המחברים מבקשים להודות למרילין דיטריך במתקן cytometry זרימה LSU Core עזרתה עם מיון התא ופיטר Mottram עזרתו עם microphotographs. עבודה זו מומנה על ידי דיילת מכון המחקר הרפואי, את LSU-תחרותי תוכנית פרס המחקר, ו-NIH / NIAID מענקים P20 RR020159 ו R03AI081171.

1. ריאות זלוף ההשעיה תא בודד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר עם זריקה intraperitoneal של תערובת ההרדמה קטאמין / xylazine (ב mg / עכבר 1.8 קטמין, xylazine 0.19) ו exsanguination דרך וריד הירך </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את חלל בית החזה על ידי חיתוך משיכתו בעדינות בחזרה את העור החיצוני של הצפק. המשך כדי לפתוח את הסרעפת על ידי חיתוך החזה כדי לחשוף גם את הלב והריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse בעדינות את הריאות באמצעות מזרק 5 מ&quot;ל מלאים EDTA-HBSS (1mm EDTA סידן / מגנזיום ללא HBSS). חבר מחט 25 G ו להכניס מחט לתוך החדר הימני. כדי למנוע דליפה במהלך ההזרקה, לאבטח את הרקמה myocardiac סביב המחט באמצעות מלקחיים. בעדינות להזריק פתרון תוך שמירה על לחץ קבוע. זלוף מדויק תגרום לאינפלציה ריאה ושינוי צבע ורוד / לבן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ניקוז בלוטות הלימפה כדי לבטל כל אפשרות של זיהום מן הרקמה הזאת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגבותרקמת הריאה, להעביר בצלחת פטרי על קרח, לקצוץ אותו לחתיכות קטנות בעזרת סכין גילוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת רקמה מעוגנת לתוך צינור gentleMACS C המכיל 5 מ&quot;ל / ריאות של פתרון העיכול collagenase (collagenase סוג 1A 0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​בתוספת סוג IV שור הלבלב DNase 20 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ב HBSS המכיל 5% FBS, 100 U / ml פניצילין 100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש dissociator gentleMACS לקבל השעיה תא בודד. בחר תוכנית: m_lung_01. דגירה מדגם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. Shake צינור כל 5 דקות כדי resuspend שברי הרקמה. המשך m_lung_02 התוכנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת מדגם צינור חרוטי 15 מ&quot;ל ו צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 335 x גרם ב 4 ° C. לאחר שלב זה, לשמור את כל ריאגנטים centrifugations ב 4 ° C כדי למנוע ירידה כדאיות התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו lyse הנותרים כדוריות דם אדומות על ידי הוספת 2 מ&quot;ל של חיץ lysing ACK דקה 1 בטמפרטורת החדר. לשטוף עם 13 תאיםמ&quot;ל של BSA PBS/0.5% צנטריפוגות קרים במשך 10 דקות ב 335 x גרם ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant, תאים הכולל resuspend ב 5 מ&quot;ל של BSA PBS/0.5% קר לעבור יסודית רשת ניילון 100 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את מספר הסלולרי סך באמצעות trypan צבע כחול הדרה. </li></ol> 2. בידוד מגנטי והעשרה CD11c + תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה תא בודד במשך 10 דקות ב 200 x גרם ב 4 ° C וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תא גלולה ב 400 μl של חיץ ההפרדה (PBS, BSA 0.5%, ו - 2 mM EDTA) לכל 10 8 תאים בסך הכל. בלוק Fc בתיווך נוגדנים נוקבים מחייב באמצעות anti-CD16/CD32 נוגדן (0.5μg / 10 6 תאים) במשך 30 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים עם 10 מ&quot;ל של חיץ ההפרדה צנטריפוגות קרים במשך 10 דקות ב 200 x גרם ב 4 ° C. Resuspend תאים μl 400 של חיץ ההפרדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl של microbeads CD11c לכל 10 8 </sup&gt; תאים בסך הכל. מערבבים היטב דגירה במשך 15 דקות במקרר (2-8 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים עם 10 מ&quot;ל של חיץ ההפרדה צנטריפוגות קרים במשך 10 דקות ב 200 x גרם ב 4 ° C וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה ב 3 מ&quot;ל של חיץ ההפרדה קר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצעו הפרדה מגנטי באמצעות מפריד Pro autoMACS TM ידי בחירת posseld