نود أن نشكر روبن ناي (المركز الطبي لجامعة تافتس) ، ودانا اوشيمورا تومويا كيرنز (جامعة تافتس) لتقديم المساعدة في تخزين السائل الزليلي والطرد المركزي. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (1R01AR059106 - 01A1) لLZ

نظام 3D لغضروفية زراعة مفصلي الإنسان في السائل الزليلي في هذا العمل ، ونحن مغلفة غضروفية مفصلي الإنسان في الخرز باستخدام الجينات المعدلة صناعة التغليف ، واقترح البروتوكول (Lonza ، و 31). تستخدم هذه التركيبات 3D ، وقد وضعنا نظاما لزراعة الخلايا في مستنبت تحتوي على نسب مختلفة من السائل الزليلي الإنسان وقيم وثوابت هذه 3D للتعبير الجين الغضروف. 1. إعداد غضروفية مفصلي الإنسان (HAC) لتغليف (3D) ثلاثية الأبعاد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد قارورة (1 مل) من غضروفية مفصلي الإنسان (HAC) (Lonza) (الممر 2) في 37 درجة مئوية لمدة حمام ماء 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع مزيج من وسائط النمو 1ml خلية غضروفية (Lonza) والطرد المركزي في 3000 دورة في الدقيقة لمدة 3-5 دقيقة لجمع الخلايا. تجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه Resuspend خلية خلية غضروفية النمو في وسائل الإعلام (Lonza). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلايا في نسيج اللوحة 10 سملوحة الثقافة دينار بحريني (العلوم البيولوجية) ، والثقافة في وسائل الإعلام نمو خلية غضروفية (Lonza) حتى الخلايا متموجة. متلازمة الطفل المفرط النشاط ينبغي أن تستخدم في عدد لا يزيد مرور 3 أو 4 (P3 أو P4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل متلازمة الطفل المفرط النشاط على لوحة مع 155mM كلوريد الصوديوم بدلا من معيار PBS ، تليها trypsinzation لجمع الخلايا لتغليف ألجينات حبة. حالما يتم فصل الخلايا ، وتدور إلى أسفل الخلايا في 3000rpm ل5min. الخلايا هي الآن جاهزة للتغليف 3D. </li></ol> 2. متلازمة الطفل المفرط النشاط في تغليف حبات 3D Resuspend ومتلازمة الطفل المفرط النشاط في حل ألجينات 1.2 ٪ (سيغما) في كثافة 8X10 5 خلية / مل. وتم تحديد أعداد الخلايا قبل التغليف ، وذلك باستخدام عداد الخلية القياسية. من المهم جدا أن يختلط جيدا لضمان توزيع عادل للخلايا في الخرز. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة للHAC / الجيني خليط المحلول إلى 12 مل حقنة المرفقة إبرة عيار 22 (تايكو الرعاية الصحية ، وشركة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفي الوقت نفسه ، تعد الدورق 50 مل مع 102 مM CaCl 2 في حجم 5 مرات من الحل HAC / aginate. وضع قضيب تحريك داخل الدورق ويحرك 102 مم 2 CaCl حل ببطء (على ما يقرب من 150 دورة في الدقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد قمة حقنة حوالي 6 بوصات فوق سطح الحل 2 CaCl وإضافة خليط HAC / الجينات في حل قطرة قطرة CaCl 2. بشكل عام ، والخرز ألجينات الناتجة 2mm وقطرها مع كثافة التغليف حوالي 10 4 خلية / حبة. ملاحظة : ارتفاع المحقنة خلال حل 2 CaCl هو المهم. وسوف أقصر مسافة نتيجة انخفاض المسيل للدموع في شكل بدلا من الخرز على شكل كروي ، مما تسبب في تفاوت السلامة الميكانيكية والتغليف الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اسمحوا حبات ضجة في حل 2 CaCl عن 20-25 دقيقة. في حين أن غيرها بروتوكولات التغليف ألجينات تشير إلى وجود فترة حضانة أقصر بكثير من 10min ، وجدنا أن أطول فترة حضانة مع الحل 2 CaCl تعزيز سلامة أنالإعلانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة CaCl 2 الحل ، تغسل حبات 2-3 مرات في غضون 2-3 مجلدات من كلوريد الصوديوم ، ومن ثم مرة واحدة في المتوسط ​​تمايز خلية غضروفية (Lonza). في حين أن غيرها بروتوكولات ألجينات تغليف حبة تنطوي على استخدام عامل تصفية لغسل الإجراءات المذكورة أعلاه ، وجدنا أن حبات الجينات غالبا ما تصبح المحاصرين في تصفية خارج وجاف ، وبالتالي تقليل كفاءة التغليف. وجدنا أنه الأكثر كفاءة للسماح حبات ليستقر في قاع الكأس قبل رميه الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملعقة القياسية لنقل الخرز إلى أطباق الثقافة. نحن ثقافة عادة 12 حبات في 3 سم جيدا لمدة 2 يوما في المتوسط ​​نمو خلية غضروفية غضروفية للسماح للتكيف مع عملية التغليف في الأجلين