايا لEBV (الشكل 2A) أو تعرضت لسلالة غير تخليد من EBV (الشكل 2B). وقد CD23 CD58 + مرحبا الخلايا أثبتت تجريبيا على الخضوع لانتشار الأسلحة النووية ووضع في وقت لاحق LCL (14). </li></ol> 5. التوسع والحفظ بالتبريد من LCL <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التصور من الخلايا المجهري ضوء : لمدة أسبوع بعد الإصابة EBV ، ومجموعات من الخلايا مرئية بواسطة المجهر الضوئي. الشكل 3 يوضح مثالا لمجموعات مجهرية في وقت مبكر (الشكل 3B) في قارورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كما تقدم الوقت ، والتكتلات المجهرية بحيث تصبح أكبر كتل مرئيةظاهريا في القارورة. ويبين الشكل 3C أكبر مجموعات من الخلايا التي وضعتها في LCL المجهر الضوئي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغذية الخلايا : مضاعفة حجم المتوسطة الثقافة في قارورة الثقافة في يوم 12. في وقت لاحق ، وتوسيع الثقافة عن طريق زيادة حجمه 2-3 أضعاف باستخدام RPMI كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي تحديد دورية الخلايا المغذية على أساس معدل نمو الخلايا. عندما يتحول إلى اللون الأصفر مستنبت ، فهو عموما الوقت ليحل محل وسائل الإعلام على النحو الوارد أعلاه. عادة ، وهذا يحدث مرة واحدة في الاسبوع. ومع ذلك ، قد تكون بعض خطوط الخلايا تحتاج إلى تغذية أكثر أو أقل بشكل متكرر. توسيع الثقافة إلى 75-100 مل على مدى الأسابيع القليلة المقبلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفظ بالتبريد : عند أسفل تجميد الخلايا والخلايا الطرد المركزي في ز × 600 لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة طاف بيليه وresuspend خلية في المتوسط ​​تجميد الباردة التي تحتوي على 90 ٪ FBS وdimethylsulfoxide 10 ٪ في 1 × 10 7 خلية / مل. أنبوب مكان في النيتروجين السائل. </li></ol> 6. ممثل النتائج : <html> ومن المتوقع نتيجة ناجحة من وجود خلايا CD23 CD58 + مرحبا. وينبغي أن حوالي 2-3 ٪ من الخلايا الحية في يوم 3-4 بعد التعرض لEBV يكون هذا الملف (الشكل 2C). فرعية أخرى من السكان CD23 + ، CD23 -- ، CD58 + و CD58 -- لاحظ الخلايا بعد التعرض لانتشار EBV تظهر الحد الأدنى من 14. برنامج الأمم المتحدة للخلايا المصابة (الشكل 2A) والخلايا المعرضة لEBV من الخلايا HH514 - 16 (الشكل 2B) ، بايواء سلالة غير تخليد من EBV ، لا تثبت CD23 CD58 + مرحبا الخلايا. قد تصور أيضا الخلايا عن طريق الفحص المجهري لرصد ضوء نتائج ناجحة : كما ذكر سابقا ، في غضون أسبوع بعد العدوى EBV ، مجموعات صغيرة من الخلايا في قارورة مرئية بواسطة المجهر الضوئي (الشكل 3B). مع مرور الوقت وتتحول إلى خلايا LCL ، والتكتلات المجهرية تصبح أكبر (الشكل 3C) بحيث كتل مرئية ظاهريا في القارورة. ق ق = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3321/3321fig1.jpg" /> الشكل 1. سير العمل لجيل والحفظ بالتبريد من خطوط الخلايا lymphoblastoid. هو طرد الدم المحيطي من خلال التدرج Ficoll. ويتعرض PBMC موجودة في معطف الشهباء من الانحدار الذي أنشئ لFK506 تليها إضافة EBV. تزرع EBV المعرضة للخلايا عند 37 درجة مئوية في وجود ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5 ٪ 2 لإقامة وتوسيع لاحقا LCL الحفظ بالتبريد. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3321/3321fig2.jpg" /> الشكل 2 : تحديد عدد السكان فرعية من الخلايا B من المتوقع أن يخضع الانتشار بعد التعرض لEBV. الامم المتحدة المصابة PBMC (A) أو المعرضين للPBMC EBV المستمدة من الخلايا HH514 - 16 (B) أو من B95 - 8 خلايا (C) في حضور FK506 كانت تحصد في اليوم 3. تم صبغ الخلايا مع ملون تألقي ، مترافق الأجسام المضادة الموجهة ضد CD23 ، CD19 ، CD58 و. بعد تبوب على الخلية الحيةق ، من الامم المتحدة وإصابة (أ) و EBV يتعرض - (B و C) CD19 + B تم فحص الخلايا للتعبير عن CD23 CD58 و. ولاحظ سكان فرعية من الخلايا باء معربا عن مستويات عالية من CD58 و CD23 (CD23 CD58 مرحبا +) ، إلا في الخلايا المعرضة للتحول المختصة EBV (المشتقة من الخلايا B95 - 8) ، وصفت. <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/3321/3321fig3.jpg" /> الشكل 3. التصور مجموعات الخلايا في الخلايا المصابة EBV. وعولج PBMC مع FK506 والمصابين EBV. الامم المتحدة المصابة (أ) و EBV يتعرض - (B) تم فحص خلايا أسبوع واحد بعد العدوى عن طريق الفحص المجهري النقيض المرحلة (تكبير 10X). ويظهر في خمسة أسابيع الخلية lymphoblastoid القديمة في خط جيم

