نشكر فيونا فولي للحصول على الدعم والرعاية ممتازة مختبر الزرد. وأيد هذا العمل زمالة AHA predoctoral لGW (11PRE5730027) والمنح NHLBI لHJY (R01HL66292) والنقابة (R01HL095690).

نظرة عامة على مسارح محددة حقن الأجنة الزرد [أليغنوكليوتيد] العقاقير morpholino (MO)، الذي ربط إلى مرنا وتعطيل استهداف بروتين تعبير عن ذلك النص، وتستخدم على نطاق واسع في ضربة قاضية الجين (الخسارة من وظيفة) دراسات في الزرد 13،14. أدوات الجينات، LLC يقدم المنظمات الأعضاء التي يتم المفتاحية إما carboxyfluorescein (تنبعث الأخضر مضان) أو lissamine (تنبعث الأحمر مضان) للكشف عن MO في الأجنة حقن باستخدام المجهر الفلورسنت. عن طريق حقن MO في الخلية صفار في مراحل مختلفة من التنمية الزرد، فمن الممكن لتسليم MO إلى حجرات خاصة للجنين (أرقام 1A-F). MO حقنها في صفار بين مراحل الخلية 1-4 (0-1 HPF) يدخل جميع الخلايا الجنينية (أرقام 1A، D، D &#39;) عبر اتصالات مع صفار التي لا تزال مستمرة حتى المرحلة 32-15 إلى الخلية تسهيل ضربة قاضية العالمية. حقن MO في صفار خلال midblastيمكن مراحل العلا (2.5-3 HPF) أدخل الأسلاف من DFCs (أرقام 1B، E، &#39;E) المحتمل من خلال الجسور حشوية 8 و ضربة قاضية وظيفة الجين على وجه التحديد في نسب الخلايا DFC / KV 12، دون الدخول معظم الأنساب الخلية الجنينية . كعنصر تحكم المهم لاختبار ما إذا كان يلزم وظيفة الجين في DFC / KV أو أيضا في صفار 12،16، فمن الممكن أيضا أن تقييد MO إلى الخلية عن طريق حقن صفار بين المراحل اكتفار قبة-30٪ (4،5 ~ HPF) بعد وأغلقت جميع الجسور حشوية (أرقام 1C، F، F &#39;). وقد استخدمت هذه الحقن في تركيبة الجينات لتحليل وظيفة في DFC / KV الخلايا 17-24. لتقييم تدفق السوائل في KV، يتم حقن microbeads الفلورسنت في التجويف KV بين المراحل 6-10 الجسيدة (12-14 HPF) و. ثم تصويرها على الفور باستخدام videomicroscopy (أرقام 1G-J) Microbeads المتاحة التي تنبعث منها مضان أحمر أو أخضر (أو كليهما)، ولذلك فمن الممكن استخدام مختلفقنوات لصورة الفلورسنت microbeads وMO. 1. مرحلة محددة من حقن Morpholinos (MO) وقد تجلى حقن الأجنة الزرد MO في وقت سابق 25،26. هنا، نحن تصف لفترة وجيزة مرحلة محددة الحقن MO. بعد كل حقن، يتم نقل الأجنة إلى طبق بتري وحضنت في 28.5 ° C. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MO حقن العالمية: جمع الأجنة مباشرة بعد الإخصاب وتحميلها على لوحة الحقن. تحميل MO الفلورسنت في إبرة الشعرية وتركيب الإبرة في الصعود إلى microinjector (مثل هارفارد جهاز PLI-90-حاقن بيكو). كسر غيض إبرة الحقن وضبط إعدادات (الضغط و / أو الوقت) لإنشاء قطرة حقن يحتوي على حجم من 1 NL كما هو موضح 25،26. باستخدام stereomicroscope تشريح، وضخ من 1 NL MO في صفار (الشكل 1A) 50 ≥ الأجنة في التجربة. العمل بسرعة لاستكمال الحقن من الأيل 4-الخليةه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DFC التي تستهدف حقن MO: جمع الأجنة مباشرة بعد الإخصاب واحتضان 28.5 ° C. في عندما الأجنة قد وصلت إلى مرحلة 256-الخلية (~ 2.5 HPF)، تحميل بسرعة لهم في لوحة وحقن حقن ثم 1 NL من الفلورسنت MO في صفار من أجنة 100 ≥ بين المراحل 256-الخلية و 1،000 الخلية (الشكل 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صفار استهداف MO الحقن: جمع الأجنة مباشرة بعد الإخصاب واحتضان 28.5 ° C. في في المرحلة القبة (~ 4 HPF)، تحميل الأجنة في لوحة حقن ثم ضخها من 1 NL MO الفلورسنت في صفار من أجنة 100 ≥ بين القبة ومراحل اكتفار 30٪ (الشكل 1C). </li></ol> 2. اختيار الأجنة المحقونة لتحليل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما MO حقن الأجنة تصل إلى مرحلة 75٪، اكتفار (8 HPF)، وإزالة الأجنة الميتة وغير مخصبة ثم الأجنة الشاشة يعيشون تحت المجهر الفلورسنت تشريح لتوزيع MO الفلورسنت. ثم ألواختيار الأجنة لتطوير ث 28.5 ° C. في <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحقن MO العالمي، حدد الأجنة التي مضان موزعة بالتساوي في جميع أنحاء جميع الخلايا الجنينية (1D الشكل؛ 2A الشكل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لDFC التي تستهدف حقن MO، حدد الأجنة التي الفلورسنت MO قد ضعف في جميع أنحاء صفار ويبدو تتركز على هامش الأريمة الظهرية (DFCs) (الشكل 1E؛ الشكل 2B). في هذه المرحلة، يمكن أن يكون من الصعب تصور DFCs الفلورية بسبب مضان مشرق في صفار الأساسية. أن تحرص على استبعاد الأجنة التي MO الفلورسنت وقد أدرجت في الخلايا الجنينية غير DFCs أو لا يزال تجميعها في موقع الحقن (الشكل 2D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لصفار استهداف الحقن MO، حدد الأجنة التي يتم توزيعها بالتساوي في جميع أنحاء MO مضان صفار وليس لوحظ في أي الخلايا الجنينية (الشكل 1F؛ الشكل 2C). مرة أخرى، وإزالة الأجنة التي لا تزال MO الفلورسنتتجميعها في موقع الحقن. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بين المرحله 2-4-الجسيدة (~ 11 HPF) الأجنة الشاشة، للمرة الثانية تحت المجهر الفلورسنت باستخدام أعلى التكبير. ثم السماح المحددة لتطوير الأجنة 28.5 ° C. في <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحقن MO العالمية، وضمان الأجنة المحددة لها MO مضان موزعة بالتساوي في جميع KV والخلايا الجنينية (1D الشكل &#39;؛ 2E الشكل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لDFC التي تستهدف حقن MO، حدد بعناية الأجنة التي لديها MO مضان فقط في الخلايا KV وصفار (الشكل 1E). الأجنة المعدلة وراثيا التي تعبر عن GFP في خلايا KV، مثل TG (Dusp6: d2EGFP) 27، يمكن أن تساعد في تحديد الأجنة التي تم تسليمها بنجاح MO إلى خلايا KV (الشكل 2F). تجاهل الأجنة مع مضان MO في الخلايا الجنينية خلايا أخرى KV ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لصفار استهداف الحقن MO، حدد الأجنة التي لديها MO مضان حصرا في (صفار &#39;1F الشكل: الشكل2G). </li></ol></li></ol> 3. تصاعد الأجنة لتحليل تدفق السوائل في KV <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غير المتماثلة لتحليل تدفق السوائل في KV من MO العالمية، التي تستهدف DFC MO أو صفار استهداف الأجنة حقن MO، dechorionate بعناية ~ 20 بين 4-6 أجنة مراحل الجسيدة (~ 11-12 HPF) مع ملقط حاد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجهيز 50 مل من 1٪ منخفضة ذوبان نقطة الاغاروز وقسامة إلى 5 مل أنابيب إلى الحفاظ عليها كسائل في حمام الجافة في 42 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل جنين واحد إلى الشريحة الزجاجية الاكتئاب (معدات و مستلزمات المتحدة العلمية، وشركة) وإزالة أكبر قدر من الماء قدر الإمكان. شل الجنين عن طريق إضافة ما يكفي من الحارة 1٪ منخفضة ذوبان نقطة الاغاروز لتغطية مجرد الجنين (أكثر من اللازم يمكن أن تتداخل مع الاغاروز التصوير اللاحقة). كما الاغاروز يتصلب، استخدم ملقط لوضع الجنين بحيث يكون مواجها لها KV (عرض الظهرية) (الشكل 1H). تحميل 10 الأجنة مع جنين واحد لكل شريحة. العمل بسرعة لضمان أن جميع الحقن في الخطوة التالية هي كومبلeted من المرحلة الجسيدة 10 (14 HPF). </li></ol> 4. حقن Microbeads نيون في KV <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع Fluoresbrite Multifuorescent 0.5 ميكرون قطر المجهرية (Polysciences، وشركة) إلى 1:50 في الماء المعقم في أنبوب إيبندورف 1،5 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزج التخفيف من 1:50 microbeads بدقة من خلال الاستفادة من أنبوب وتحميل 3 ميكرولتر في إبرة الشعرية. باستخدام microinjector نفسها التي استخدمت لحقن MO (مثل هارفارد جهاز PLI-90-حاقن بيكو)، وكسر غيض إبرة مع ملقط وضبط إعدادات حقن لتوليد أصغر ممكن قطرة حقن (&lt;0.5 NL). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت المجهر تشريح، محاذاة الإبرة مع التجويف KV من أول جنين شنت. إدراج إبرة في التجويف وحقن كمية صغيرة (&lt;0.5 NL) من الخرز (الشكل 1G). وهناك معلومات إبرة صغيرة وصغيرة الحجم حقن حاسمة لتجنب KV الضارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن الأجنة جميع المحملة. وبمجرد أن الجنين injecteيمكن إضافة د، قطرة من الماء المعقم على رأس الاغاروز لمنعها من الجفاف. أثناء الحقن، وحبات كثيرا ما تعوق افتتاح الإبرة. هذا يتطلب إعادة كسر غيض إبرة وضبط حجم الحقن عن طريق تحوير أو الإعداد ضغط الوقت من جهاز حقن مكروي. استبدال الإبر إذا أصبح صريحا بما يكفي للتسبب في أضرار كبيرة خلال الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شاشة الأجنة حقن لتسليم ناجحة من الخرز تحت المجهر المركب الفلورسنت تستقيم (مثل زايس AxioImager M1) باستخدام الهدف 20X. أولا، تحديد ما إذا كان هيكل KV سليمة باستخدام brightfield الإضاءة (الشكل 1J)، ثم استخدم مضان لمراقبة الخرز. حدد