المتوسط ​​وتزرع في التحول إلى متوسطة قبل تمايز خلية غضروفية (Lonza) مع السائل الزليلي. </li></ol> 3. غضروفية الثقافة في السائل الزليلي مستنبت <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن الحصول على السائل الزليلي جديدة من سعيادة utpatient (حصلنا السائل الزليلي من المركز الطبي لجامعة تافتس). ويمكن نقل السائل الزليلي في أنابيب الصقر 15ml إلى المختبر ، وطرد على الفور في 3000 دورة في الدقيقة لإزالة الحطام 15min الخلية. قسامة خالية من الخلايا في السائل الزليلي 1.5 أنابيب microcentrifuge مل ، لتجنب تكرار تجميد الذوبان. ويمكن تخزين طاف على -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل زراعة ، مزيج السائل الزليلي المتوسطة مع تمايز خلية غضروفية (آلية التنمية النظيفة ، Lonza) في نسب متفاوتة الحجمي ، مع التركيز المستمر من حامض الاسكوربيك و100mM 9 ملم CaCl 2 (هذا المبلغ اثر CaCl 2 هو لضمان سلامة الجينات الخرز). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على لوحة على منصة هزاز في الحاضنة 37 درجة مئوية (تردد الهزاز : حوالي 75 مرة / دقيقة) للمساعدة في توزيع المواد الغذائية داخل حبات الجينات ، والحد من التثاقل من الخرز. هذا مهم خصوصا ونحن ثقافة هذه غضروفية لفترة ممتدة من الزمن (تصل إلى 4 أسابيع). مذكرة: على الرغم من النمو خلية غضروفية وسائل الإعلام التمايز (Lonza) تحتوي على اثنين استخداما المضادات الحيوية والجنتاميسين الأمفوتريسين ، فإننا لم يكمل أي المضادات الحيوية عندما كنا مئوية مختلفة من السائل الزليلي لزراعة خلية غضروفية. ولوحظ عدم وجود تلوث من أي وقت مضى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير وسائل الاعلام كل يوم مخاليط 2-3. وقد لزوجة السائل الزليلي عقبة رئيسية في زراعة غضروفية حبات مغلفة في الجينات خلال فترة طويلة الأجل الثقافات. وجدنا أنه الأكثر فاعلية لتخفيف السائل الزليلي ، تستكمل المتوسطة مع CaCl 102mM 2 (50 ٪ V / V) ، الذي يعزز أيضا سلامة من الخرز الجينات. في هذه الطريقة ، ببطء وسيلة يمكن إزالتها مع الماصة ، دون الإضرار الخرز. </li></ol> 4. متلازمة الطفل المفرط النشاط الحصاد في الخرز الجينات لتحليل التعبير الجيني يجب توخي الحذر خاصة عند حصاد متلازمة الطفل المفرط النشاط من الخرز الجينات لتحليل التعبير الجيني. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل حبات ألجينات تي 3MES في CaCl 102 2 ملي لنحو 5 دقائق في كل مرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استرداد غضروفية بإضافة 55 ملم على NaCitrate حجم 4-5 مرات من الخرز. فمن المهم أن يغرقها حبات الجينات في حل NaCitrate. اهتزاز أو الروك لمدة 20-30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار تجاهل الخلايا وطاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لRT - PCR التحليل ، resuspend الكرية خلية في المخزن تحلل الخلية (RNA Qiagen العزلة عدة) ، والمضي قدما في تنقية الحمض النووي الريبي. </li></ol> 5. متلازمة الطفل المفرط النشاط في الإصلاح الخرز الجينات لتحليل النسيجي الرعاية الخاصة التي يجب اتخاذها لجني متلازمة الطفل المفرط النشاط من الخرز للتحليل النسيجي 3D. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل حبات ألجينات 3 مرات في 102 ملي CaCl 2 للمرة كل حوالي 5 دقائق. لغسل بعيدا تماما السائل اللزج الزليلي ، وجدنا أنها الأكثر فعالية لغسل المتوسطة مع تمايز خلية غضروفية (Lonza) بين عشية وضحاها ، التأرجح في الحاضنة 37 درجة مئوية تردد هزاز (: نحو 75 مرةق / دقيقة). تم استخدام متوسط ​​نمو خلية غضروفية لضمان بقاء خلية غضروفية في هذا يغسل طويلة والسماح للتغلغل الحد الأقصى للعامل اصلاح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح حبات في الايثانول 70 ٪ بين عشية وضحاها ، والمضي قدما في التحليل النسيجي. لأداء تلوين دابي ، احتضان حبات ألجينات مع الحل دابي (500ng/ml) ل1hr تحت هزاز لطيف ، ويغسل لمدة 3 مرات مع 102mM CaCl 2 لمدة 15 دقيقة كل مرة. ويمكن بعد ذلك أن ينظر إلى الصور دابي تحت المجهر الفلورسنت. يمكن أيضا أن يكون مقطوع الخرز الأزرق لalcian و H &amp; E تلطيخ. </li></ol> 6. ممثل النتائج ويصور لنا طريقة لزراعة 3D غضروفية الإنسان في نسب عالية من