<ol>
	<li>Thorley-Lawson, D. A., Gross, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+the+Epstein-Barr+virus+and+the+origins+of+associated+lymphomas.">Persistence of the Epstein-Barr virus and the origins of associated lymphomas.</a> N. Engl. J. Med. 350, 1328-1337 (2004).</li><li>Kubuschok, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+spontaneous+Epstein-Barr+virus+lymphoblastoid+cell+lines+genetically+modified+to+express+tumor+antigen+as+cancer+vaccines:+mutated+p21+ras+oncogene+in+pancreatic+carcinoma+as+a+model.">Use of spontaneous Epstein-Barr virus lymphoblastoid cell lines genetically modified to express tumor antigen as cancer vaccines: mutated p21 ras oncogene in pancreatic carcinoma as a model.</a> Hum. Gene Ther. 13, 815-827 (2002).</li><li>Kuppers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+under+influence:+transformation+of+B+cells+by+Epstein-Barr+virus.">B cells under influence: transformation of B cells by Epstein-Barr virus.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 801-812 (2003).</li><li>Traggiai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+to+make+human+monoclonal+antibodies+from+memory+B+cells:+potent+neutralization+of+SARS+coronavirus.">An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus.</a> Nat. Med. 10, 871-875 (2004).</li><li>Bernasconi, N., Traggiai, E., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+serological+memory+by+polyclonal+activation+of+human+memory+B+cells.">Maintenance of serological memory by polyclonal activation of human memory B cells.</a> Science. 298, 2199-2202 (2002).</li><li>Oh, H. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+the+rapid+establishment+of+Epstein-Barr+virus+immortalization+of+human+B+lymphocytes.">An efficient method for the rapid establishment of Epstein-Barr virus immortalization of human B lymphocytes.</a> Cell Prolif. 36, 191-197 (2003).</li><li>Ventura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+simple+method+for+the+Epstein-Barr+virus+transformation+of+lymphocytes+from+members+of+large+families+of+Reunion+Island.">Use of a simple method for the Epstein-Barr virus transformation of lymphocytes from members of large families of Reunion Island.</a> Hum. Hered. 38, 36-43 (1988).</li><li>Henderson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+transformation+of+lymphocytes+by+Epstein-Barr+virus.">Efficiency of transformation of lymphocytes by Epstein-Barr virus.</a> Virology. 76, 152-163 (1977).</li><li>Bird, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+Epstein-Barr+virus+activation+of+human+B+lymphocytes.">Characteristics of Epstein-Barr virus activation of human B lymphocytes.</a> J. Exp. Med. 154, 832-839 (1981).</li><li>Neitzel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+routine+method+for+the+establishment+of+permanent+growing+lymphoblastoid+cell+lines.">A routine method for the establishment of permanent growing lymphoblastoid cell lines.</a> Hum. Genet. 73, 320-326 (1986).</li><li>Pelloquin, F., Lamelin, J. P., Lenoir, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+B+lymphocytes+immortalization+by+Epstein-Barr+virus+in+the+presence+of+cyclosporin+A.">Human B lymphocytes immortalization by Epstein-Barr virus in the presence of cyclosporin A.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. 22, 689-694 (1986).</li><li>Pressman, S., Rotter, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epstein-Barr+virus+transformation+of+cryopreserved+lymphocytes:+prolonged+experience+with+technique.">Epstein-Barr virus transformation of cryopreserved lymphocytes: prolonged experience with technique.</a> Am. J. Hum. Genet. 49, 467-467 (1991).</li><li>Miller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epstein-Barr+virus:+Transformation,+cytopathic+changes,+and+viral+antigens+in+squirrel+monkey+and+marmoset+leukocytes.">Epstein-Barr virus: Transformation, cytopathic changes, and viral antigens in squirrel monkey and marmoset leukocytes.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. 69, 383-387 (1972).</li><li>Megyola, C., Ye, J., Bhaduri-McIntosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+sub-population+of+B+cells+that+proliferates+after+infection+with+Epstein-Barr+virus.">Identification of a sub-population of B cells that proliferates after infection with Epstein-Barr virus.</a> Virol. J. 8, 84-84 (2011).</li><li>Tosato, G., Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Epstein-Barr+virus+(EBV)-immortalized+B+cell+lines.">Generation of Epstein-Barr virus (EBV)-immortalized B cell lines.</a> Current Protocols of Immunology. Chapter 7, 22-22 (1991).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