התוכנית. אסוף את חלק חיובי (0.5 מ&quot;ל). </li></ol> 3. הדנדריטים בתא בידוד קונבנציונלי (CDC) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה מועשר CD11c ההשעיה התא חיובי עם אנטי CD11c PE-Cy7 ו anti-IA/IE (MHC-II), FITC נוגדנים במשך 30 דקות 4 ° C. ריכוז מיטבי של נוגדנים הוא 0.5 מיקרוגרם / 10 6 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים עם BSA PBS/0.5% צנטריפוגות קרים במשך 10 דקות ב 335 x גרם ב 4 ° C. תאים Resuspend ב 0.5 מ&quot;ל של BSA PBS/0.5% ולהעביר אותם דרך רשת ניילון 40 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשךלמיין את התאים באמצעות סדרן תא FACS Aria במצב טוהר. הוסף 100 μl של BSA PBS/0.5% ל צינורות לאיסוף כדי למנוע נזק של תאים מטוהרים. שמור את התאים בטמפרטורה בקירור לאורך כל תהליך מיון התא. </li></ol> 4. פרוטוקול חלופי לקבלת ההשעיה תא בודד והעשרה CD11c + תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשנת החלפת dissociator gentleMACS, רקמת הריאה מעוגנת משלב 1.5 ניתן להעביר צינור חרוטי 15 מ&quot;ל המכיל 5 מ&quot;ל של תמיסת collagenase לכל ריאה דגירה במשך שעה 1 ב 37 ° C. וורטקס תאים כל 15 דקות כדי resuspend שברי הרקמה. לשבש את הרקמה על ידי העברת מדגם 6-8 פעמים פנימה והחוצה דרך מזרק 3 מ&quot;ל קשור מחט G 20. הימנע עושה בועות בתהליך, אחרת הכדאיות התא יהיה בסכנה. לאחר ההשעיה תא בודד מתקבל, המשך לשלב 1.8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשנת החלפת TM AutoMACSPro separaטור, בידוד מגנטי להעשרת התאים CD11c, יכולה גם להתבצע על ידי העברת מתלה התא באופן ידני באמצעות שתי עמודות MACS. בחירת העמודות המתאימות ישתנה בהתאם לגודל המדגם. </li></ol> 5. נציג תוצאות: ריאות CDC מזוהים CD11c היי / MHC-II האוכלוסייה היי התא. כפי שמוצג באיור. 1, ה-CDC מהווים אחוז קטן יותר של 1.4% לעומת כ ברקמות אחרות כגון הטחול (4.8%). עם זאת, בניגוד טחול, ריאות תאים CD11c חיובית לבטא כמויות שונות של MHC-II, כולל האוכלוסייה תא שונה מזו של ה-CDC. לאחר הכנה מתא בודד, התשואה של התא לתאי ריאה הכולל היה כ 3.0-3.8 x 10 7 תאים / ריאות עם הכדאיות של 60-70% ממנה קצת מעל 1% מיוצג משנה CDC. אחוז זה עלה לאחר בידוד המגנטי CD11c שבו הריאות CDC הכולל היה מוגדל כ 10 times (&gt; 16%) מן הכנה המקורי (איור 2A). עם זאת, תאים CD11c לבטא כמויות נמוכות של MHC-II (CD11c היי / MHC-II והנה, מקרופאגים) ייצג האוכלוסייה גבוה תא מזהם (&gt; 70%) אשר היה מעורב עם תת הריאה ה-CDC. כפי שמוצג באיור. 2B, תאים אלה בוטלו לאחר שלב המיון, כאשר תא טוהר CDC הגיע&gt; 96%. התשואה הרגילים של ה-CDC לאחר ההליך כולו היה 5 x 10 4 תאים / ריאות. Microphotographs להראות מאפיינים מורפולוגיים של ה-CDC כמו תאים מעוגלים עם דנדריטים טיפוסי (הפאנל העליון). מצד שני, המיוצג על CD11c היי / MHC-II lo תת שונים מורפולוגית שמראה בליטות הסלולר האופייניים של מקרופאגים (MΦ, הפאנל התחתון) 12. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3563/3563fig1.jpg" /> 1. איור דיפרנציאלי DC תדירות הריאות והטחול העכבר. ריאותרקמת טחול nd מ C57BL / 6 עכברים נאספו שטופלו collagenase. בעקבות עיכול collagenase, התאים היו מוכתמות אנטי עכבר CD11c-PE-Cy7 ואנטי עכבר IA / IE-FITC. תזרים נציג מגרשים cytometry להראות אחוזי ה-CDC (CD11c היי / MHC-II היי) בתוך הריאות והטחול. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3563/3563fig2.jpg" /> באיור 2. בידוד של ה-CDC מן הריאות העכבר. ריאה עכבר תא בודד ההשעיה סומן עם אנטי CD11c microbeads ויעברו מפריד תא אוטומטי.) נציג העלילה מראה את האחוזים של ה-CDC (CD11c היי / MHC-II היי) ו המקרופאגים (MΦ, CD11c היי / MHC-II LO) אוכלוסיות לאחר העשרה CD11c. מכתים נוסף של השבר בעקבות מועשר באמצעות אנטי עכבר CD11c-PE-Cy7 ואנטי עכבר IA / IE-FITC. תאים חיובית כפולה מוינו ונותחו על ידי cytometry הזרימה. אלמורפולוגיה לזהות שלהם, התאים היו cytospun ומוכתמת עם צביעה שונה רייט Giemsa. B) מגרשים נציג להראות אחוזי ה-CDC MΦ לאחר מיון התא. Microphotographs להראות תמונה מייצגת של הריאה-CDC MΦ ריאות. בר סולם = 20 מיקרומטר.

