فإن الكتاب أود أن أشكر لمارلين ديتريش في مرفق التدفق الخلوي LSU الأساسية لمساعدتها على فرز الخلايا وموترام بيتر لمساعدته مع microphotographs. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل معهد الطيران المصاحبة للبحوث الطبية ، وبرنامج بحوث LSU جائزة للمنافسة ، ومنح المعاهد الوطنية للصحة / NIAID P20 RR020159 وR03AI081171.

1. نضح الرئة وحيدة الخلية تعليق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء والفأر مع حقنة مخدر داخل الصفاق من خليط الكيتامين / زيلازين (في ملغم / الماوس الكيتامين 1.8 ، زيلازين 0.19) ، واستنزاف عن طريق الوريد الفخذي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كشف التجويف الصدري عن طريق قطع وسحب بلطف يعود الجلد الخارجي للالبريتوني. المضي قدما لفتح الحجاب الحاجز عن طريق قطع القفص الصدري لفضح كل من القلب والرئتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يروي بلطف الرئتين باستخدام حقنة 5 مل مملوءة EDTA - HBSS (1MM EDTA في HBSS - المغنيسيوم الكالسيوم الحرة /). الاتصال إبرة G 25 و ادخال ابرة في البطين الأيمن. لمنع التسرب أثناء الحقن ، وتأمين الأنسجة myocardiac حول إبرة باستخدام ملقط. حقن بلطف حل مع الحفاظ على الضغط المستمر. ونضح دقيقة نتيجة التضخم في الرئة وتغيير اللون إلى أبيض / الوردي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة تصريف الغدد الليمفاوية لتجاهل أي تلوث محتمل من هذا النسيج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمعأنسجة الرئة ، ونقل إلى طبق بتري على الجليد ، وختم لقطع صغيرة باستخدام شفرة حلاقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأنسجة ترتكز في أنبوب C gentleMACS تحتوي على 5 مل / الرئة في حل الهضم كولاجيناز (كولاجيناز نوع 1A 0.5 ملغ / مل بالإضافة إلى نوع البنكرياس البقري الدناز الرابع 20 ميكروغرام / مل في HBSS تحتوي على 5 ٪ FBS ، 100 U / مل البنسلين و100 ميكروغرام / الستربتوميسين مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام dissociator gentleMACS للحصول على تعليق خلية واحدة. اختيار البرنامج : m_lung_01. احتضان عينة على 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. هز أنبوب كل 5 دقائق لresuspend شظايا الأنسجة. المضي قدما في m_lung_02 البرنامج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل العينة إلى أنبوب 15 مل المخروطية والطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 335 ز س في 4 درجات مئوية. بعد هذه الخطوة ، وإبقاء كل الكواشف centrifugations في 4 درجات مئوية لمنع انخفاض في قابلية الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف وليز المتبقية خلايا الدم الحمراء بإضافة 2 مل من ACK lysing العازلة لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. غسل الخلايا مع 13مل من البرد BSA PBS/0.5 ٪ ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 335 ز س في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل ، resuspend طاف خلايا الكلي في 5 مل من البرد BSA PBS/0.5 ٪ وتمرير دقيق النايلون 100 ميكرون شبكة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد عدد الخلايا الكلي باستخدام التريبان استبعاد الصباغ الأزرق. </li></ol> 2. العزلة والمغناطيسية CD11c تخصيب خلايا + <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق واحد خلية الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في ز × 200 درجة مئوية في 4 و تجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلية بيليه في 400 ميكرولتر من الفصل العازلة (PBS ، BSA 0.5 ٪ ، و 2 ملي EDTA) في خلايا 8 10 المجموع. كتلة FC - بوساطة الأضداد غير محددة ملزمة باستخدام anti-CD16/CD32 الأضداد (0.5μg / 10 6 خلايا) لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع 10 مل من العازلة فصل البرد والطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في ز × 200 في 4 درجات مئوية. Resuspend الخلايا في 400 ميكرولتر من العازلة الفاصلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من MicroBeads CD11c في 10 8 </سوب&gt; خلايا الكلية. المزيج جيدا واحتضان لمدة 15 دقيقة في الثلاجة (2-8 درجة مئوية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع 10 مل من العازلة فصل البرد والطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في ز × 200 درجة مئوية في 4 و تجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الكرية خلية في 3 مل من العازلة الفصل البارد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ الفصل المغناطيسي باستخدام فاصل autoMACS TM برو بتحديد posseld البرنامج. جمع الكسر الإيجابي (0.5 مل). </li></ol> 3. الخلايا الجذعية التقليدية (CDC) العزلة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان المخصب CD11c تعليق خلية ايجابية مع مكافحة CD11c PE - Cy7 وanti-IA/IE (MHC - II) - FITC الأجسام المضادة لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. تركيز الأجسام المضادة الأمثل هو 0.5 ميكروغرام / 10 6 من الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا من البرد BSA PBS/0.5 ٪ والطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 335 ز س في 4 درجات مئوية. Resuspend الخلايا في 0.5 مل من جيش صرب البوسنة PBS/0.5 ٪ وتمريرها من خلال شبكة من النايلون 40 ميكرون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شروعفرز الخلايا باستخدام الخلية الأغنية FACS فارز في وضع النقاء. إضافة 100 ميكرولتر من جيش صرب البوسنة PBS/0.5 ٪ للأنابيب جمع من أجل منع تلف الخلايا النقية. إبقاء خلايا الجسم عند درجة حرارة المبرد في جميع أنحاء الخلية عملية الفرز. </li></ol> 4. بروتوكول بديلة للحصول على تعليق خلية واحدة وCD11c تخصيب خلايا + <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في استبدال dissociator gentleMACS ، يمكن نقل أنسجة الرئة أساس من 1.5 إلى الخطوة أنبوب مخروطية 15 مل تحتوي على 5 مل من محلول كولاجيناز في الرئة واحتضان لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية. دوامة الخلايا كل 15 دقيقة من أجل resuspend شظايا الأنسجة. تعطيل الأنسجة عن طريق تمرير العينة 6-8 مرات الدخول والخروج من خلال حقنة 3 مل متصلة إبرة مجموعة ال 20. تجنب جعل فقاعات أثناء العملية ، وإلا سوف يعرض للخطر بقاء الخلية. مرة واحدة يتم الحصول على تعليق خلية ، انتقل إلى الخطوة 1.8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليحل محل منفصل ، TM AutoMACSProويمكن أيضا تور ، والعزلة المغناطيسي لإثراء الخلايا CD11c ، أن يؤديها تمرير تعليق خلية يدويا من خلال أعمدة MACS اثنين. سيتم اختيار الأعمدة المناسبة تختلف تبعا لحجم العينة. </li></ol> 5. ممثل النتائج : ويتم تحديد المراكز على النحو الرئة مرحبا CD11c / MHC - II سكان الخلية مرحبا. كما هو مبين في الشكل. 1 ، منها تمثل نسبة أقل من 1.4 ٪ بالمقارنة مع بعض الأنسجة الأخرى مثل الطحال (4.8 ٪). لكن ، على النقيض من الطحال والرئة الخلايا CD11c ايجابية عن كميات مختلفة من MHC - II ، بما في ذلك السكان خلية مختلفة من أن من CDC. بعد إعداد وحيدة الخلية ، وكان العائد خلية من خلايا الرئة مجموعه حوالي 3،0-3،8 7 × 10 خلية / الرئة مع بقاء 60-70 ٪ من خلالها ما يزيد قليلا عن 1 ٪ منها تمثل مجموعة فرعية. وزادت هذه النسبة بعد عزلة المغناطيسي CD11c حيث تم زيادة مجموع الرئة منها حوالي 10 رIMES (&gt; 16 ٪) من إعداد الأصلي (الشكل 2A). ومع ذلك ، تمثل الخلايا CD11c التعبير عن كميات قليلة من MHC - II (CD11c مرحبا / لو MHC - II ، الضامة) وارتفاع عدد السكان الخلية تلويث (&gt; 70 ٪) والتي كانت مختلطة مع مجموعة فرعية منها الرئة. كما هو مبين في الشكل. 2B ، تم القضاء على تلك الخلايا بعد فرز الخلايا الخطوة عندما وصلت منها النقاء&gt; 96 ٪. وكان العائد المعتاد منها بعد العملية برمتها 5 × 10 4 خلية / الرئة. Microphotographs تظهر الخصائص المورفولوجية من مركز السيطرة على الأمراض والخلايا تقريب مع التشعبات نموذجي (اللوحة العليا). من ناحية أخرى ، مثلت CD11c مرحبا / لو MHC - II مجموعة فرعية مختلفة شكليا يعرض نتوءات الخلوية التي هي نموذجية في الضامة (MΦ ، اللوحة السفلى) 12. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3563/3563fig1.jpg" /> الشكل 1. التردد في العاصمة التفاضلية الماوس الرئة والطحال. a الرئةوجمعت الثانية من نسيج الطحال C57BL / 6 و الفئران تعامل مع كولاجيناز. بعد الهضم كولاجيناز ، تم صبغ الخلايا المضادة للماوس CD11c - PE - IA Cy7 ومكافحة فأر / IE FITC. قطع ممثل التدفق الخلوي تظهر النسب المئوية للCDC (CD11c مرحبا / مرحبا MHC - II) في الرئة والطحال. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3563/3563fig2.jpg" /> الشكل 2. عزل CDC من الرئة الماوس. تم تعليق الرئة المسمى الفأر مع خلية واحدة لمكافحة CD11c microbeads ومرت من خلال فاصل الخلايا التلقائي. أ) مؤامرة ممثل يبين النسب المئوية للCDC (CD11c مرحبا / مرحبا MHC - II) و الضامة (MΦ ، CD11c مرحبا / لو MHC - II) السكان بعد تخصيب CD11c. يتبع مزيد من تلطيخ الكسر المخصب استخدام الألغام المضادة للماوس CD11c - PE - IA Cy7 ومكافحة فأر / IE FITC. تم فرز الخلايا ايجابية مزدوجة وتحليلها من قبل التدفق الخلوي. إلىتم التعرف على التشكل ، cytospun الخلايا والملون مع تلوين رايت بالغيمزا المعدلة. B) المؤامرات الممثل تظهر النسب المئوية من مركز السيطرة على الأمراض وMΦ بعد فرز الخلايا. Microphotographs تظهر صورة ممثل CDC MΦ الرئة وسرطان الرئة. شريط النطاق = 20 ميكرون.