الطريقة الموضحة في هذه الورقة يولد LCL من الدم الطرفية المانحة مع تخليد السريع والحفظ بالتبريد مرات. من خلال استخدام FK506 ، ومناعة الخلايا التائية ، والتتر عالية من الفيروسات المعدية ونحن قادرون على تعزيز انتشار الخلايا المصابة ب EBV من الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى. هذه التدخلات جعل الأسلوب هو موضح أكثر كفاءة ، مما أدى إلى التوسع السريع للخلايا لتجارب لاحقة. تقليديا ، وقد تم رصد تحول النمو من خلال التصور لمجموعات من الخلايا بواسطة المجهر الضوئي حوالي أسبوع بعد التعرض للEBV 6 و 15. ومع ذلك ، تجميع الخلايا ليس مؤشرا محددة تحول النمو EBV بوساطة. لقد أثبتنا سابقا تحديد ثابت من السكان الخلايا المتكاثرة عبر التدفق الخلوي 14 ، وتوفير وسيلة دقيقة ومحددة لتحديد نتائج ناجحة في وقت مبكر ثلاثة أيام الخلفإيه التعرض للخلايا B لEBV.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td> الأمفوتريسين B </td><td> فيشر Bioreagents </td><td> بي 928-250 </td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxide </td><td> سيغما </td><td> D 2650 </td></tr><tr><td> مصل بقري جنيني ، الحرارة المعطل </td><td> سيغما </td><td> F 4135 </td></tr><tr><td> Ficoll فصل الخلايا اللمفاوية وسائل الاعلام Hypaque </td><td> Mediatech </td><td> 25-072 </td></tr><tr><td> FK506 </td><td> AG العلمية </td><td> F 1030 </td></tr><tr><td> مفتش من المصل الماوس </td><td> سيغما </td><td> أنا 8765 </td></tr><tr><td> الماوس المضادة للCD23 الإنسان مترافق إلى PE </td><td> Pharmingen دينار بحريني </td><td> 555711 </td></tr><tr><td> الماوس isotype IgG1 مترافق إلى PE </td><td> Pharmingen دينار بحريني </td><td> 554680 </td></tr><tr><td> الماوس المضادة للCD58 الإنسان لمترافق FITC </td><td> بيرس الحرارية برأسيةientific </td><td> MA1 - 82159 </td></tr><tr><td> الماوس isotype IgG1 مترافق لFITC </td><td> Pharmingen دينار بحريني </td><td> 550616 </td></tr><tr><td> الماوس المضادة للCD19 الإنسان لمترافق PE - Cy5 </td><td> Pharmingen دينار بحريني </td><td> 555414 </td></tr><tr><td> الماوس isotype IgG1 مترافق لPE - Cy5 </td><td> داكو </td><td> X 0955 </td></tr><tr><td> البنسلين / الستربتوميسين </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> RPMI 1640 وسائل الإعلام </td><td> سيغما </td><td> R 8758 </td></tr><tr><td> Tetradecanoyl phorbol خلات (TPA) </td><td> Calbiochem </td><td> 407952 </td></tr><tr><td> FACS العازلة (1X الفوسفات التخزين المؤقت مالحة + 5 ٪ مصل بقري جنيني) </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