السائل الزليلي في الرسم التخطيطي هو مبين في Fig.1. بعد أن تم تغليف حبات غضروفية الإنسان في الجينات ، وسمح لهم تنمو في المتوسط ​​تستكمل مع تفاوت النسب من السائل الزليلي. بسبب لزوجة السائل الزليلي ، فمن الضروريغضروفية الثقافة في ظل ظروف هزاز ثابت لمنع تكتل ليبني الغضروف وضمان عدالة توزيع المواد الغذائية. ومن الضروري أيضا أن تغسل حبات الجينات على نطاق واسع قبل استرداد غضروفية ، بحيث تحدد أو تحلل العازلة يمكن ان تخترق الخرز (Fig.1). وتظهر مشرق الميدان (BF) صور غضروفية في الخرز ألجينات في Fig.2. تم تنفيذ تلوين دابي لتأكيد توزيع usniform من الخلايا داخل الخرز (الشكل 2). في نهاية الفترة الثقافة 21 يوما ، تم إجراء تحليل الجينات التعبير qRT - PCR. تم استخدام الجينات GAPDH مرجعية للتطبيع لجميع تقارير إتمام المشروعات ، كما تم تحديده ليكون واحدا من الجينات المرجعية الأكثر موثوقية لتحليل qPCR على غضروفية 32. ويرد مثال في الشكل. 3 ، حيث قمنا بتحليل النتائج من غضروفية مفصلي الإنسان المثقف في السائل الزليلي المجمعة من ستة مرضى هشاشة العظام. يتسق مع حقيقة أن من غضروفيةوجدنا وقد تم توسيع Lonza 2D في الثقافات ، والذي من شأنه أن يؤدي حتما إلى إلغاء التمايز 33 ، أن يوم 0 غضروفية أعرب مستويات أدنى من الجينات الغضروف مصفوفة (الشكل 3). زراعة 3D من غضروفية المتوسطة مع تمايز خلية غضروفية (Lonza) أو المتوسطة تستكمل مع السائل الزليلي زيادة كبيرة في التعبير الجيني للغضروف الكولاجين ، وaggrecan MMP13 ، الذي يشير إلى خلية غضروفية إعادة التمايز بحلول يوم 21 (Fig.3) 34. زيادة نسبة السائل الزليلي في وسائل الإعلام أدت إلى مستويات مماثلة من مصفوفة الغضروف الثاني الكولاجين وعلامات aggrecan التعبير مرنا (Fig.3A و3B). علاوة على ذلك ، غضروفية مثقف في السائل الزليلي 100 ٪ معارضها حتى انخفاضا في التعبير الغضروف انزيم المهينة مرنا MMP13 بالمقارنة مع أولئك المثقفين في حدها المتوسط ​​(Fig.3C). ومن المثير للاهتمام ، ومستوى التعبير عن موت الخلايا caspase المؤشر 3 انخفضت تدريجيا مع زيادة نسبة السائل الزليلي ، مما يوحي بأن لياليوقد أدى ynovial زراعة السائل إلى مستويات الخلايا انخفض (الشكل 3D). لذلك ، نتائجنا تظهر ان زراعة غضروفية مفصلي الإنسان في مستويات عالية من السائل الزليلي في وضع 3D هي التكنولوجيا ممكنا. جداول وأرقام <img alt="الشكل 1." src="/files/ftp_upload/3587/3587fig1.jpg" /> الشكل 1. رسم تخطيطي لطريقة لغضروفية الثقافة مفصلي الإنسان في نسب عالية من السائل الزليلي في الخرز ألجينات 3D. أولا ، يتم خلط الجينات غضروفية والحل. عندما يطبق الانقطاع عن الحكمة في حل CaCl 2 ، وثبتوا غضروفية داخل حبات crosslinked هيدروجيل الكالسيوم وألجينات. ثم يتم تربيتها في هذه التركيبات 3D المتوسط ​​تمايز خلية غضروفية (Lonza) مع تفاوت النسب من السائل الزليلي الإنسان. بعد 21 يوما من زراعة تحت شرط هزاز ، تغسل حبات الجينات التي تحتوي على الخلايا على نطاق واسع بعد ذلك يتم استرجاع الخلايا للجيناتتحليل التعبير. <img alt="الشكل 2." src="/files/ftp_upload/3587/3587fig2.jpg" /> الشكل 2. مجال برايت (BF) والصور دابي لل chondrocytes مفصلي الثقافات البشرية مغلفة مع 0 ٪ ، 30 ٪ ، 50 ٪ ، 70 ٪ و 100 ٪ السائل الزليلي. وكانت غضروفية كروية الشكل في جميع الأحوال الثقافة. وكانت صور متراكبة من حقل مشرق (BF) ودابي لتأكيد الموقع وتوزيع غضروفية. Insets والصور المكبرة. النصال ، colocalization من غضروفية في BF والصور تلطيخ دابي. <img alt="الشكل 3." src="/files/ftp_upload/3587/3587fig3.jpg" /> الشكل 3. qRT - PCR تحليل مغلفة غضروفية مفصلي الإنسان في اليوم 0 (D0) بعد نهاية 21 يوما من زراعة (D21) في المتوسط ​​تستكمل مع نسب متفاوتة من السائل الزليلي (SF) (0 ٪ ، 30 ٪ ، 50 ٪ ، 70 ٪ و 100 ٪). وتظهر نتائج أربع عينات المستقلة هنا. كان يستخدم كمرجع GAPDH الداخلية لجميع تقارير إتمام المشروعات. <strاونج&gt; A. الكولاجين التعبير مرنا الثاني باء. Aggrecan التعبير مرنا. C. MMP13 التعبير مرنا. D. Caspase التعبير مرنا 3. تم تقييم أهمية الإحصائية ليوم 0 عينات ونماذج من يوم 21 0 ٪ و 100 ٪ السائل الزليلي (SF) زراعة ، وذلك باستخدام برامج المعهد الوطني للإحصاء. * ترمز P &lt;0.05.

