我们要感谢S.塔内加- Bageshwar，K. Beifuss，S. Kedroske，和HC。萧为有益的讨论。这项工作是由从分子和细胞医学TAMHSC系的启动资金。该化合物的范围和旋转盘购部门和TAMHSC院长办公室提供的资金。一些菌株提供了线虫遗传学中心，这是由国家研究资源中心资助。 pRF4（ROL - 6（su1006））答：消防的礼物。

1。 DII制备染色<ol><li>准备的20毫克/毫升DII（Biotium公司，公司，海沃德，CA）在DMF原液。 DII是光敏感，所以保护光箔包装DII。 </li><li>每个人口0.6μLDII股票加入到399.4微升M9的创建工作的DII稀释。这应该给最后的30微克/毫升DII在M9的工作液。这可以扩展多个种群同时染色。盾DII在铝箔包装管（S）。 </li></ol> 2。线虫的制备<ol><li>包含一个未被污染的线虫人口使用60毫米的钢板。洗轻轻摇动整个板面的液体的圆周运动，放松所有的幼虫和成年动物，动物板，解决了0.5％的Triton X - 100的使用M9的缓冲区。转移到无菌1.5毫升管洗。 </li><li>立即降速在2000转每分钟30秒的动物。取下并丢弃很多SUPernatant尽可能在试管底部，而不会干扰动物的质量。 </li><li>为了减少残留的TRITON X - 100，冲洗动物使用M9的缓冲区，旋转，去除上清液。重复此步骤一次。 </li><li>管和涡简要加入400μL的工作DII M9的解决方案，以重悬在溶液中的动物。 </li><li>摇管在20 ° C水平为3个小时在350 RPM轻保护环境。如果需要的话，动物可以被孵育染色16小时。 </li><li>为了减少未结合的染料量，自旋向下的动物，在2000转，持续20秒。删除尽可能上清液丢弃，而不会干扰动物的质量。 </li><li>在400μLM9的缓冲区，并倒到无细菌的接种与OP50 E.一个NGM琼脂板部分液体悬浮动物大肠杆菌 。让动物恢复至少30分钟。在恢复时间的动物应该爬远离DII染色液体到食品。这一步免费直接投资收益减少背景荧光。 </li></ol> 3。安装和观察标本<ol><li>使用高压灭菌器或微波熔体4％水琼脂。 </li><li>创建可重复使用的垫片，可用于确保琼脂板厚度均匀，分层两件实验室磁带载玻片上。共两个间隔的​​幻灯片。 </li><li>两个间隔幻灯片之间安排一个洁净的载玻片。移液器熔化的4％到洁净的载玻片中心琼脂约150μL（四滴）。迅速覆盖使用一个额外的幻灯片的形式琼脂垫熔化的琼脂。小心地取下封面幻灯片，安装幻灯片的顶部为中心的垫。 </li><li>移液器约5μL线虫麻醉（100微米 - 1毫米左旋咪唑，例如，）上垫。 </li><li>山8 - 12只动物在麻醉剂，并与显微镜的盖玻片覆盖。 </li><li>使用装有至少40倍objecti的化合物或共聚焦显微镜观察动物<html> VE和一个DsRed的/ TRITC（或其他兼容）过滤器。激发最大的投资收益为549纳米，其最大发射约束染料（Biotium公司，公司，海沃德，CA）是565纳米。 </li></ol> 4。代表性的成果 DII污渍角质层的野生型和突变株C.线虫 。表皮表面含有环空中圆周沟分开，并在某些阶段，纵脊alae。每个发展阶段有2个不同成分的表皮结构。 alae和环空中的山脊或沟荧光染色，取决于表面成分，整个幼虫和成年阶段，仍然可见使用这种方法恢复后的一天。有时观察到的背景荧光斑点（图2F，G）的，但不是常规（图1，图2A - E，H，我）。所有图像旋转盘共聚焦或时指出，广角（WF）复合显微镜。 耳鼻喉科“&gt; <img alt="图1" src="/files/ftp_upload/3362/3362fig1.jpg" /> 图1。 DII污渍角质层和环境接触的神经元。 L2阶段的动物。 630x放大倍率。马赛克图像部分使用iVision - Mac软件（BioVision的技术，位于宾夕法尼亚州Exton）被抓获。