<ol>
	<li>Pulendran, B., Palucka, K., Banchereau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+pathogens+and+tuning+immune+responses.">Sensing pathogens and tuning immune responses.</a> Science. 293, 253-256 (2001).</li><li>Banchereau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunobiology+of+dendritic+cells.">Immunobiology of dendritic cells.</a> Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).</li><li>Manicassamy, S., Pulendran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+control+of+tolerogenic+responses.">Dendritic cell control of tolerogenic responses.</a> Immunol. Rev. 241, 206-227 (2011).</li><li>Steinman, R. M., Cohn, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+cell+type+in+peripheral+lymphoid+organs+of+mice.+I.+Morphology,+quantitation,+tissue+distribution.">Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution.</a> J. Exp. Med. 137, 1142-1162 (1973).</li><li>Asselin-Paturel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+type+I+IFN-producing+cells+are+immature+APCs+with+plasmacytoid+morphology.">Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology.</a> Nat. Immunol. 2, 1144-1150 (2001).</li><li>Chan, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-producing+killer+dendritic+cells+provide+a+link+between+innate+and+adaptive+immunity.">Interferon-producing killer dendritic cells provide a link between innate and adaptive immunity.</a> Nat. Med. 12, 207-213 (2006).</li><li>Taieb, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+dendritic+cell+subset+involved+in+tumor+immunosurveillance.">A novel dendritic cell subset involved in tumor immunosurveillance.</a> Nat. Med. 12, 214-219 (2006).</li><li>Guerrero-Plata, A., Kolli, D., Hong, C., Casola, A., Garofalo, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subversion+of+pulmonary+dendritic+cell+function+by+paramyxovirus+infections.">Subversion of pulmonary dendritic cell function by paramyxovirus infections.</a> Journal of Immunology. 182, 3072-3083 (2009).</li><li>Larson, R. S., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+leukocyte+integrins.">Structure and function of leukocyte integrins.</a> Immunol. Rev. 114, 181-217 (1990).</li><li>Sung, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+lung+CD103+(alphaE)-beta7+integrin-positive+epithelial+dendritic+cell+population+expressing+Langerin+and+tight+junction+proteins.">A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins.</a> J. Immunol. 176, 2161-2172 (2006).</li><li>Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+CD11c++MHC+class+II-+precursors+generate+lung+dendritic+cells+during+respiratory+viral+infection,+but+are+depleted+in+the+process.">Local CD11c+ MHC class II- precursors generate lung dendritic cells during respiratory viral infection, but are depleted in the process.</a> J. Immunol. 177, 2536-2542 (2006).</li><li>Bhatia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+host+defense+against+Aspergillus+fumigatus+involves+alveolar+macrophages+with+a+predominance+of+alternatively+activated+phenotype.">Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance of alternatively activated phenotype.</a> PLoS One. 6, e15943-e15943 (2011).</li><li>Shao, Z., Makinde, T. O., McGee, H. S., Wang, X., Agrawal, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fms-like+tyrosine+kinase+3+ligand+regulates+migratory+pattern+and+antigen+uptake+of+lung+dendritic+cell+subsets+in+a+murine+model+of+allergic+airway+inflammation.">Fms-like tyrosine kinase 3 ligand regulates migratory pattern and antigen uptake of lung dendritic cell subsets in a murine model of allergic airway inflammation.</a> J. Immunol. 183, 7531-75381 (2009).</li><li>Hao, X., Kim, T. S., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+response+of+respiratory+dendritic+cell+subsets+to+influenza+virus+infection.">Differential response of respiratory dendritic cell subsets to influenza virus infection.</a> J. Virol. 82, 4908-4919 (2008).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