الأجنة التي الخرز موجودة وتتحرك داخل التجويف KV. تجاهل الأجنة مع الضرر KV أو لا الخرز عائمة في KV. فمن السهل أن تفوت KV وتسليم الخرز إلى الأنسجة المجاورة أو صفار الأساسية. إذا غير ناجحة، جبل شرجي10 THER الأجنة وكرر الإجراء الحقن. </li></ol> 5. التصور والتحليل تدفق السوائل KV <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل الجنين المحددة مع الخرز داخل KV، إضافة قطرة من الماء المعقم لتغطية الاغاروز ثم مراقبة KV تحت المجهر المركب باستخدام الفلورية تستقيم الهدف 63X غمس المياه (الشكل 1I). وبدلا من ذلك، يمكن تطبيق ساترة للاستخدام مع المياه غير غمس الأهداف و / أو المجاهر المقلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام كاميرا عالية السرعة التي شنت على المجهر (مثل زايس AxioCamHSm) لتسجيل فيلم 10 ثانية. تسجيل كل من الخرز باستخدام قناة الفلورسنت (ما يقرب من 70 إطارات / ثانية) والتجويف KV باستخدام brightfield أو الفرق المقابل تدخل (DIC) القناة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتصور جميع الحركات حبة مع مرور الوقت، استيراد الفيلم من الخرز الفلورسنت في صناعة البرمجيات يماغيج (تحميل مجاني في <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ) أالثانية إنشاء الإسقاط الحد الأقصى لجميع إشارات الفلورسنت في الفيلم. لأداء الإسقاط الأقصى في يماغيج، انقر فوق &quot;ملف → → Z الأكوام المشروع&quot;. في إطار &quot;مشروع Z&quot;، المشروع جميع شرائح مع نوع من الإسقاط &quot;كثافة ماكس&quot;. ويمكن فرضه على هذه الصورة الصورة DIC من KV التي تم تصويرها حبات (أرقام 3A-B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن تتبع تحركات الفردية باستخدام الخرز يماغيج. A المساعد يمكن (&quot;تتبع يدوي&quot;) يتم تحميلها في <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html</a> . فتح الفيلم الخرز الفلورسنت في يماغيج وتشغيل الدالة تتبع يدوي. في نافذة تتبع يدوي، تحقق &quot;معلمات عرض&quot; ومعلمات الإدخال ل &quot;فترات زمنية&quot; و &quot;س / ص المعايرة&quot;. حدد يدويا الخرز التي تبقى في المستوى البؤري للفيلم للإطارات 50 ≥ ثم تتبع ≥ 5 حبات في الجنين. يتم إنشاء المسار والسرعة في كل حبة من اله برنامج (أرقام 3 CD). </li></ol>

<ol>
	<li>Sutherland, M. J., Ware, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorders+of+left-right+asymmetry:+heterotaxy+and+situsinversus.">Disorders of left-right asymmetry: heterotaxy and situsinversus.</a> Am. J. Med. Genet. C Semin. Med. Genet. 151C (4), 307-317 (2009).</li><li>Essner, J. J., Amack, J. D., Nyholm, M. K., Harris, E. B., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kupffer's+vesicle+is+a+ciliated+organ+of+asymmetry+in+the+zebrafish+embryo+that+initiates+left-right+development+of+the+brain,+heart+and+gut.">Kupffer's vesicle is a ciliated organ of asymmetry in the zebrafish embryo that initiates left-right development of the brain, heart and gut.</a> Development. 132 (6), 1247-1260 (2005).</li><li>Nonaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomization+of+left-right+asymmetry+due+to+loss+of+nodal+cilia+generating+leftward+flow+of+extraembryonic+fluid+in+mice+lacking+KIF3B+motor+protein.">Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking KIF3B motor protein.</a> Cell. 95 (6), 829-837 (1998).</li><li>Essner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+function+for+embryonic+nodal+cilia.">Conserved function for embryonic nodal cilia.</a> Nature. 418 (6893), 37-38 (2002).</li><li>Kramer-Zucker, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilia-driven+fluid+flow+in+the+zebrafish+pronephros,+brain+and+Kupffer's+vesicle+is+required+for+normal+organogenesis.">Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer's vesicle is required for normal organogenesis.</a> Development. 132 (8), 1907-1921 (2005).</li><li>Schweickert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilia-driven+leftward+flow+determines+laterality+in+Xenopus.">Cilia-driven leftward flow determines laterality in Xenopus.