<ol>
	<li>Centers for Disease Control and P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projected+state-specific+increases+in+self-reported+doctor-diagnosed+arthritis+and+arthritis-attributable+activity+limitations--United+States,+2005-2030.">Projected state-specific increases in self-reported doctor-diagnosed arthritis and arthritis-attributable activity limitations--United States, 2005-2030.</a> MMWR. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 56, 423-425 (2007).</li><li>Theis, K. A., Murphy, L., Hootman, J. M., Helmick, C. G., Yelin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+correlates+of+arthritis-attributable+work+limitation+in+the+US+population+among+persons+ages+18-64:+2002+National+Health+Interview+Survey+Data.">Prevalence and correlates of arthritis-attributable work limitation in the US population among persons ages 18-64: 2002 National Health Interview Survey Data.</a> Arthritis Rheum. 57, 355-363 (2007).</li><li>Chung, C., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+cartilage+tissue.">Engineering cartilage tissue.</a> Adv. Drug. Deliv. Rev. 60, 243-262 (2008).</li><li>Glowacki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+engineering+of+cartilage.">In vitro engineering of cartilage.</a> J. Rehabil. Res. Dev. 37, 171-177 (2000).</li><li>Chokalingam, K., Hunter, S. A., Gooch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D-In+vitro+Effects+of+Compression+and+Time+in+Culture+on+Aggregate+Modulus+and+on+Gene+Expression+and+Protein+content+of+Collagen+Type+II+in+Murine+Chondrocytes.">3D-In vitro Effects of Compression and Time in Culture on Aggregate Modulus and on Gene Expression and Protein content of Collagen Type II in Murine Chondrocytes.</a> Tissue Eng. Part A. , (2009).</li><li>Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+tissue+engineering:+the+role+of+biomechanics.">Functional tissue engineering: the role of biomechanics.</a> J. Biomech. Eng. 122, 570-575 (2000).</li><li>Goldring, M. B., Goldring, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis.">Osteoarthritis.</a> J. Cell. Physiol. 213, 626-634 (2007).</li><li>Zvaifler, N. J., Firestein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines+in+chronic+inflammatory+synovitis.">Cytokines in chronic inflammatory synovitis.</a> Scand. J. Rheumatol. Suppl. 76, 203-210 (1988).</li><li>Rhee, D. K., Marcelino, J., Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secreted+glycoprotein+lubricin+protects+cartilage+surfaces+and+inhibits+synovial+cell+overgrowth.">The secreted glycoprotein lubricin protects cartilage surfaces and inhibits synovial cell overgrowth.</a> J. Clin. Invest. 115, 622-631 (2005).</li><li>Campo, G. M., Avenoso, A., Nastasi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan+reduces+inflammation+in+experimental+arthritis+by+modulating+TLR-2+and+TLR-4+cartilage+expression.">Hyaluronan reduces inflammation in experimental arthritis by modulating TLR-2 and TLR-4 cartilage expression.</a> Biochim. Biophys. Acta. , (2011).</li><li>van de Lest, C. H., van den Hoogen, B. M., van Weeren, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loading-induced+changes+in+synovial+fluid+affect+cartilage+metabolism.">Loading-induced changes in synovial fluid affect cartilage metabolism.</a> Biorheology. 37, 45-55 (2000).</li><li>Saxne, T., Heinegard, D., Wollheim, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+arthritic+synovial+fluid+influences+proteoglycan+biosynthesis+and+degradation+in+organ+culture+of+bovine+nasal+cartilage.">Human arthritic synovial fluid influences proteoglycan biosynthesis and degradation in organ culture of bovine nasal cartilage.</a> Coll. Relat. Res. 8, 233-247 (1988).</li><li>Lee, D. A., Salih, V., Stockton, E. F., Stanton, J. S., Bentley, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+normal+synovial+fluid+on+the+metabolism+of+articular+chondrocytes+in+vitro.">Effect of normal synovial fluid on the metabolism of articular chondrocytes in vitro.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. , 228-238 (1997).</li><li>Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrocyte+nonresponsiveness+to+insulin-like+growth+factor+1+in+experimental+arthritis.">Chondrocyte nonresponsiveness to insulin-like growth factor 1 in experimental arthritis.</a> Arthritis Rheum. 32, 894-900 (1989).</li><li>Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van Wyk, J. J., van de Putte, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-like+growth+factor+stimulation+of+chondrocyte+proteoglycan+synthesis+by+human+synovial+fluid.">Insulin-like growth factor stimulation of chondrocyte proteoglycan synthesis by human synovial fluid.</a> Arthritis Rheum. 32, 66-71 (1989).</li><li>Joosten, L. A., Schalkwijk, J., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrocyte+unresponsiveness+to+insulin-like+growth+factor-1.+A+novel+pathogenetic+mechanisms+for+cartilage+destruction+in+experimental+arthritis.">Chondrocyte unresponsiveness to insulin-like growth factor-1. A novel pathogenetic mechanisms for cartilage destruction in experimental arthritis.</a> Agents Actions. 26, 193-195 (1989).</li><li>Schuerwegh, A. J., Dombrecht, E. J., Stevens, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synovial+fluid+and+peripheral+blood+immune+complexes+of+patients+with+rheumatoid+arthritis+induce+apoptosis+in+cytokine-activated+chondrocytes.">Synovial fluid and peripheral blood immune complexes of patients with rheumatoid arthritis induce apoptosis in cytokine-activated chondrocytes.</a> Rheumatol. Int. 27, 901-909 (2007).</li><li>Hegewald, A. A., Ringe, J., Bartel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+acid+and+autologous+synovial+fluid+induce+chondrogenic+differentiation+of+equine+mesenchymal+stem+cells:+a+preliminary+study.">Hyaluronic acid and autologous synovial fluid induce chondrogenic differentiation of equine mesenchymal stem cells: a preliminary study.