إن القدرة على قياس التغيرات في مورفولوجيا الأنسجة والعضيات مهمة لفهم وظيفة الجينات وكذلك تأثير الطفرات الوراثية. بروتوكولاتنا شرح كيف يمكن استخدام البرمجيات المتاحة بحرية لتقييم غير ذاتي من مورفولوجيا نقاط الاشتباك العصبي والعضلات والميتوكوندريا في الخيطية، C.elegans. وقد اعتمدت العديد من الدراسات السابقة على أساليب نوعية لمقارنة التغيرات المورفولوجية.
ومع ذلك ، يمكن أن تكون هذه إشكالية لأنها قد لا تلتقط الاختلافات الظاهرية خفية ، قد أكثر من والتقليل من شأن التغييرات ، ويتم تقييمها ذاتيا. توفر أساليبنا الكمية وسائل أكثر قوة وأقل تحيزًا لتقييم التغيرات المورفولوجية. ويمكن استخدام هذه الطرق بسهولة لدراسة التغيرات المورفولوجية في الهياكل الخلوية الأخرى أو الكائنات العضوية النموذجية من أجل تحديد وظيفة الجينات وعواقب الطفرات المرتبطة بالأمراض.
ابدأ بإعداد الشرائح للتصوير. ضع قطرة من agarose الذائبة على شريحة المجهر واضغط على الفور أسفل القطرة مع شريحة مجهر أخرى ، وسوت بلطف agarose. ترك agarose لتجف لمدة دقيقة واحدة ثم فصل بعناية اثنين من الشرائح وترك لوحة صلبة على واحدة من الشرائح.
ضع الشريحة على مرحلة المجهر وأضف قطرة مخدر من خمسة إلى 10 ملليلتر إلى مركز لوحة agarose. استخدام اختيار معقمة الحرارة لنقل بسرعة 10 إلى 15 الحيوانات من لوحة الأسهم إلى قطرات مخدر قبل أن يجف الحل. ثم تطبيق غطاء عن طريق وضعه فقط فوق لوحة agarose وإسقاط بلطف عليه.
صورة المناطق متشابك مع خط المسح المجهر confocal إلى جانب 488 و 552 نانومتر بصريا ضخ ليزر شبه موصل الصمام الثنائي ومجهزة برنامج التقاط الصور. بعد تحديد موقع الديدان، انتقل إلى تكبير 40X وتطبيق وسط الغمر. البصرية المنطقة متشابك من قبل مثيرة fluorophores مع ليزر نانومتر 552، 1٪ قوة لفلوروفور tagRFP، و 488 نانومتر، 2٪ السلطة لفلوروفور GFP.
التقاط الصور باستخدام الضوئي الهجين وتعيين المكاسب لمنع التعرض المفرط للفلوروفوريس. جمع الصور Z-المكدس لتغطية المشبك بأكمله باستخدام حجم الخطوة Z الأمثل اعتمادا على الهدف. لتحليل منطقة متشابك تبدأ عن طريق تحميل الصور في برنامج CellProfiler 3.1.5.
قم بإعداد الوحدة النمطية NameAndType وتحديد المنطقة متشابك بواسطة تعريف جهة باستخدام tagRFP المنتشر التعبير عنها من transgene UIS-115. قياس حجم ومينوسنس من المشبك المعرفة يدويا عن طريق إضافة وحدات MeasureObjectSizeShape و MeasureObjectIntensity إلى خط الأنابيب. ثم حساب كثافة الفلوريسنس المتكاملة النسبية عن طريق إضافة وحدة حساب ماث وتقسيم وحدات الكثافة المتكاملة التي تم الحصول عليها من JSIS37 من قبل تلك التي تم الحصول عليها من UIS-115.
عند الانتهاء من تصدير جميع القياسات والحسابات. لقياس منطقة خلايا العضلات فتح الصورة في فيجي البرمجيات واستخدام اختيار المضلع لتتبع بعناية حول خلية واحدة العضلات المائلة. اضبط خط المضلع في النهاية بسحب نقطة الإرساء لتحسين التتبع.
انتقل إلى علامة التبويب تحليل في أعلى البرنامج وانقر على قياس لحساب المنطقة المحددة. بالنسبة لخلايا العضلات التي تحتوي على منطقة منحطة أو مفقودة، تتبع المنطقة المفقودة باستخدام أداة تحديد المضلع وانقر فوق قياس مرة أخرى. إذا كان هناك فجوات متعددة، تتبع كل واحد على حدة.