عزل العاصمة الماوس الرئوية هي تقنية هامة لدراسة طائفة واسعة من المحفزات في الجهاز التنفسي. عملية الحصول على هذه الخلايا وتشمل الخطوات الحاسمة التي تمنع فقدان الخلايا وكذلك بقاء الخلية والنقاء. سوف Perfusing الرئة قبل جمع مساعدة للقضاء على أي خلايا المحيطية وكذلك الحد من...

<table width="200" border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> اسم الكاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليق (اختياري) </td></tr><tr><td> ACK lysing العازلة </td><td> Invitrogen </td><td> D6 - 0005DG </td><td></td></tr><tr><td> مكافحة فأر CD11c (HL3) </td><td> Pharmingen دينار بحريني </td><td> 5580979 </td><td> PE - Cy7 مترافق </td></tr><tr><td> مكافحة فأر IA / IE (269) </td><td> BD - Pharmingen </td><td> 553623 </td><td> مترافق FITC </td></tr><tr><td> Collangenase نوع 1A </td><td> سيغما </td><td> 9891 - 500MG </td><td></td></tr><tr><td> خلية مصافى </td><td> فالكون دينار بحريني </td><td> 352340 ، 352360 </td><td></td></tr><tr><td> CD11c (N418) Microbeads </td><td> Miltenyi </td><td> 130-052-001 </td><td></td></tr><tr><td> أنا الدناز </td><td> سيغما </td><td> D5025 - 150KU </td><td></td></tr><tr><td> هانك محلول الملح المتوازن </td><td> Invitrogen </td><td> 14170 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes العازلة الحل </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> أطباق بتري 60 مم </td><td> فالكون دينار بحريني </td><td> 351016 </td><td></td></tr><tr><td> GentleMACS ™ C أنابيب </td><td> Miltenyi </td><td> 130-093-237 </td><td></td></tr><tr><td> طيف MACS dissociator </td><td> Miltentyi </td><td> 130-093-235 </td><td></td></tr><tr><td> AutoMACS برو ™ </td><td> Miltenyi </td><td> 130-092-545 </td><td></td></tr><tr><td> FASCS الأغنية </td><td> دينار بحريني </td><td></td><td></td></tr></table>