establishment of epstein-barr virus growth-transformed lymphoblastoid cell lines

إصابة الخلايا B مع فيروس ابشتاين بار (EBV) يؤدي إلى تخليد الانتشار واللاحقة ، مما أدى إلى إنشاء خطوط الخلايا lymphoblastoid (LCL) في المختبر. منذ مصابون خفية LCL مع EBV ، لأنها توفر نظام نموذجي للتحقيق EBV كمون الفيروس وباء خلية يحركها الانتشار وتكون الأورام 1. وقد استخدمت LCL تقديم المستضدات في مجموعة متنوعة من المقايسات المناعية 2 ، 3. بالإضافة ، يمكن استخدامها لتوليد LCL الاجسام المضادة البشرية 4 ، 5 وتوفر مصدرا غير محدود من المحتمل عندما يقتصر الوصول إلى المواد الأولية البيولوجية 6 ، 7. وقد وصفت مجموعة متنوعة من الأساليب لتوليد LCL. وشملت الأساليب في وقت سابق ان استخدام مثل mitogens راصة دموية نباتية ، lipopolysaccharide 8 و 9 الفتلاق mitogen لزيادة كفاءة EBV بوساطة تخليد. في الآونة الأخيرة ، استخدمت الآخرين immunosupprوكلاء essive مثل السيكلوسبورين A لتثبيط الخلايا T بوساطة قتل الخلايا المصابة ب 7 ، 10-12. طول كبيرا من الوقت من EBV العدوى إلى إنشاء خطوط الخلايا محركات شرط لطرق أسرع وأكثر موثوقية للEBV يحركها نمو الخلية B التحول. باستخدام مزيج من عيار EBV عالية وكيلا للمناعة ، ونحن قادرون على نقل العدوى باستمرار ، وتحويل ، وتوليد LCL من خلايا B في الدم المحيطي. يستخدم هذا الأسلوب يمكن البرهنة على كمية صغيرة من الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى ان عدد المصابين بهذا المرض في المختبر مجموعات من الخلايا. وجود CD23 مع EBV في حضور FK506 ، ومناعة الخلايا التائية. تقليديا ، يتم رصد نمو الخلايا المتكاثرة التي كتبها B تصور مجموعات من الخلايا المجهرية حوالي أسبوع بعد الإصابة بفيروس EBV. ويمكن رؤية كتل من LCL بالعين المجردة بعد عدة أسابيع. نحن تصف مقايسة لتحديد مبكرة اذا EBV بوساطة زالتحول rowth ناجحة حتى قبل أن يمكن البرهنة مجموعات من الخلايا المجهرية. وجود CD23 CD58 + مرحبا الخلايا كما لوحظ في أقرب وقت بعد ثلاثة أيام من العدوى تشير إلى نتائج ناجحة.