</a> Tissue Cell. 36, 431-438 (2004).</li><li>Xu, Q. R., Dong, Y. H., Chen, S. L., Bao, C. D., Du, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degeneration+of+normal+articular+cartilage+induced+by+late+phase+osteoarthritic+synovial+fluid+in+beagle+dogs.">Degeneration of normal articular cartilage induced by late phase osteoarthritic synovial fluid in beagle dogs.</a> Tissue Cell. 41, 13-22 (2009).</li><li>Kruger, J. P., Endres, M., Neumann, K., Haupl, T., Erggelet, C., Kaps, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+differentiation+of+human+subchondral+progenitor+cells+is+impaired+by+rheumatoid+arthritis+synovial+fluid.">Chondrogenic differentiation of human subchondral progenitor cells is impaired by rheumatoid arthritis synovial fluid.</a> J. Orthop. Res. 28, 819-827 (2010).</li><li>Steinhagen, J., Bruns, J., Niggemeyer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion+culture+system:+Synovial+fibroblasts+modulate+articular+chondrocyte+matrix+synthesis+in+vitro.">Perfusion culture system: Synovial fibroblasts modulate articular chondrocyte matrix synthesis in vitro.</a> Tissue Cell. 42, 151-157 (2010).</li><li>Yang, K. G., Saris, D. B., Verbout, A. J., Creemers, L. B., Dhert, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+synovial+fluid+from+injured+knee+joints+on+in+vitro+chondrogenesis.">The effect of synovial fluid from injured knee joints on in vitro chondrogenesis.</a> Tissue Eng. 12, 2957-2964 (2006).</li><li>Skoog, V., Widenfalk, B., Ohlsen, L., Wasteson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+growth+factors+and+synovial+fluid+on+chondrogenesis+in+perichondrium.">The effect of growth factors and synovial fluid on chondrogenesis in perichondrium.</a> Scand. J. Plast. Reconstr. Surg. Hand. Surg.. 24, 89-95 (1990).</li><li>Nuver-Zwart, I., Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+synovial+fluid+and+synovial+fluid+cells+on+chondrocyte+metabolism+in+short+term+tissue+culture.">Effects of synovial fluid and synovial fluid cells on chondrocyte metabolism in short term tissue culture.</a> J. Rheumatol. 15, 210-216 (1988).</li><li>Beekhuizen, M., Bastiaansen-Jenniskens, Y. M., Koevoet, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritic+synovial+tissue+inhibits+proteoglycan+production+in+human+osteoarthritic+cartilage;+Establishment+and+characterisation+of+a+long-term+coculture.">Osteoarthritic synovial tissue inhibits proteoglycan production in human osteoarthritic cartilage; Establishment and characterisation of a long-term coculture.</a> Arthritis Rheum. , (2011).</li><li>Rodrigo, J. J., Steadman, J. R., Syftestad, G., Benton, H., Silliman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+human+knee+synovial+fluid+on+chondrogenesis+in+vitro.">Effects of human knee synovial fluid on chondrogenesis in vitro.</a> Am. J. Knee. Surg. 8, 124-129 (1995).</li><li>van den Hoogen, B. M., van de Lest, C. H., van Weeren, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loading-induced+changes+in+synovial+fluid+affect+cartilage+metabolism.">Loading-induced changes in synovial fluid affect cartilage metabolism.</a> Br. J. Rheumatol. 37, 671-676 (1998).</li><li>Webb, G. R., Westacott, C. I., Elson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritic+synovial+fluid+and+synovium+supernatants+up-regulate+tumor+necrosis+factor+receptors+on+human+articular+chondrocytes.">Osteoarthritic synovial fluid and synovium supernatants up-regulate tumor necrosis factor receptors on human articular chondrocytes.</a> Osteoarthritis Cartilage. 6, 167-176 (1998).</li><li>Kook, S. H., Son, Y. O., Lee, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+affects+positively+the+proliferation+of+bovine+satellite+cells+and+their+myogenic+differentiation+through+up-regulation+of+MyoD.">Hypoxia affects positively the proliferation of bovine satellite cells and their myogenic differentiation through up-regulation of MyoD.</a> Cell. Biol. Int. 32, 871-878 (2008).</li><li>Knobloch, T. J., Madhavan, S., Nam, J., Agarwal, S., Agarwal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+chondrocytic+gene+expression+by+biomechanical+signals.">Regulation of chondrocytic gene expression by biomechanical signals.</a> Crit. Rev. Eukaryot. Gene. Expr. 18, 139-150 (2008).</li><li>Guo, J. F., Jourdian, G. W., MacCallum, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+growth+characteristics+of+chondrocytes+encapsulated+in+alginate+beads.">Culture and growth characteristics of chondrocytes encapsulated in alginate beads.</a> Connect. Tissue. Res. 19, 277-297 (1989).</li><li>Toegel, S., Huang, W., Piana, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+reliable+reference+genes+for+qPCR+studies+on+chondroprotective+action.">Selection of reliable reference genes for qPCR studies on chondroprotective action.</a> BMC. Mol. Biol. 8, 13-13 (2007).</li><li>Lin, Z., Fitzgerald, J. B., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiles+of+human+chondrocytes+during+passaged+monolayer+cultivation.">Gene expression profiles of human chondrocytes during passaged monolayer cultivation.</a> J. Orthop. Res. 26, 1230-1237 (2008).</li><li>Goessler, U. R., Bieback, K., Bugert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+chondrocytes+differentially+express+matrix+modulators+during+in+vitro+expansion+for+tissue+engineering.">Human chondrocytes differentially express matrix modulators during in vitro expansion for tissue engineering.</a> Int. J. Mol. Med. 16, 509-515 (2005).</li><li>Anat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 121, 107-118 (1976).</li></ol>