isolation of mouse lung dendritic cells

الخلايا الجذعية الرئة (DC) تلعب دورا أساسيا في مجال الاستشعار عن غزو الجراثيم ، فضلا عن 1،2 في السيطرة على ردود مولد للتحمل 3 في الجهاز التنفسي. وقد وصفت ما لا يقل عن ثلاث مجموعات فرعية من الخلايا الجذعية الرئيسية الرئة في الفئران : DC التقليدية (CDC) 4 ، بلازماوية DC (PDC) (5) وإنتاج الإنترفيرون العاصمة القاتل (IKDC) 6،7. مجموعة فرعية منها هي فرعية العاصمة الأبرز في الرئة 8. العلامة المشتركة المعروفة لتحديد مجموعات فرعية هي العاصمة CD11c ، وهو النوع الأول إنتغرين عبر الغشاء (β2) الذي أعرب أيضا عن حيدات ، الضامة ، العدلات وبعض الخلايا باء 9. في بعض الأنسجة ، وذلك باستخدام CD11c كعلامة لتحديد الماوس العاصمة غير صالحة ، كما هو الحال في الطحال ، حيث ان معظم الخلايا + CD11c تمثل مجموعة فرعية منها التي تعبر عن مستويات عالية من التوافق النسيجي الرئيسي الثاني فئة المعقدة (MHC - II). ومع ذلك ، فإن سرطان الرئة هو أكثر الأنسجة المتجانسة حيث تكونالجانب فرعية العاصمة ، وهناك نسبة عالية من السكان الخلايا المتميزة التي تعبر عن مستويات عالية من CD11c نوبة انخفاض مستويات MHC - II. استنادا إلى توصيف ومعظمها على التعبير عن F4/80 ، علامة بلعم الطحال ، وقد تم تحديد مرحبا CD11c الرئة لو MHC - II سكان الخلية كما الضامة الرئوي (10) وأكثر في الآونة الأخيرة ، تمهيدا العاصمة المحتملة 11. على النقيض من PDC الماوس ، اقتصر على دراسة الدور المحدد للمركز السيطرة على الأمراض في استجابة مناعية الرئوي نظرا لعدم وجود علامة معينة يمكن أن تساعد في عزل هذه الخلايا. لذا ، في هذا العمل ، ونحن تصف الإجراء لعزل عالي النقاء الماوس الرئة CDC. عزل مجموعات فرعية العاصمة الرئوي يمثل أداة مفيدة جدا للحصول على نظرة ثاقبة وظيفة هذه الخلايا في الاستجابة لمسببات الأمراض التنفسية فضلا عن العوامل البيئية التي يمكن أن تؤدي إلى استجابة المضيف المناعية في الرئة.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells at JoVE.com

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

يوصف مستحضر عالي النقاء من الخلايا الجذعية الماوس الرئة. ويولى اهتمام محدد لعزل الخلايا الجذعية التقليدية فرعية.

عزل خلايا الرئة ماوس شجيرى

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

28.9K Views.  Louisiana State University. يوصف مستحضر عالي النقاء من الخلايا الجذعية الماوس الرئة. ويولى اهتمام محدد لعزل الخلايا الجذعية التقليدية فرعية.