</a> Curr. Biol. 17 (1), 60-66 (2007).</li><li>Tabin, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+key+to+left-right+asymmetry.">The key to left-right asymmetry.</a> Cell. 127 (1), 27-32 (2006).</li><li>Cooper, M. S., D'Amico, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cluster+of+noninvolutingendocytic+cells+at+the+margin+of+the+zebrafish+blastoderm+marks+the+site+of+embryonic+shield+formation.">A cluster of noninvolutingendocytic cells at the margin of the zebrafish blastoderm marks the site of embryonic shield formation.</a> Dev. Biol. 180 (1), 184-198 (1996).</li><li>Melby, A. E., Warga, R. M., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+cell+fates+at+the+dorsal+margin+of+the+zebrafish+gastrula.">Specification of cell fates at the dorsal margin of the zebrafish gastrula.</a> Development. 122 (7), 2225-2237 (1996).</li><li>Amack, J. D., Wang, X., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+T-box+genes+play+independent+and+cooperative+roles+to+regulate+morphogenesis+of+ciliated+Kupffer's+vesicle+in+zebrafish.">Two T-box genes play independent and cooperative roles to regulate morphogenesis of ciliated Kupffer's vesicle in zebrafish.</a> Dev. Biol. 310 (2), 196-210 (2007).</li><li>Oteiza, P., Koppen, M., Concha, M. L., Heisenberg, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+shaping+of+the+laterality+organ+in+zebrafish.">Origin and shaping of the laterality organ in zebrafish.</a> Development. 135 (16), 2807-2813 (2008).</li><li>Amack, J. D., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+T+box+transcription+factor+no+tail+in+ciliated+cells+controls+zebrafish+left-right+asymmetry.">The T box transcription factor no tail in ciliated cells controls zebrafish left-right asymmetry.</a> Curr. Biol. 14 (8), 685-690 (2004).</li><li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26 (2), 216-220 (2000).</li><li>Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+for+morpholino+use+in+zebrafish.">A primer for morpholino use in zebrafish.</a> Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).</li><li>Kimmel, C. B., Law, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage+of+zebrafish+blastomeres.+I.+Cleavage+pattern+and+cytoplasmic+bridges+between+cells.">Cell lineage of zebrafish blastomeres. I. Cleavage pattern and cytoplasmic bridges between cells.</a> Dev. Biol. 108 (1), 78-85 (1985).</li><li>Arrington, C. B., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extra-embryonic+syndecan+2+regulates+organ+primordia+migration+and+fibrillogenesis+throughout+the+zebrafish+embryo.">Extra-embryonic syndecan 2 regulates organ primordia migration and fibrillogenesis throughout the zebrafish embryo.</a> Development. 136 (18), 3143-3152 (2009).</li><li>Caron, A., Xu, X., Lin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/beta-catenin+signaling+directly+regulates+Foxj1+expression+and+ciliogenesis+in+zebrafish+Kupffer's+vesicle.">Wnt/beta-catenin signaling directly regulates Foxj1 expression and ciliogenesis in zebrafish Kupffer's vesicle.</a> Development. 139 (3), 514-524 (2012).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rho+kinase+Rock2b+establishes+anteroposterior+asymmetry+of+the+ciliated+Kupffer's+vesicle+in+zebrafish.">The Rho kinase Rock2b establishes anteroposterior asymmetry of the ciliated Kupffer's vesicle in zebrafish.</a> Development. 138 (1), 45-54 (2011).</li><li>Aamar, E., Dawid, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox17+and+chordin+are+required+for+formation+of+Kupffer's+vesicle+and+left-right+asymmetry+determination+in+zebrafish.">Sox17 and chordin are required for formation of Kupffer's vesicle and left-right asymmetry determination in zebrafish.</a> Dev. Dyn. 239 (11), 2980-2988 (2010).