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines at JoVE.com

Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines

نحن تصف طريقة لتحويل خطوط الخلايا المولدة باستخدام باء فيروس ابشتاين بار. نوضح أيضا فحص الرواية التي يمكن أن تحدد الخلايا B المتجهة إلى الخضوع لتحول في أقرب وقت بعد ثلاثة أيام من العدوى.

إنشاء فيروس ابشتاين بار النمو وتحولت خطوط الخليوي Lymphoblastoid

Infection of B cells with Epstein-Barr virus (EBV) leads to proliferation and subsequent immortalization, resulting in establishment of lymphoblastoid ...

establishment-epstein-barr-virus-growth-transformed-lymphoblastoid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

39.9K Views.  State University of New York at Stony Brook. نحن تصف طريقة لتحويل خطوط الخلايا المولدة باستخدام باء فيروس ابشتاين بار. نوضح أيضا فحص الرواية التي يمكن أن تحدد الخلايا B المتجهة إلى الخضوع لتحول في أقرب وقت بعد ثلاثة أيام من العدوى.

Video: Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified mice, such as Atm-/- and p53-/- consistently develop thymic lymphoma early in life 1,2, and thus, can serve as a reliable source for derivation of murine T-cell lines. Here we present a detailed protocol for the development of established murine thymic lymphoma T-cell lines without the need to add interleukins as described in previous protocols 1,3. Tumors were harvested from mice aged three to six months, at the earliest indication of visible tumors based on the observation of hunched posture, labored breathing, poor grooming and wasting in a susceptible strain 1,4. We have successfully established several T-cell lines using this protocol and inbred strains ofAtm-/- [FVB/N-Atmtm1Led/J] 2 and p53-/- [129/S6-Trp53tm1Tyj/J] 5 mice. We further demonstrate that more than 90% of the established T-cell population expresses CD3, CD4 and CD8. Consistent with stably established cell lines, the T-cells generated by using the present protocol have been passaged for over a year.

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

In this video we demonstrate a protocol to establish mouse thymic lymphoma cell lines. By following this protocol, we have successfully established several T-cell lines from Atm-/- and p53-/- mice with thymic lymphoma.

اشتقاق خطوط التوتة تي خلية سرطان الغدد الليمفاوية من أجهزة الصراف الآلي -- / --</sup و البروتين p53 -- / --</sup الفئران

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

توسيع الخلايا اللمفاوية T السامة للخلايا من دم الحبل السري أن الفيروس المضخم للخلايا الهدف، فيروس ابشتاين بار، واتش

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Advances in live cell fluorescence microscopy techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that express fluorescent fusion proteins have enabled real-time visualization of transport and spread of alphaherpes virus infection of neurons. The utility of novel fluorescent fusion proteins to viral membrane, tegument, and capsids, in conjunction with live cell imaging, identified viral particle assemblies undergoing transport within axons. Similar tools have been successfully employed for analyses of cell-cell spread of viral particles to quantify the number and diversity of virions transmitted between cells. Importantly, the techniques of live cell imaging of anterograde transport and spread produce a wealth of information including particle transport velocities, distributions of particles, and temporal analyses of protein localization. Alongside classical viral genetic techniques, these methodologies have provided critical insights into important mechanistic questions. In this article we describe in detail the imaging methods that were developed to answer basic questions of alphaherpes virus transport and spread.

Live cell imaging of alphaherpes virus infections enables analysis of the dynamic events of directed transport and intercellular spread. Here, we present methodologies that utilize recombinant viral strains expressing fluorescent fusion proteins to facilitate visualization of viral assemblies during infection of primary neurons.

تصوير الخلايا الحية من الهربسي الألفائي الفيروسات النقل تقدمي وانتشارها

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

عزل وتحليل العدلة لتحديد ما دورها في الغدد اللمفاوية حساسية الخلية وكلاء العلاجية

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

تقييم فعالية وسمية الرنا استهداف HIV-1 الإنتاج للاستخدام في الجينات أو العلاج بالعقاقير

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new method with a powerful and simple strategy for the establishment of B-LCLs, the red blood cell lysis method. This method simplified the PBMC separation procedure with red blood cell removal, and used as little as 0.5 mL of whole blood for establishing EBV-immortalized cell lines, which can proliferate to large cell numbers in a relatively short amount time with a 100% success rate. The method is simple, reliable, time saving, and applicable to treating a large number of the clinical samples.