<ol>
	<li>Pulendran, B., Palucka, K., Banchereau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+pathogens+and+tuning+immune+responses.">Sensing pathogens and tuning immune responses.</a> Science. 293, 253-256 (2001).</li><li>Banchereau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunobiology+of+dendritic+cells.">Immunobiology of dendritic cells.</a> Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).</li><li>Manicassamy, S., Pulendran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+control+of+tolerogenic+responses.">Dendritic cell control of tolerogenic responses.</a> Immunol. Rev. 241, 206-227 (2011).</li><li>Steinman, R. M., Cohn, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+cell+type+in+peripheral+lymphoid+organs+of+mice.+I.+Morphology,+quantitation,+tissue+distribution.">Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution.</a> J. Exp. Med. 137, 1142-1162 (1973).</li><li>Asselin-Paturel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+type+I+IFN-producing+cells+are+immature+APCs+with+plasmacytoid+morphology.">Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology.</a> Nat. Immunol. 2, 1144-1150 (2001).</li><li>Chan, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-producing+killer+dendritic+cells+provide+a+link+between+innate+and+adaptive+immunity.">Interferon-producing killer dendritic cells provide a link between innate and adaptive immunity.</a> Nat. Med. 12, 207-213 (2006).</li><li>Taieb, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+dendritic+cell+subset+involved+in+tumor+immunosurveillance.">A novel dendritic cell subset involved in tumor immunosurveillance.</a> Nat. Med. 12, 214-219 (2006).</li><li>Guerrero-Plata, A., Kolli, D., Hong, C., Casola, A., Garofalo, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subversion+of+pulmonary+dendritic+cell+function+by+paramyxovirus+infections.">Subversion of pulmonary dendritic cell function by paramyxovirus infections.</a> Journal of Immunology. 182, 3072-3083 (2009).</li><li>Larson, R. S., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+leukocyte+integrins.">Structure and function of leukocyte integrins.</a> Immunol. Rev. 114, 181-217 (1990).</li><li>Sung, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+lung+CD103+(alphaE)-beta7+integrin-positive+epithelial+dendritic+cell+population+expressing+Langerin+and+tight+junction+proteins.">A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins.</a> J. Immunol. 176, 2161-2172 (2006).</li><li>Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+CD11c++MHC+class+II-+precursors+generate+lung+dendritic+cells+during+respiratory+viral+infection,+but+are+depleted+in+the+process.">Local CD11c+ MHC class II- precursors generate lung dendritic cells during respiratory viral infection, but are depleted in the process.</a> J. Immunol. 177, 2536-2542 (2006).</li><li>Bhatia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+host+defense+against+Aspergillus+fumigatus+involves+alveolar+macrophages+with+a+predominance+of+alternatively+activated+phenotype.">Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance of alternatively activated phenotype.</a> PLoS One. 6, e15943-e15943 (2011).</li><li>Shao, Z., Makinde, T. O., McGee, H. S., Wang, X., Agrawal, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fms-like+tyrosine+kinase+3+ligand+regulates+migratory+pattern+and+antigen+uptake+of+lung+dendritic+cell+subsets+in+a+murine+model+of+allergic+airway+inflammation.">Fms-like tyrosine kinase 3 ligand regulates migratory pattern and antigen uptake of lung dendritic cell subsets in a murine model of allergic airway inflammation.</a> J. Immunol. 183, 7531-75381 (2009).</li><li>Hao, X., Kim, T. S., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+response+of+respiratory+dendritic+cell+subsets+to+influenza+virus+infection.">Differential response of respiratory dendritic cell subsets to influenza virus infection.</a> J. Virol. 82, 4908-4919 (2008).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