使用Adobe Photoshop CS3（Adobe系统公司，加利福尼亚州圣何塞）加入图像。比例尺= 10微米。 DII还荧光污渍amphid phasmid感觉神经元的头部和尾部分别为（箭头标记一些）。 <img alt="图2" src="/files/ftp_upload/3362/3362fig2.jpg" /> 图2。 DII C.荧光污渍线虫角质层后胚胎发育的各个阶段 。 630x放大倍率。比例尺= 10微米。野生型动物染色）L1，B）二级C）的dauer，D）三级，E）L4;和F）成人阶段。在L1和的dauer动物alae和环形脊荧光染色（A，C）。 DII污渍二级动物的环形脊（二）。环形沟L3和L4动物（D，E）染色。在alae沟和环空中成年动物（FH）的染色。 Alae是由二，五，或三个脊（L1，的dauer，或成年动物，分别）运行长度的动物（箭头）16。环空中创建圆周周围的动物脊（箭头，F和J）。角质层成人突变动物显示温和的表皮组织缺损（GH）。 G）alae的脊不连续（WF）。高）编外alae脊融合和分支或分叉（WF）。胶原蛋白基因的突变体表现alae和环形组织缺损（IJ）。 i）在过表达转基因动物pRF4（ROL - 6（su1006）），alae谎言脊动物的长度角度。 J）在转基因动物的过度表达pRF4（ROL - 6（su1006））环空中显示一个不规则的图案。 <img alt="图3" src="/files/ftp_upload/3362/3362fig3.jpg" /> 图3。为extern人的形态结构，照亮了DII染色。630x放大倍率。比例尺= 10微米。 DII还突出等外观特征，包括一）成人雌雄同体外阴，B）的成年雄性的尾巴射线和风扇和C）雌雄同体的尾穗（在这种突变的背景分叉）。 <img alt="图4" src="/files/ftp_upload/3362/3362fig4.jpg" /> 图4。角质层需要更长的时间比环境接触的神经元与DII染色。 630x放大倍率。比例尺= 10微米。经过两个小时的染色，amphid（未显示）和phasmid感觉神经元（箭头）有足够的染色。相比之下，年轻动物的角质层只是部分补丁（箭头）染色。 <table border="1"><tbody><tr><td> 洗 </td><td> 染色解决方案（DII） </td><td> 孵育时间 </td><td> 角质层染色 </td></tr><tr><td> M9的± 0.5％TRiton X - 100 </td><td> M9 + 0.5％的Triton X - 100 </td><td> 2小时</td><td>没有</td></tr><tr><td> M9 + 0.5％的Triton X - 100 </td><td> M9 + 0.5％的Triton X - 100 </td><td> 3小时</td><td>没有</td></tr><tr><td> M9 + 0.5％的Triton X - 100 </td><td> M9 </td><td> 2小时</td><td>部分</td></tr><tr><td> M9 + 0.5％的Triton X - 100 </td><td> M9 </td><td> 3小时</td><td>是</td></tr><tr><td> M9 + 0.5％的Triton X - 100 </td><td> H 2 O </td><td> 2小时</td><td>部分</td></tr><tr><td> M9 + 0.5％的Triton X - 100 </td><td> H 2 O </td><td> 3小时</td><td>是</td></tr></tbody></table> 表1。表皮染色，在不同的条件下，各种孵化的解决方案和时间进行了测试，以优化在动物表皮染色。 H 2 O，无菌蒸馏水。部分染色表明幼虫角质层片状染色（图4），虽然成人角质层污渍的彗星onsistently。