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

في هذا التقرير ، طورنا أسلوب الذي يسمح لثقافة غضروفية مفصلي الإنسان في بيئة 3D في المتوسط ​​يحتوي على تركيزات عالية من السائل الزليلي الإنسان. السائل الزليلي هو واحد من العناصر الرئيسية التي تشكل البيئة الطبيعية في تجويف مشتركة ، حيث يقيم غضروفية مفصلي. ومع ذلك ، فقد...

جدول محدد الكواشف والمعدات : <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><th> اسم الكاشف </th><th> شركة </th><th> كتالوج رقم </th><th> تعليقات </th></tr><tr><td> ألجينات (حمض الألجنيك ملح الصوديوم) </td><td> سيغما </td><td> A2158 - 250G </td><td> حل تخزين 2.4 ٪ عند 40 درجة مئوية </td></tr><tr><td> كلوريد الكالسيوم ثنائي الهيدرات ، محبب </td><td> JT بيكر </td><td> A19339 </td><td></td></tr><tr><td width="239" rowspan="2" > وسائل الإعلام مكون للغضروف النمو </td><td width="254" rowspan="2" > Lonza </td><td width="182" > CC - 3156 (قاعدة وسائل الإعلام) </td><td width="141" rowspan="2" ></td></tr><tr><td width="182" > CC - 4409 (تكملة) </td></tr><tr><td width="239" rowspan="2" > وسائل الإعلام التمايز مكون للغضروف </td><td width="254" rowspan="2" > Lonza </td><td width="182" > CC - 3226 (قاعدة وسائل الإعلام) </td><td width="141" rowspan="2" ></td></tr><tr><td width="182" > CC - 4408 (تكملة) </td></tr><tr><td> غضروفية مفصلي الإنسان </td><td> Lonza </td><td > CC - 2550 </td><td></td></tr><tr><td> دابي (4 &#39;،6 - Diamidino - 2 - phenylindole هيدروكلوريد) </td><td> سيغما الدريخ </td><td > D9542 </td><td></td></tr><tr><td> RNeasy مجموعة صغيرة (لاستخراج الحمض النووي الريبي) </td><td> Qiagen </td><td > 74104 </td><td></td></tr><tr><td> PCR الكواشف : SYBR الخضراء </td><td> كمات </td><td > 95053-500 </td><td></td></tr><tr><td> محقنة 12 مل </td><td> تايكو - كيندال Monoject </td><td > 512852 </td><td></td></tr><tr><td> 22 Gague إبرة تحت الجلد </td><td> تايكو - كندالL - Monoject </td><td > 8881 </td><td></td></tr><tr><td> مجهر </td><td> اوليمبوس </td><td > IX71 </td><td></td></tr><tr><td> منصة الروك </td><td> Thermoscientific thermolyne </td><td > فاري مزيج </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td ></td><td></td></tr><tr><td> تسلسل الاشعال </td><td></td><td ></td><td></td></tr><tr><td> الكولاجين الداخليين إلى الأمام </td><td> 5&#39; - TTC ATC CCC CCA TCT كاك AGT - 3 &#39; </td><td ></td><td></td></tr><tr><td> الكولاجين الداخليين والخلف </td><td> 5&#39; - CCTCTGCCTTGACCCGAA - 3 &#39; </td><td ></td><td></td></tr><tr><td> MMP13 إلى الأمام </td><td> 5&#39; - TGT دول مجلس التعاون الخليجي CTT CTT كاك ACA GAC ACT - 3 &#39; </td><td ></td><td></td></tr><tr><td> MMP13 والخلف </td><td> 5&#39; - AGC GAG TGA AGA CTT GTC ATT دول مجلس التعاون الخليجي 3 &#39; </td><td ></td><td></td></tr><tr><td> Caspase 3 إلى الأمام </td><td> 5&#39; - TCA TTA TTC AGG CCT دول مجلس التعاون الخليجي GTG GTA - 3 &#39; </td><td ></td><td></td></tr><tr><td> Caspase 3 العكسي </td><td> 5&#39; - TGG ATG شكيمة CAG AAC CCA TCC TTT -3 &quot; </td><td ></td><td></td></tr></table>

a 3d system for culturing human articular chondrocytes in synovial fluid

الغضروف التدمير هو سمة مركزية المرضية لالتهاب المفاصل ، وهو السبب الرئيسي للعجز في الولايات المتحدة. الغضروف في البالغين لا تتجدد بشكل فعال جدا في الجسم الحي ، ونتيجة لذلك ، يؤدي الى هشاشة العظام لا رجعة فيه فقدان الغضروف ويترافق الألم المزمن و1،2 الجمود. الغضروف هندسة الأنسجة إمكانات واعدة لتجديد واستعادة وظيفة الأنسجة. هذه التكنولوجيا عادة ما ينطوي على غضروفية البذر في السقالات الطبيعية أو الاصطناعية واستزراع 3D الناتجة بناء في وسط متوازن على مدى فترة من الزمن بهدف للهندسة الأنسجة كيميائيا وناضجة biomechanically التي يمكن زرعها في موقع الخلل في الجسم الحي 3-6 . تحقيق شرط الأمثل للنمو خلية غضروفية وترسب مصفوفة أمر ضروري لنجاح هندسة الأنسجة الغضروف. في الغضروف الأصلي مشتركة ، تجويف في القطب الشماليواستحم سطح جزيئية من العظام في السائل الزليلي. هذا السائل اللزج واضحة وتوفر المواد المغذية إلى الغضروف المفصلي لاوعائي ويحتوي على عوامل النمو ، والسيتوكينات والأنزيمات التي تعتبر مهمة لعملية الأيض 7،8 خلية غضروفية. علاوة على ذلك ، السائل الزليلي يسهل حركة منخفضة الاحتكاك بين الأسطح الغضروفية أساسا من خلال إفراز عنصرين رئيسيين ، وhyaluronan lubricin 9 10. في المقابل ، غالبا ما يتم تربيتها الغضروف الأنسجة المهندسة في وسائل اصطناعية. في حين أن وسائل الإعلام هذه على الأرجح قادرة على توفير ظروف أكثر تحديدا لدراسة الأيض خلية غضروفية ، السائل الزليلي أدق تعكس البيئة الطبيعية التي تتواجد فيها غضروفية مفصلي في الواقع ، السائل الزليلي لديها ميزة كونها سهلة للحصول على وتخزينها ، وكثيرا ما يمكن تجديدها بشكل منتظم من قبل الجسم. وقد استكملت عدة مجموعات في مستنبت مع السائل الزليلي في نمو الإنسان ، والأرانب والأبقار والكلاب جhondrocytes ، ولكنها تستخدم في الغالب سوى مستويات منخفضة من السائل الزليلي (أقل من 20 ٪) 11-25. في حين تم تربيتها الدجاج والخيول والإنسان غضروفية في المتوسط ​​مع ارتفاع نسبة السائل الزليلي ، وكانت هذه النظم ثقافة ثنائية الأبعاد 26-28. هنا نقدم أسلوبنا في غضروفية زراعة مفصلي الإنسان في نظام 3D مع نسبة عالية من السائل الزليلي (تصل إلى 100 ٪) خلال فترة 21 يوما. في القيام بذلك ، تغلبنا على عقبة رئيسية قدمها اللزوجة العالية من السائل الزليلي. هذا النظام يتيح إمكانية دراسة غضروفية الإنسان في السائل الزليلي في وضع 3D ، والتي يمكن دمجها مع عوامل أخرى الهامتين الأخرى (توتر الأوكسجين والتحميل الميكانيكية) 29،30 التي تشكل البيئة الطبيعية لغضروف لمحاكاة الوسط الطبيعي غضروف النمو. وعلاوة على ذلك ، يمكن أيضا أن يستخدم هذا النظام لمعايرة السوائل على النشاط الزلالي غضروفية وتوفير منبر للتطويرالغضروف تجديد التقنيات والخيارات العلاجية لالتهاب المفاصل.