בידוד ריאתי עכבר DC היא טכניקה חשובה לחקר מגוון רחב של גירויים בדרכי הנשימה. תהליך קבלת תאים אלה כולל שלבים קריטיים למנוע אובדן של תאים, כמו גם כדאיות התא וטוהר. המרוססת הריאה לפני איסוף יעזור לחסל את כל התאים הפריפריה כמו גם לצמצם את זיהום אריתרוציטים. השימוש ניתוק או?...

<table width="200" border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> Lysing ACK חיץ </td><td> Invitrogen </td><td> D6-0005DG </td><td></td></tr><tr><td> אנטי עכבר CD11c (HL3) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 5580979 </td><td> PE-Cy7 מצומדות </td></tr><tr><td> אנטי עכבר IA / IE (269) </td><td> BD-Pharmingen </td><td> 553623 </td><td> מצומדות FITC </td></tr><tr><td> Collangenase סוג 1A </td><td> סיגמא </td><td> 9891-500mg </td><td></td></tr><tr><td> תא strainers </td><td> BD פלקון </td><td> 352340, 352360 </td><td></td></tr><tr><td> CD11c (N418) microbeads </td><td> Miltenyi </td><td> 130-052-001 </td><td></td></tr><tr><td> אני DNase </td><td> סיגמא </td><td> D5025-150KU </td><td></td></tr><tr><td> האנק של פתרון מאוזן מלח </td><td> Invitrogen </td><td> 14170 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes פתרון חיץ </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> צלחות פטרי 60 מ&quot;מ </td><td> BD פלקון </td><td> 351016 </td><td></td></tr><tr><td> GentleMACS ™ C צינורות </td><td> Miltenyi </td><td> 130-093-237 </td><td></td></tr><tr><td> Dissociator MACS עדין </td><td> Miltentyi </td><td> 130-093-235 </td><td></td></tr><tr><td> AutoMACS-Pro ™ </td><td> Miltenyi </td><td> 130-092-545 </td><td></td></tr><tr><td> FASCS Aria </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr></table>

isolation of mouse lung dendritic cells

תאים דנדריטים ריאות (DC) לשחק תפקיד מהותי חישה הפולש 1,2 פתוגנים כמו גם בשליטה על התגובות tolerogenic 3 בדרכי הנשימה. לפחות שלושה תת העיקרי של התאים הדנדריטים ריאות תוארו בעכברים: DC קונבנציונלי (CDC) 4, plasmacytoid DC (PDC) 5 ו IFN-בהפקת הרוצח DC (IKDC) 6,7. משנה ה-CDC היא משנה DC הבולטים הריאה 8. סמן משותף ידוע לזהות תת DC היא CD11c, סוג אני הטרנסממברני integrin (β2) אשר באה לידי ביטוי גם על מונוציטים, מקרופאגים, נויטרופילים חלק מתאי B 9. ברקמות מסוימות, באמצעות CD11c כסמן העכבר לזהות DC תקף, כמו הטחול, שם רוב התאים + CD11c לייצג את קבוצת המשנה CDC המבטא רמות גבוהות של הגדולים מורכבים histocompatibility מחלקה II (MHC-II). עם זאת, הריאה היא רקמה הטרוגנית יותר להיות שםצד תת DC, יש אחוז גבוה של האוכלוסייה תא ברורים המבטא רמות גבוהות של CD11c התקף רמות נמוכות של MHC-II. בהתבסס על האפיון שלה בעיקר על ביטויו של F4/80, סמן macrophage הטחול, היי CD11c MHC-II תא lo האוכלוסייה ריאות זוהה מקרופאגים ריאתי 10 ולאחרונה, כמבשר פוטנציאל DC 11. בניגוד עכבר PDC, ללמוד את התפקיד הספציפי של ה-CDC בתגובה החיסונית ריאתי הוגבל בשל היעדר של סמן מסוים שיכול לעזור בבידוד של תאים אלה. לכן, בעבודה זו אנו מתארים הליך לבודד מטוהרים עכבר ריאות CDC. הבידוד של ריאתי תת DC מייצג כלי מאוד שימושי כדי לקבל תובנות לתוך הפונקציה של תאים אלה בתגובה פתוגנים בדרכי הנשימה, כמו גם גורמים סביבתיים שיכולים לעורר את התגובה החיסונית לארח בריאה.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells at JoVE.com

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

הכנה מטוהרים של ריאות תאים דנדריטים עכבר מתואר. דגש ספציפי ניתנת הבידוד של תת קונבנציונאלי תאים דנדריטים.