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	<li>Cox, G. N., Kusch, M., Edgar, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cuticle+of+Caenorhabditis+elegans:+its+isolation+and+partial+characterization.">Cuticle of Caenorhabditis elegans: its isolation and partial characterization.</a> The Journal of Cell Biology. 90, 7-17 (1981).</li><li>Cox, G. N., Staprans, S., Edgar, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cuticle+of+Caenorhabditis+elegans.+II.+Stage-specific+changes+in+ultrastructure+and+protein+composition+during+postembryonic+development.">The cuticle of Caenorhabditis elegans. II. Stage-specific changes in ultrastructure and protein composition during postembryonic development.</a> Dev. Biol. 86, 456-470 (1981).</li><li>Hall, D., Altun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C. elegans Atlas. , (2008).</li><li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cuticle.">The cuticle.</a> The C. elegans Research Community. , (2007).</li><li>Kramer, J. M., Johnson, J. J., Edgar, R. S., Basch, C., Roberts, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sqt-1+gene+of+C.+elegans+encodes+a+collagen+critical+for+organismal+morphogenesis.">The sqt-1 gene of C. elegans encodes a collagen critical for organismal morphogenesis.</a> Cell. 55, 555-565 (1988).</li><li>Mende, N. v. o. n., Bird, D. M., Albert, P. S., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dpy-13:+a+nematode+collagen+gene+that+affects+body+shape.">dpy-13: a nematode collagen gene that affects body shape.</a> Cell. 55, 567-576 (1988).</li><li>Blaxter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cuticle+surface+proteins+of+wild+type+and+mutant+Caenorhabditis+elegans.">Cuticle surface proteins of wild type and mutant Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Biological Chemistry. 268, 6600-6609 (1993).</li><li>Costa, M., Draper, B. W., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+actin+filaments+in+patterning+the+Caenorhabditis+elegans+cuticle.">The role of actin filaments in patterning the Caenorhabditis elegans cuticle.</a> Dev. Biol. 184, 373-384 (1997).</li><li>Sapio, M. R., Hilliard, M. A., Cermola, M., Favre, R., Bazzicalupo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zona+Pellucida+domain+containing+proteins,+CUT-1,+CUT-3+and+CUT-5,+play+essential+roles+in+the+development+of+the+larval+alae+in+Caenorhabditis+elegans.">The Zona Pellucida domain containing proteins, CUT-1, CUT-3 and CUT-5, play essential roles in the development of the larval alae in Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol.. 282, 231-245 (2005).</li><li>Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cuticle+collagen+genes.+Expression+in+Caenorhabditis+elegans.">Cuticle collagen genes. Expression in Caenorhabditis elegans.</a> Trends Genet. 16, 21-27 (2000).</li><li>Kramer, J. M., French, R. P., Park, E. C., Johnson, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+rol-6+gene,+which+interacts+with+the+sqt-1+collagen+gene+to+determine+organismal+morphology,+encodes+a+collagen.">The Caenorhabditis elegans rol-6 gene, which interacts with the sqt-1 collagen gene to determine organismal morphology, encodes a collagen.</a> Mol. Cell Biol. 10, 2081-2089 (1990).</li><li>Thein, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+exoskeleton+collagen+COL-19:+an+adult-specific+marker+for+collagen+modification+and+assembly,+and+the+analysis+of+organismal+morphology.">Caenorhabditis elegans exoskeleton collagen COL-19: an adult-specific marker for collagen modification and assembly, and the analysis of organismal morphology.</a> Dev. Dyn. 226, 523-539 (2003).</li><li>McMahon, L., Muriel, J. M., Roberts, B., Quinn, M., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+sets+of+interacting+collagens+form+functionally+distinct+substructures+within+a+Caenorhabditis+elegans+extracellular+matrix.">Two sets of interacting collagens form functionally distinct substructures within a Caenorhabditis elegans extracellular matrix.</a> Molecular Biology of the Cell. 14, 1366-1378 (2003).</li><li>Link, C. D., Ehrenfels, C. W., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+expression+of+male+copulatory+bursa+surface+markers+in+Caenorhabditis+elegans.">Mutant expression of male copulatory bursa surface markers in Caenorhabditis elegans.</a> Development. 103, 485-495 (1988).</li><li>Tong, Y. G., Burglin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditions+for+dye-filling+of+sensory+neurons+in+Caenorhabditis+elegans.">Conditions for dye-filling of sensory neurons in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurosci. Methods. 188, 58-61 (2010).</li><li>Singh, R. N., Sulston, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+observations+on+moulting+in+Caenorhabditis+elegans.">Some observations on moulting in Caenorhabditis elegans.</a> Nematologica. 24, 63-71 (1978).</li><li>Collet, J., Spike, C. A., Lundquist, E. A., Shaw, J. E., Herman, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+osm-6,+a+gene+that+affects+sensory+cilium+structure+and+sensory+neuron+function+in+Caenorhabditis+elegans.">Analysis of osm-6, a gene that affects sensory cilium structure and sensory neuron function in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 148, 187-200 (1998).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li></ol>

