ستمكن هذه الطريقة من توصيف الخلايا المناعية المختلفة في نفس حالات المرض للأفراد المصابين بالحقن العضلي ، مما سيوسع فهمنا لآلية عدوى EBV. سيوضح الإجراء Linlin Zhang ، وهو طبيب من مختبرنا. للبدء ، خذ PBMCs المعزولة مسبقا في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر ، وقم بتدويره عند 300 جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا ب 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت المحضر. بعد ذلك ، أضف 20 ميكرولترا من ميكروبيدات CD 14 إلى تعليق الخلية ، واخلطها جيدا عن طريق السحب ، واحتضان الأنبوب لمدة 15 دقيقة على الجليد. ثم اغسل PBMCs باستخدام ملليلتر واحد من المخزن المؤقت وأجهزة الطرد المركزي عند 300 غرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
تخلص من المادة الطافية بالكامل ، وأعد تعليق الخلايا ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت. للفصل المغناطيسي ، ضع عمودا على فاصل الخرزة المغناطيسية ، وقم بتجهيز العمود عن طريق غسله بثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت. بعد ذلك ، أضف تعليق الخلية إلى العمود.
اسمح لها بالمرور ، واجمع الخلايا غير المصنفة في أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر. اغسل العمود ثلاث مرات بثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت ، واجمع النفايات السائلة بالكامل في أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر. الآن ، ضع العمود في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 ملليلتر ، وأضف خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت إلى العمود.
ادفع المكبس بإحكام في العمود لطرد الخلايا المصنفة مغناطيسيا في الأنبوب. جهاز طرد مركزي للخلايا المسماة مغناطيسيا عند 300 جم لمدة خمس دقائق. بعد إزالة المادة الطافية ، أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من PBS ، وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر لتسلسل النسخ اللاحق.
قم بتكوير الخلايا غير المصنفة التي تم جمعها عن طريق الطرد المركزي عند 300 جم لمدة خمس دقائق ، وأعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من PBS في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر. بعد ذلك ، أضف ميكرولترين من كل جسم مضاد مسمى إلى معلق الخلية ، واحتضانه على الجليد لمدة 30 دقيقة ، محميا من الضوء. بعد ذلك ، قم بتقسيم 100 ميكرولتر من تعليق خلية PBMC في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 ملليلتر لإعداد عينة تحكم سلبية CD 3 و CD 4 و CD 8 و CD 19 ، وعينات تلطيخ مفردة ، وعينة تلطيخ CD 56 أو CD 16.
ثم أضف ميكرولترين من الجسم المضاد المقابل المسمى بالفلورسنت إلى كل أنبوب ، واحتضانه على الجليد لمدة 30 دقيقة ، محميا من الضوء. بعد الحضانة ، اغسل جميع الخلايا باستخدام PBS كما هو موضح سابقا ، وأعد تعليقها في 500 ميكرولتر من PBS. افتح نظام فرز الخلايا ، وقم بتشغيل برنامج التشغيل.
بعد ذلك ، قم بتثبيت فوهة 85 ميكرومتر ، وافتح تيار الفرز. اضبط جهد الفرز على 4،500 فولت ، والتردد على 47. قم بإعداد الفجوة إلى 8 في نافذة الفاصل ، وقم بتشغيل وضع الفرز التلقائي للبقعة الحلوة لتحديد قيمة سعة القطرة تلقائيا.
أخيرا ، اضبط تأخير القطرة على 30.31 في نافذة البث الجانبي. باستخدام مخطط نقطة تشتت أمامي مقابل جانبي ، ارسم بوابة المضلع P1 لتحديد مجموعة الخلايا الليمفاوية السليمة. بعد ذلك ، باستخدام منطقة التشتت الأمامية مقابل مخطط نقطة الارتفاع ، ارسم بوابة المضلع P2 لتحديد الخلايا المفردة ، واستبعد المزدوجات.
ثم باستخدام منطقة CD 19 FITC مقابل CD 3 لكل مخطط نقطي لمنطقة CPCY 5.5 ، ارسم البوابة المستطيلة P3 لتحديد خلايا T الموجبة CD 3 ، والخلايا البائية الإيجابية CD 19. بعد ذلك ، باستخدام مخطط نقطي لمنطقة CD 4 APCCY 7 مقابل مخطط نقطي لمنطقة CD 8 PE ، ارسم بوابة مستطيلة لتحديد CD 4 ، وخلايا T إيجابية CD 8. أخيرا ، باستخدام منطقة تشتت جانبية مقابل مخطط نقطي لمنطقة CD 56 أو CD 16 APC ، ارسم بوابة مستطيلة لتحديد CD 56 أو CD 16 الخلايا القاتلة الطبيعية الإيجابية.
بالنسبة لأنبوب التحكم السلبي ، انقر فوق تحميل في لوحة معلومات الاستحواذ ، وحدد إعدادات مقياس الخلايا في البرنامج. في نافذة المفتش ، انقر فوق علامة التبويب المعلمات ، واضبط الفولتية للتشتت الأمامي ، والتشتت الجانبي ، وأصباغ الفلورسنت المختلفة. بعد تحميل الأنابيب الملطخة المفردة في مقياس الخلوي ، انقر فوق تحميل في لوحة معلومات الاستحواذ ، ثم انقر فوق علامة تبويب التعويض لضبط التعويض ، كما هو موضح في النص.
دوامة تعليق الخلية بلطف ، قبل تحميل الأنبوب في مقياس الخلايا. أضف 200 ميكرولتر من FBS إلى أربعة أنابيب تدفق تجميع ، وقم بتدوير الأنابيب. ضعها في غرفة جمع مقياس الخلايا.
اجمع الأنواع المختلفة من الخلايا بشكل منفصل في أنابيب التدفق الأربعة. قم بتدوير الخلايا المنفصلة بمعدل 300 جم لمدة خمس دقائق ، وأضف 200 ميكرولتر من كاشف عزل الحمض النووي الريبي إلى لوحة الخلايا لتسلسل النسخ. في الدراسة الحالية ، تم فرز مجموعات الخلايا المناعية الفرعية من الدم المحيطي لعينات مختلفة بكفاءة من خلال الجمع بين تقنيات الخرز المغناطيسي المناعي ، وفرز الخلايا المنشطة بالفلورة.
الأهم من ذلك في هذا البروتوكول ، تم تحسين خطوة فرز الخلايا لتحسين صلاحية الخلية. أظهرت الخلايا المناعية المصنفة نسبة متزايدة من الخلايا التائية الإيجابية CD 3 و CD 8 في المرضى الذين يعانون من عدد كريات الدم البيضاء المعدية مقارنة بكل من حاملي فيروس Epstein-Barr الأصحاء والعينات غير المصابة. في المقابل ، لوحظ انخفاض نسب الخلايا التائية الإيجابية CD 3 و CD 4 والخلايا البائية الإيجابية CD 19 في المرضى الذين يعانون من عدد كريات الدم البيضاء المعدية مقارنة بحاملي EBV الأصحاء والأطفال غير المصابين بفيروس EBV.
بالإضافة إلى ذلك ، لوحظ انخفاض نسب CD 56 ، أو CD 16 الخلايا القاتلة الطبيعية الإيجابية في المرضى الذين يعانون من عدد كريات الدم البيضاء المعدية مقارنة مع الأطفال غير المصابين EBV. الحفاظ على بقاء الخلية أمر حيوي للتجربة اللاحقة. يعد الاحتفاظ بالخلايا على الجليد أو في الثلاجة أثناء عملية الفرز مفيدا لبقاء الخلية.