A simple red blood cell lysis method for establishing B-LCLs was developed with high immortalization efficiency, requiring a small amount of blood and saving time from initiation to cryopreservation.

وبسيط خلية الدم الحمراء تحلل طريقة لإنشاء خطوط الخلايا B Lymphoblastoid

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed feeder cells, purified NK or T cells with as much as 10 mL of blood, or a high-dose of IL-2. This study presents a new method with a powerful and simple strategy to establish NK and T cell lines by culturing the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) with the addition of recombinant human IL-2 (rhIL-2), and uses as little as 2 mL of whole blood. The cells can proliferate quickly in two weeks and be maintained for more than 3 months. With this method, 7 NK or T cell lines have been established with a high success rate. This method is simple, reliable, and applicable to establishing cell lines from more cases of CAEBV or NK/T cell lymphoma.

A simple method for obtaining NK and T cell clones from CAEBV patients was developed with high efficiency, a small amount of peripheral blood, and a low-dose of IL-2.

طريقة فعالة وبسيطة وضع ناغورني كاراباخ وخطوط الخلايا T من المرضى المصابين بالعدوى المزمنة النشطة فيروس ابشتاين-بار

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying gene expression related to biological processes of interest. These innovations not only allow researchers to observe expression from the mRNA sequences that code for genes that effect cellular function, but also the non-coding RNA (ncRNA) molecules that remain untranslated, but still have regulatory functions. Although researchers have the ability to observe both mRNA and ncRNA expression, it has been customary for a study to focus on one or the other. However, when studies are interested in both mRNA and ncRNA expression, many times they use separate samples to examine either coding or non-coding RNAs due to the difference in library preparations. This can lead to the need for more samples which can increase time, consumables, and animal stress. Additionally, it may cause researchers to decide to prepare samples for only one analysis, usually the mRNA, limiting the number of biological questions that can be investigated. However, ncRNAs span multiple classes with regulatory roles that effect mRNA expression. Because ncRNA are important to fundamental biologic processes and disorder of these processes in during infection, they may, therefore, make attractive targets for therapeutics. This manuscript demonstrates a modified protocol for the generation mRNA and non-coding RNA expression libraries, including viral RNA, from a single sample of whole blood. Optimization of this protocol, improved RNA purity, increased ligation for recovery of methylated RNAs, and omitted&#160;size selection, to allow capture of more RNA species.

Here, we present a protocol optimized for the processing of coding (mRNA) and non-coding&#160;(ncRNA) globin reduced RNA-seq libraries from a single whole blood sample.

وأعرب عن تحديد الترميز وفئات الحمض النووي الريبي غير الترميز في الخنازير الدم كله

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our knowledge of prevention and treatment of viral infection. The fruit fly Drosophila melanogaster has proven to be one of the most efficient and productive model organisms to screen for antiviral factors and investigate virus-host interaction, due to powerful genetic tools and highly conserved innate immune signaling pathways. The procedure described here demonstrates a nano-injection method to establish viral infection and induce systemic antiviral responses in adult flies. The precise control of the viral injection dose in this method enables high experimental reproducibility. Protocols described in this study include the preparation of flies and the virus, the injection method, survival rate analysis, the virus load measurement, and an antiviral pathway assessment. The influence effects of viral infection by the flies' background were mentioned here. This infection method is easy to perform and quantitatively repeatable; it can be applied to screen for host/viral factors involved in virus-host interaction and to dissect the crosstalk between innate immune signaling and other biological pathways in response to viral infection.

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

This protocol describes how to establish viral infection in vivo in Drosophila melanogaster using the nano-injection method and basic techniques to analyze virus-host interaction.

إنشاء العدوى الفيروسية، وتحليل التفاعل المضيف للفيروسات في Melanogaster المورفولوجية

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

في اختبار فيترو ELISA لتقييم قوة لقاح داء الكلب

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...