Watch this Scientific Journal Video about A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid at JoVE.com

A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid

يوصف نظام 3D من غضروفية زراعة مفصلي الإنسان في مستويات عالية من السائل الزليلي. السائل الزليلي يعكس المكروية الطبيعية لمعظم الغضروف المفصلي ، ويمكن الحصول عليها بسهولة وتخزينها. هذا النظام بالتالي يمكن استخدامها لدراسة تجديد الغضاريف والتداوي الفرز لعلاج التهاب المفاصل.

ونظام 3D لغضروفية التثقيف مفصلي الإنسان في السائل الزليلي

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not ...

a-3d-system-for-culturing-human-articular-chondrocytes-synovial

Research

JoVE Journal

Biology

20.7K Views.  Tufts University School of Medicine. يوصف نظام 3D من غضروفية زراعة مفصلي الإنسان في مستويات عالية من السائل الزليلي. السائل الزليلي يعكس المكروية الطبيعية لمعظم الغضروف المفصلي ، ويمكن الحصول عليها بسهولة وتخزينها. هذا النظام بالتالي يمكن استخدامها لدراسة تجديد الغضاريف والتداوي الفرز لعلاج الته?...

Video: A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

نظام لخلايا الظهارية التثقيف صبغات قزحية عدسة لدراسة التجديد في نيوت

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

كفاءة اشتقاق السلائف القلب البشري وافرة القوة العضلية من خلايا المنشأ الجنينية البشرية التعريفي مع جزيء صغير

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

نظام ل<em&gt; خارج الجسم</em&gt; التثقيف البنكرياس الجنينية

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle

Internal organs such as the heart, brain, and gut develop left-right (LR) asymmetries that are critical for their normal functions1. Motile cilia are involved in establishing LR asymmetry in vertebrate embryos, including mouse, frog, and zebrafish2-6. These 'LR cilia' generate asymmetric fluid flow that is necessary to trigger a conserved asymmetric Nodal (TGF-&beta; superfamily) signaling cascade in the left lateral plate mesoderm, which is thought to provide LR patterning information for developing organs7. Thus, to understand mechanisms underlying LR patterning, it is essential to identify genes that regulate the organization of LR ciliated cells, the motility and length of LR cilia and their ability to generate robust asymmetric flow.
In the zebrafish embryo, LR cilia are located in Kupffer's vesicle (KV)2,4,5. KV is comprised of a single layer of monociliated epithelial cells that enclose a fluid-filled lumen. Fate mapping has shown that KV is derived from a group of ~20-30 cells known as dorsal forerunner cells (DFCs) that migrate at the dorsal blastoderm margin during epiboly stages8,9. During early somite stages, DFCs cluster and differentiate into ciliated epithelial cells to form KV in the tailbud of the embryo10,11. The ability to identify and track DFCs&mdash;in combination with optical transparency and rapid development of the zebrafish embryo&mdash;make zebrafish KV an excellent model system to study LR ciliated cells.
Interestingly, progenitors of the DFC/KV cell lineage retain cytoplasmic bridges between the yolk cell up to 4 hr post-fertilization (hpf), whereas cytoplasmic bridges between the yolk cell and other embryonic cells close after 2 hpf8. Taking advantage of these cytoplasmic bridges, we developed a stage-specific injection strategy to deliver morpholino oligonucleotides (MO) exclusively to DFCs and knockdown the function of a targeted gene in these cells12. This technique creates chimeric embryos in which gene function is knocked down in the DFC/KV lineage developing in the context of a wild-type embryo. To analyze asymmetric fluid flow in KV, we inject fluorescent microbeads into the KV lumen and record bead movement using videomicroscopy2. Fluid flow is easily visualized and can be quantified by tracking bead displacement over time.
Here, using the stage-specific DFC-targeted gene knockdown technique and injection of fluorescent microbeads into KV to visualize flow, we present a protocol that provides an effective approach to characterize the role of a particular gene during KV development and function.

Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer&#039;s Vesicle

Cilia-generated fluid flow in Kupffer&#x2019;s Vesicle (KV) controls left-right patterning of the zebrafish embryo. Here, we describe a technique to modulate gene function specifically in KV cells. In addition, we show how to deliver fluorescent beads into KV to visualize fluid flow.