בידוד של ריאות תאים דנדריטים עכבר

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

28.9K Views.  Louisiana State University. הכנה מטוהרים של ריאות תאים דנדריטים עכבר מתואר. דגש ספציפי ניתנת הבידוד של תת קונבנציונאלי תאים דנדריטים.

Video: Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal tract and other viscera. It harbors a number of immune cells including macrophages, B cells and T cells. The presence of a high number of na&iuml;ve macrophages in the peritoneal cavity makes it a preferred site for the collection of na&iuml;ve tissue resident macrophages (1). The peritoneal cavity is also important to the study of B cells because of the presence of a unique peritoneal cavity-resident B cell subset known as B1 cells in addition to conventional B2 cells. B1 cells are subdivided into B1a and B1b cells, which can be distinguished by the surface expression of CD11b and CD5. B1 cells are an important source of natural IgM providing early protection from a variety of pathogens (2-4). These cells are autoreactive in nature (5), but how they are controlled to prevent autoimmunity is still not understood completely. On the contrary, CD5+ B1a cells possess some regulatory properties by virtue of their IL-10 producing capacity (6). Therefore, peritoneal cavity B1 cells are an interesting cell population to study because of their diverse function and many unaddressed questions associated with their development and regulation. The isolation of peritoneal cavity resident immune cells is tricky because of the lack of a defined structure inside the peritoneal cavity. Our protocol will describe a procedure for obtaining viable immune cells from the peritoneal cavity of mice, which then can be used for phenotypic analysis by flow cytometry and for different biochemical and immunological assays.

The peritoneal cavity in mammals contains different immune cell populations crucial for innate immune responses. An efficient isolation method is required for biochemical and functional analyses of these cells. Here we provide a comprehensive method for the isolation of peritoneal cavity cells in the mouse.

בידוד של תאים עכבר פריטוניאלית חלל

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and food antigens while concomitantly remaining poised to mount inflammatory responses toward invasive pathogens1,2. Antigen presenting cells, particularly DCs and macrophages, play critical roles in maintaining intestinal immune homeostasis via their ability to sense and appropriately respond to the microbiota3-14. Efficient isolation of intestinal DCs and macrophages is a critical step in characterizing the phenotype and function of these cells. While many effective methods of isolating intestinal immune cells, including DCs and macrophages, have been described6,10,15-24, many rely upon long digestions times that may negatively influence cell surface antigen expression, cell viability, and/or cell yield. Here, we detail a methodology for the rapid isolation of large numbers of viable, intestinal DCs and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is carried out by directly staining isolated intestinal cells with specific fluorescence-labeled monoclonal antibodies for multi-color flow cytometric analysis. Furthermore, highly pure DC and macrophage populations are isolated for functional studies utilizing CD11c and CD11b magnetic-activated cell sorting beads followed by cell sorting.

Here, we detail a methodology for the rapid isolation of mouse intestinal dendritic cells (DCs) and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is performed using multi-color flow cytometric analysis while magnetic bead enrichment followed by cell sorting is used to yield highly pure populations for functional studies.

בידוד ואיפיון של תאים דנדריטים ומקרופגים מהמעי עכבר

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

בידוד של תאי מיאלואידית דנדריטים ותאי האפיתל מקורנית האדם

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

שיטת תשואה יעילה גבוהה עבור בידוד של תת תא העכבר דנדריטים

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

מיון תא מופעל קרינה עבור טיהור של תאי דנדריטים Plasmacytoid ממח עצם העכבר

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

דור של תאי דנדריטים אדם נגזר מונוציטים מן הדם מלא

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases. 
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays. 
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Here, we describe the purification of Legionella pneumophila (L. pneumophila) outer membrane vesicles (OMVs) from liquid cultures. These purified vesicles are then used for the treatment of macrophages to analyze their pro-inflammatory potential.