Video: Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal tract and other viscera. It harbors a number of immune cells including macrophages, B cells and T cells. The presence of a high number of na&iuml;ve macrophages in the peritoneal cavity makes it a preferred site for the collection of na&iuml;ve tissue resident macrophages (1). The peritoneal cavity is also important to the study of B cells because of the presence of a unique peritoneal cavity-resident B cell subset known as B1 cells in addition to conventional B2 cells. B1 cells are subdivided into B1a and B1b cells, which can be distinguished by the surface expression of CD11b and CD5. B1 cells are an important source of natural IgM providing early protection from a variety of pathogens (2-4). These cells are autoreactive in nature (5), but how they are controlled to prevent autoimmunity is still not understood completely. On the contrary, CD5+ B1a cells possess some regulatory properties by virtue of their IL-10 producing capacity (6). Therefore, peritoneal cavity B1 cells are an interesting cell population to study because of their diverse function and many unaddressed questions associated with their development and regulation. The isolation of peritoneal cavity resident immune cells is tricky because of the lack of a defined structure inside the peritoneal cavity. Our protocol will describe a procedure for obtaining viable immune cells from the peritoneal cavity of mice, which then can be used for phenotypic analysis by flow cytometry and for different biochemical and immunological assays.

The peritoneal cavity in mammals contains different immune cell populations crucial for innate immune responses. An efficient isolation method is required for biochemical and functional analyses of these cells. Here we provide a comprehensive method for the isolation of peritoneal cavity cells in the mouse.

عزل خلايا فأر التجويف البريتوني

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and food antigens while concomitantly remaining poised to mount inflammatory responses toward invasive pathogens1,2. Antigen presenting cells, particularly DCs and macrophages, play critical roles in maintaining intestinal immune homeostasis via their ability to sense and appropriately respond to the microbiota3-14. Efficient isolation of intestinal DCs and macrophages is a critical step in characterizing the phenotype and function of these cells. While many effective methods of isolating intestinal immune cells, including DCs and macrophages, have been described6,10,15-24, many rely upon long digestions times that may negatively influence cell surface antigen expression, cell viability, and/or cell yield. Here, we detail a methodology for the rapid isolation of large numbers of viable, intestinal DCs and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is carried out by directly staining isolated intestinal cells with specific fluorescence-labeled monoclonal antibodies for multi-color flow cytometric analysis. Furthermore, highly pure DC and macrophage populations are isolated for functional studies utilizing CD11c and CD11b magnetic-activated cell sorting beads followed by cell sorting.

Here, we detail a methodology for the rapid isolation of mouse intestinal dendritic cells (DCs) and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is performed using multi-color flow cytometric analysis while magnetic bead enrichment followed by cell sorting is used to yield highly pure populations for functional studies.

عزل وتوصيف الخلايا الجذعية والضامة من الأمعاء ماوس

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

عزل الخلايا الجذعية متعلق بالنخاع الشوكي والخلايا الظهارية من الغدة الصعترية الإنسان

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

على طريقة العائد فعالة وعالية لعزل مجموعات فرعية خلية الفأر الجذعية

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

مضان تنشيط الفرز الخليوي لتنقية الخلايا الجذعية بلازماوية الشكل من الفأر نخاع العظم

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

جيل من الوحيدات المستمدة الخلايا الجذعية البشرية من الدم الكامل

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases. 
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays. 
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Here, we describe the purification of Legionella pneumophila (L. pneumophila) outer membrane vesicles (OMVs) from liquid cultures. These purified vesicles are then used for the treatment of macrophages to analyze their pro-inflammatory potential.

البكتيريا المستروحة الخارجي غشاء الحويصلات: عزل وتحليل إمكاناتهم الموالية للالتهابات في الضامة

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Human Lung Dendritic Cells: Spatial Distribution and Phenotypic Identification in Endobronchial Biopsies Using Immunohistochemistry and Flow Cytometry