تحليل وظائف الجينات والتخيل ولدت سيليا من تدفق السوائل في حويصلة كوبفر

Internal organs such as the  heart, brain, and gut develop left-right (LR) asymmetries that are critical for  their normal functions1. Motile cilia are ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

In vitro models using human primary epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory epithelium in the context of microbial infections or inhaled agents. Direct comparisons of cells obtained from diseased populations allow us to characterize different phenotypes and dissect the underlying mechanisms mediating changes in epithelial cell function. Culturing epithelial cells from the human tracheobronchial region has been well documented, but is limited by the availability of human lung tissue or invasiveness associated with obtaining the bronchial brushes biopsies. Nasal epithelial cells are obtained through much less invasive superficial nasal scrape biopsies and subjects can be biopsied multiple times with no significant side effects. Additionally, the nose is the entry point to the respiratory system and therefore one of the first sites to be exposed to any kind of air-borne stressor, such as microbial agents, pollutants, or allergens. 
Briefly, nasal epithelial cells obtained from human volunteers are expanded on coated tissue culture plates, and then transferred onto cell culture inserts. Upon reaching confluency, cells continue to be cultured at the air-liquid interface (ALI), for several weeks, which creates more physiologically relevant conditions. The ALI culture condition uses defined media leading to a differentiated epithelium that exhibits morphological and functional characteristics similar to the human nasal epithelium, with both ciliated and mucus producing cells. Tissue culture inserts with differentiated nasal epithelial cells can be manipulated in a variety of ways depending on the research questions (treatment with pharmacological agents, transduction with lentiviral vectors, exposure to gases, or infection with microbial agents) and analyzed for numerous different endpoints ranging from cellular and molecular pathways, functional changes, morphology, etc. 
In vitro models of differentiated human nasal epithelial cells will enable investigators to address novel and important research questions by using organotypic experimental models that largely mimic the nasal epithelium in vivo.

Nasal epithelial cells, obtained through superficial scrape biopsy of human volunteers, are expanded and transferred onto tissue culture inserts. Upon reaching confluency, cells are grown at air liquid interface, yielding cultures of ciliated and non-ciliated cells. Differentiated nasal epithelial cell cultures provide viable experimental models for studying the respiratory mucosa.

زراعة خلايا الإنسان الظهارية الأنف في واجهة الهواء السائل

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

الفجوة صلي بين الخلايا الاتصالات: العلامات البيولوجية الوظيفية لتقييم التأثيرات السلبية للالسميات والسموم، والصحة فوائد المنتجات الطبيعية

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as well as pathological changes in endothelial phenotype and gene expression. In particular, maladaptive effects of periodic, unidirectional flow induced shear stress can trigger a variety of effects on several vascular cell types, particularly endothelial cells. While by now endothelial cells from diverse anatomic origins have been cultured, in-depth analyses of their responses to fluid shear have been hampered by the relative complexity of shear models (e.g., parallel plate flow chamber, cone and plate flow model). While these all represent excellent approaches, such models are technically complicated and suffer from drawbacks including relatively lengthy and complex setup time, low surface areas, requirements for pumps and pressurization often requiring sealants and gaskets, creating challenges to both maintenance of sterility and an inability to run multiple experiments. However, if higher throughput models of flow and shear were available, greater progress on vascular endothelial shear responses, particularly periodic shear research at the molecular level, might be more rapidly advanced. Here, we describe the construction and use of shear rings: a novel, simple-to-assemble, and inexpensive tissue culture model with a relatively large surface area that easily allows for a high number of experimental replicates in unidirectional, periodic shear stress studies on endothelial cells.

The Assembly and Application of &#039;Shear Rings&#039;: A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of 'shear rings': a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.

الجمعية وتطبيق &quot;خواتم القص &#39;: رواية غشائي نموذج لالمداري، أحادي الاتجاه والدوري السائل تدفق وإجهاد القص

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

مغناطيسية تنشيط الخلية فرز الاستراتيجيات الرامية إلى عزل وتنقية الزليلي المستمدة من سائل الخلايا الجذعية الوسيطة من طراز الأرنب

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is compartmentalized into crypts and villi: the stem and proliferating cells are confined to the crypts, whereas the villi epithelium contains only differentiated cells. Hence, the normal intestinal crypts, but not the villi, can give rise to organoids in 3D cultures. The procedure described here is applicable only to villus epithelium undergoing dedifferentiation leading to stemness. The method described uses the Smad4-loss-of-function:&#946;-catenin gain-of-function (Smad4KO:&#946;-cateninGOF) conditional mutant mouse. The mutation causes the intestinal villi to dedifferentiate and generate stem cells in the villi. Intestinal villi undergoing dedifferentiation are scraped off the intestine using glass slides, placed in a 70 &#181;m strainer and washed several times to filter out any loose cells or crypts prior to plating in BME-R1 matrix to determine their organoid-forming potential. Two main criteria were used to ensure that the resulting organoids were developed from the dedifferentiating villus compartment and not from the crypts: 1) microscopically evaluating&#160;the isolated villi to ensure absence of any tethered crypts, both before and after plating in the 3D matrix, and 2) monitoring the time course of organoid development from the villi. Organoid initiation from the villi occurs only two to five days after plating and appears irregularly shaped, whereas the crypt-derived organoids from the same intestinal epithelium are apparent within sixteen hours of plating and appear spherical. The limitation of the method, however, is that the number of organoids formed, and the time required for organoid initiation from the villi vary depending on the degree of dedifferentiation. Hence, depending upon the specificity of the mutation or the insult causing the dedifferentiation, the optimal stage at which villi can be harvested to assay their organoid forming potential, must be determined empirically.

The procedure describes isolation of the villi from the mouse intestinal epithelium undergoing dedifferentiation to determine their organoid forming potential.

3D زراعة الأجهزة العضوية من ظهارة سيلي المعوية التي تخضع للتمايز

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...