我们什么都没有透露。

这里介绍DII的染色方法，允许一个相对快速和方便的方法来可视化的角质层线虫。再利用和优化常用的图像环境暴露15,17感觉神经元的方法，直接投资收益可用于荧光染色alae和环状结构（图1和2），以及外阴，男性的尾巴，和雌雄同体的尾穗（图3）。我们发现，洗液和时间的影响的直接投资收益的能力，始终染色的角质层（表1，图4）。 DII染色环境暴露的神经元的方法使用两个小?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 试剂 </td><td> 同义词 </td><td> 公司 </td><td> 目录编号 </td><td> 评论 </td></tr><tr><td> DII </td><td> 1,1&#39; - 双十八烷基- 3，3,3&#39;，3&#39; - tetramethylindocarbocyanine高氯酸盐</td><td> Biotium公司，公司</td><td> 60010 </td><td>股票稀释： 20 mg / ml的二甲基甲酰胺 工作液：30毫克/毫升</td></tr><tr><td>二甲基甲酰胺</td><td>二甲基甲酰胺</td><td> Sigma - Aldrich公司，公司</td><td> D4551 </td><td></td></tr><tr><td>海卫一 X - 100 </td><td> Octylphenoxypolyethoxyethanol </td><td>厂商VWR International，LLC。 </td><td> EM - 9410 </td><td></td></tr><tr><td> M9 </td><td> 22MM KH 2 PO 4，4200万娜2 HPO 4，86mm的氯化钠，硫酸镁1MM 4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NGM &lt;/ TD&gt; <td>线虫的生长介质</td><td> IPM的科学，公司</td><td> 11006-501 </td><td>可以准备以下NGM琼脂协议18 </td></tr><tr><td>琼脂</td><td></td><td>电解二氧化锰化工公司</td><td> 1.01614 </td><td> 4％水</td></tr><tr><td>左旋咪唑</td><td>盐酸左旋咪唑</td><td> Sigma - Aldrich公司，公司</td><td> 31742 </td><td> 100微米 - 1毫米所需的左旋咪唑</td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td></td><td>厂商VWR International，LLC。 </td><td> 16005-106 </td><td></td></tr><tr><td>显微镜盖玻片</td><td></td><td>厂商VWR International，LLC。 </td><td> 16004-302 </td><td></td></tr><tr><td>复方范围</td><td></td><td>卡尔蔡司公司</td><td> A1m </td><td>利用的目标，以满足实验的需要</td></tr><tr><td> TRITC或其他兼容滤波器</td><td> ＆NBSP; </td><td>色度科技股份有限公司</td><td> 49005 </td><td> （ET - DsRed的TRITC/Cy3）溅射过滤器设置</td></tr></tbody></table>

visualization of caenorhabditis elegans cuticular structures using the lipophilic vital dye dii

角质层的C.线虫是一种高度耐药的结构，周围的动物 1-4外部。角质层不仅可以保护环境的动物，但也决定体形和蠕动4-6次的作用。由表皮细胞分泌的几层组成的角质层，包括最外层的脂质层7。 在角质层的圆周脊称为环空中的模式动物的长度， 目前在8发展的所有阶段。 Alae有纵脊目前是在特定的发展阶段，包括L1的dauer，和成人阶段2,9。影响表皮胶原组织的基因突变可以改变表皮结构和动物的身体形态 5,6,10,11 。虽然使用DIC的光学显微镜复合表皮成像是可行的，目前的方法，突出表皮结构包括荧光12％的转基因表达，抗体染色，电子显微镜1。也被用来标记麦胚凝集素（WGA）的可视化表皮糖蛋白，但受限于解决更精细的表皮结构 14 。使用荧光染料染色表皮表面已被观察到，但从来没有在细节 15的特点。我们提出了一个方法来可视化角质层在现场 C. 线虫使用红色荧光亲脂性染料DII（1,1&#39; -双十八烷基- 3，3,3&#39;，3&#39; - tetramethylindocarbocyanine高氯酸盐），也就是通常用于在 C 线虫可视化环境接触的神经元。这是一个简单可靠的方法，高分辨率的荧光可视化的环空中，alae，外阴，男性的尾巴， 在 C和雌雄同体的尾穗DII染色的优化协议线虫 。

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Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

我们提出了一个可视化生活角质层的方法<em&gt; C。线虫</em&gt;使用红色荧光亲脂性染料DII（1,1&#39; - 双十八烷基- 3，3,3&#39;，3&#39; - tetramethylindocarbocyanine高氯酸盐），这是常用的<em&gt; C。线虫</em&gt;可视化环境接触的神经元。这种优化的协议，alae和环形表皮结构是由DII染色和使用复合显微镜观察。

可视化线虫角质层结构的亲脂性的重要染料，直接投资收益

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

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Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

17.0K 次观看.  Texas A&M University System Health Science Center, College of Medicine. 我们提出了一个可视化生活角质层的方法 C。线虫使用红色荧光亲脂性染料DII（1,1' - 双十八烷基- 3，3,3'，3' - tetramethylindocarbocyanine高氯酸盐），这是常用的 C。线虫可视化环境接触的神经元。这种优化的协议，alae和环形表皮结构是由DII染色和使用复合显微镜观察。