הלגיונלה pneumophila החיצון ממברנה שלפוחית: בידוד ניתוח של פוטנציאל פרו-דלקתיים שלהם על המקרופאגים

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Human Lung Dendritic Cells: Spatial Distribution and Phenotypic Identification in Endobronchial Biopsies Using Immunohistochemistry and Flow Cytometry

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In order to maintain tolerance or to induce an immune response, the immune system must appropriately handle inhaled antigens. Lung dendritic cells (DCs) are essential in maintaining a delicate balance to initiate immunity when required without causing collateral damage to the lungs due to an exaggerated inflammatory response. While there is a detailed understanding of the phenotype and function of immune cells such as DCs in human blood, the knowledge of these cells in less accessible tissues, such as the lungs, is much more limited, since studies of human lung tissue samples, especially from healthy individuals, are scarce. This work presents a strategy to generate detailed spatial and phenotypic characterization of lung tissue resident DCs in healthy humans that undergo a bronchoscopy for the sampling of endobronchial biopsies. Several small biopsies can be collected from each individual and can be subsequently embedded for ultrafine sectioning or enzymatically digested for advanced flow cytometric analysis. The outlined protocols have been optimized to yield maximum information from small tissue samples that, under steady-state conditions, contain only a low frequency of DCs. While the present work focuses on DCs, the methods described can directly be expanded to include other (immune) cells of interest found in mucosal lung tissue. Furthermore, the protocols are also directly applicable to samples obtained from patients suffering from pulmonary diseases where bronchoscopy is part of establishing the diagnosis, such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD), sarcoidosis, or lung cancer.

Lung-resident immune cells, including dendritic cells (DCs) in humans, are critical for defense against inhaled pathogens and allergens. However, due to the scarcity of human lung tissue, studies are limited. This work presents protocols to process human mucosal endobronchial biopsies for studying lung DCs using immunohistochemistry and flow cytometry.

האדם תאים דנדריטים ריאות: הפריסה המרחבית וזיהוי פנוטיפי ב Endobronchial ביופסיות שימוש אימונוהיסטוכימיה ו cytometry זרימה

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In ...

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for quantitative analysis of cell surface proteins on immune cells, but it provides no information on the localization and migration patterns of these cells within the lung. Similarly,&#160;chemotaxis assays can be performed to study the potential of cells to respond to chemotactic factors in vitro, but these assays do not reproduce the complex environment of the intact lung. In contrast to these aforementioned techniques, the location of individual cell types within the lung can be readily visualized by generating Precision-cut Lung Slices (PCLS), staining them with commercially available, fluorescently tagged antibodies, and visualizing the sections by confocal microscopy. PCLS can be used for both live and fixed lung tissue, and the slices can encompass areas as large as a cross section of an entire lobe. We have used this protocol to successfully visualize the location of a wide variety of cell types in the lung, including distinct types of dendritic cells, macrophages, neutrophils, T cells and B cells, as well as structural cells such as lymphatic, endothelial, and epithelial cells. The ability to visualize cellular interactions, such as those between dendritic cells and T cells, in live, three-dimensional lung tissue, can reveal how cells move within the lung and interact with one another at steady state and during inflammation. Thus, when used in combination with other procedures, such as flow cytometry and quantitative PCR, PCLS can contribute to a comprehensive understanding of cellular events that underlie allergic and inflammatory diseases of the lung.

We describe a method for generating Precision-cut Lung Slices (PCLS) and immunostaining them to visualize the localization of various immune cell types in the lung. Our protocol can be extended to visualize the location and function of many different cell types under a variety of conditions.

Precision-לחתוך פרוסות ריאת עכבר לדמיין תאי דנדריטים ריאה חיים

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...

Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low numbers of DCs present per tissue. Yet, as the phenotype and function of DCs is modified by the tissue environment, it is necessary to analyze tissue resident DC populations, since blood derived DCs incompletely reflect the complexities of DCs in tissues. Here we present a protocol to isolate DCs from the human female reproductive tract (FRT) using hysterectomy specimens that allows both phenotypical and functional analyses. The protocol consists of tissue digestion to generate a single cell mixed cell suspension, followed by positive magnetic bead selection. Our tissue digestion protocol does not cleave surface markers, which allows phenotypical and functional analysis of DCs in the steady state, without overnight incubation or cell activation. This protocol can be adapted for the isolation of other immune cell types or isolation of DCs from other tissues.

We describe here a method to isolate and purify dendritic cells from different anatomical compartments in the human female reproductive tract for the evaluation of their phenotypical and functional characteristics. This method can be adapted to isolate other immune cells or dendritic cells from other mucosal tissues.

בידוד של תאים דנדריטים האדם באיברי הרבייה הנקביים ללימודי פנוטיפיות שהיו קיימות בעבר ופונקציונלי

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low ...