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In order to maintain tolerance or to induce an immune response, the immune system must appropriately handle inhaled antigens. Lung dendritic cells (DCs) are essential in maintaining a delicate balance to initiate immunity when required without causing collateral damage to the lungs due to an exaggerated inflammatory response. While there is a detailed understanding of the phenotype and function of immune cells such as DCs in human blood, the knowledge of these cells in less accessible tissues, such as the lungs, is much more limited, since studies of human lung tissue samples, especially from healthy individuals, are scarce. This work presents a strategy to generate detailed spatial and phenotypic characterization of lung tissue resident DCs in healthy humans that undergo a bronchoscopy for the sampling of endobronchial biopsies. Several small biopsies can be collected from each individual and can be subsequently embedded for ultrafine sectioning or enzymatically digested for advanced flow cytometric analysis. The outlined protocols have been optimized to yield maximum information from small tissue samples that, under steady-state conditions, contain only a low frequency of DCs. While the present work focuses on DCs, the methods described can directly be expanded to include other (immune) cells of interest found in mucosal lung tissue. Furthermore, the protocols are also directly applicable to samples obtained from patients suffering from pulmonary diseases where bronchoscopy is part of establishing the diagnosis, such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD), sarcoidosis, or lung cancer.

Lung-resident immune cells, including dendritic cells (DCs) in humans, are critical for defense against inhaled pathogens and allergens. However, due to the scarcity of human lung tissue, studies are limited. This work presents protocols to process human mucosal endobronchial biopsies for studying lung DCs using immunohistochemistry and flow cytometry.

خلايا الإنسان الجذعية الرئة: التوزيع المكاني والمظهري تحديد في داخل القصبة التحليلات عن طريق المناعية والتدفق الخلوي

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In ...

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for quantitative analysis of cell surface proteins on immune cells, but it provides no information on the localization and migration patterns of these cells within the lung. Similarly,&#160;chemotaxis assays can be performed to study the potential of cells to respond to chemotactic factors in vitro, but these assays do not reproduce the complex environment of the intact lung. In contrast to these aforementioned techniques, the location of individual cell types within the lung can be readily visualized by generating Precision-cut Lung Slices (PCLS), staining them with commercially available, fluorescently tagged antibodies, and visualizing the sections by confocal microscopy. PCLS can be used for both live and fixed lung tissue, and the slices can encompass areas as large as a cross section of an entire lobe. We have used this protocol to successfully visualize the location of a wide variety of cell types in the lung, including distinct types of dendritic cells, macrophages, neutrophils, T cells and B cells, as well as structural cells such as lymphatic, endothelial, and epithelial cells. The ability to visualize cellular interactions, such as those between dendritic cells and T cells, in live, three-dimensional lung tissue, can reveal how cells move within the lung and interact with one another at steady state and during inflammation. Thus, when used in combination with other procedures, such as flow cytometry and quantitative PCR, PCLS can contribute to a comprehensive understanding of cellular events that underlie allergic and inflammatory diseases of the lung.

We describe a method for generating Precision-cut Lung Slices (PCLS) and immunostaining them to visualize the localization of various immune cell types in the lung. Our protocol can be extended to visualize the location and function of many different cell types under a variety of conditions.

الرئة ماوس شرائح لتصور لايف الخلايا الجذعية الرئوي قطع الدقة

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...

Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low numbers of DCs present per tissue. Yet, as the phenotype and function of DCs is modified by the tissue environment, it is necessary to analyze tissue resident DC populations, since blood derived DCs incompletely reflect the complexities of DCs in tissues. Here we present a protocol to isolate DCs from the human female reproductive tract (FRT) using hysterectomy specimens that allows both phenotypical and functional analyses. The protocol consists of tissue digestion to generate a single cell mixed cell suspension, followed by positive magnetic bead selection. Our tissue digestion protocol does not cleave surface markers, which allows phenotypical and functional analysis of DCs in the steady state, without overnight incubation or cell activation. This protocol can be adapted for the isolation of other immune cell types or isolation of DCs from other tissues.

We describe here a method to isolate and purify dendritic cells from different anatomical compartments in the human female reproductive tract for the evaluation of their phenotypical and functional characteristics. This method can be adapted to isolate other immune cells or dendritic cells from other mucosal tissues.

عزل الخلايا الجذعية من الإنسان الأنثى التناسلي للدراسات الشكلية والوظيفية

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low ...