حساب نسبة مساحة الفجوة إلى مساحة الخلية بأكملها. تشير نسبة عالية إلى ارتفاع درجة انحطاط العضلات. وإذا لم تكن هناك مناطق مفقودة، يتم حساب النسبة على أنها صفر.
افتح Elastic واختر تصنيف بكسل ضمن إنشاء مشروع جديد. ثم إعادة تسمية وحفظ المشروع. انتقل إلى علامة التبويب بيانات الإدخال وانقر فوق إضافة جديد، ثم إضافة صور منفصلة.
قم بتوجيه النافذة المنبثقة إلى المجلد باستخدام ملفات TIF وحدد الصورة المطلوبة. في علامة التبويب اختيار الميزة انقر فوق تحديد الميزات لتحديد كافة ميزات بكسل المشار إليها من قبل مربعات علامة الخضراء. يتم استخدام تحديد البكسل في هذه الخطوة لتمييز الفئات المختلفة من وحدات البكسل في الخطوة التالية.
استخدام لوحة التدريب للتمييز بين خيوط myosin الفردية التي تعبر عن GFP والخلفية غير المرغوب فيها. انقر على إضافة تسمية والخربشة الخلفيات غير المرغوب فيها والمسافات بين خيوط لبدء التدريب المصنف. أضف تسمية ثانية، أعيد تسميتها إلى خيوط، وازحف على عدد من الخيوط.
انقر على Live Update للتأكد من أن التصنيف قد تم بشكل صحيح. إذا لزم الأمر، إضافة المزيد من الخربشة لضبط التدريب. بمجرد أن يتم تنفيذ مصنف التدريب ، انتقل إلى لوحة تصدير التنبؤ وانقر على اختيار إعدادات صورة التصدير مع الاحتمالات كمصدر.
تأكد من أن يتم تكتك المناطق الفرعية اقطع x و y، و ج غير مُغَرَّد. حدد صفرًا وقيمة واحدة كقيم بدء وإيقاف لـ c، وتحويل نوع البيانات إلى 8 بت غير موقعة. ضع علامة على إعادة صياغة ثم قم بتغيير ملف إخراج الفيديو إلى png، وإعادة تسمية الملف والدليل حسب الرغبة.
أغلق نافذة تصدير الإعدادات ثم قم بتصدير الصورة التي تم تقسيمها للتو. ثم افتح ملف png في برنامج فيجي. اضبط الحد الأدنى للصورة باستخدام الإعدادات الافتراضية وقم بتطبيق المكون الإضافي للهيكل العظمي، والذي سينشئ جدولًا منفصلًا للنتائج.
وقد استخدم هذا البروتوكول لاستكشاف وظيفة ألفا-توبولين أسيتيل ترانسفيراز MEC-17 في تطوير المشبك. التحليل الكمي لصور microtubule الخلفي / الجانبي أو نقاط الاشتباك العصبي PLM يشير إلى أن فرط التعبير من MEC-17 يعطل وظيفة الخلايا العصبية العادية. بالمقارنة مع الحيوانات السيطرة على نوع البرية overexpressing MEC-17 قد خفضت بشكل كبير المناطق presynaptic والسلامة متشابك.
وقد استخدمت هذه التقنيات أيضا لتحليل نماذج C.elegans من نوع شاركوت ماري توث 2 أو CMT2 تحمل الطفرات في الجينات المرتبطة CMT2. وكشف التقييم البصري لرفرف العضلات جدار الجسم زيادة 2.5 إلى 3.5 أضعاف في العيوب في الحيوانات اختبار بالمقارنة مع التحكم في نوع البرية. الحيوانات مع الطفرات في fzo-1 و unc-116 شهدت فقدان العضلات التصدع، وتراكم الحطام الخلوي، وانحطاط الألياف العضلية.
في حين أن الحيوانات مع الطفرات في dyn-1 شهدت عيوب أقل بكثير في مورفولوجيا العضلات. وأظهرت المسوخ fzo-1 و unc-116 زيادة خمسة إلى ستة أضعاف في نسبة الفجوة إلى إجمالي منطقة الخلية المفردة ومتوسط متوسط طول الألياف بشكل كبير مقارنة بالحيوانات من النوع البري. لإجراء المقارنات بين العينات من المهم تحديد أفضل الظروف للحصول على الصورة، وضمان استخدام هذه الشروط بشكل متسق.
وسوف تسمح هذه التقنيات للباحثين بمقارنة التغيرات المورفولوجية عبر خلفيات جينية مختلفة مع المقاربات الكمية. وهذا يقلل من الذاتية، وبالتالي يساعد على تعزيز قابلية تمثيل البيانات التي تم إنشاؤها.