</li><li>Neugebauer, J. M., Amack, J. D., Peterson, A. G., Bisgrove, B. W., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+signalling+during+embryo+development+regulates+cilia+length+in+diverse+epithelia.">FGF signalling during embryo development regulates cilia length in diverse epithelia.</a> Nature. 458 (7238), 651-654 (2009).</li><li>Schneider, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Nkd1+promotes+Dvl+degradation+and+is+required+for+left-right+patterning.">Zebrafish Nkd1 promotes Dvl degradation and is required for left-right patterning.</a> Dev. Biol. 348 (1), 22-33 (2010).</li><li>Matsui, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canopy1,+a+positive+feedback+regulator+of+FGF+signaling,+controls+progenitor+cell+clustering+during+Kupffer's+vesicle+organogenesis.">Canopy1, a positive feedback regulator of FGF signaling, controls progenitor cell clustering during Kupffer's vesicle organogenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (24), 9881-9886 (2011).</li><li>Shu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na,K-ATPase+alpha2+and+Ncx4a+regulate+zebrafish+left-right+patterning.">Na,K-ATPase alpha2 and Ncx4a regulate zebrafish left-right patterning.</a> Development. 134 (10), 1921-1930 (2007).</li><li>Esguerra, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ttrap+is+an+essential+modulator+of+Smad3-dependent+Nodal+signaling+during+zebrafish+gastrulation+and+left-right+axis+determination.">Ttrap is an essential modulator of Smad3-dependent Nodal signaling during zebrafish gastrulation and left-right axis determination.</a> Development. 134 (24), 4381-4393 (2007).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function.">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+Morpholino+Antisense+Oligonucleotides+in+Zebrafish+Embryos.">Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).</li><li>Molina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+chemical+screening+reveals+an+inhibitor+of+Dusp6+that+expands+cardiac+cell+lineages.">Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages.</a> Nat. Chem. Biol. 5 (9), 680-687 (2009).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Schneider, I., Houston, D. W., Rebagliati, M. R., Slusarski, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+fluxes+in+dorsal+forerunner+cells+antagonize+beta-catenin+and+alter+left-right+patterning.">Calcium fluxes in dorsal forerunner cells antagonize beta-catenin and alter left-right patterning.</a> Development. 135 (1), 75-84 (2008).</li><li>Clement, A., Solnica-Krezel, L., Gould, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cdc14B+phosphatase+contributes+to+ciliogenesis+in+zebrafish.">The Cdc14B phosphatase contributes to ciliogenesis in zebrafish.</a> Development. 138 (2), 291-302 (2011).</li><li>Matsui, T., Bessho, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left-right+asymmetry+in+zebrafish.">Left-right asymmetry in zebrafish.</a> Cell Mol. Life Sci. , (2012).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

باستخدام الحقن مرحلة محددة لاستهداف MO لنسب الخلية DFC / KV هو نهج مفيد لدراسة الخلية للحكم الذاتي وظيفة الجين وتجنب الظواهر عديد المظاهر الناجمة عن ضربة قاضية الجينات العالمي. ومع ذلك، يمكن أن يكون تحديا هذه الحقن من الناحية الفنية. حقن MO بين المراحل 256-الخلية و 1،000 خلية ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف / المواد </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td></tr><tr><td> معيار التحكم بنسبة ضئيلة من Lissamine الموسومة </td><td> الجينات أدوات، LLC </td><td></td></tr><tr><td> مخصص Rock2b morpholino بنسبة ضئيلة </td><td> الجينات أدوات، LLC </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresbrite Multifluorescent 0.5 ميكرون المجهرية </td><td> Polysciences، وشركة </td><td> 24054 </td></tr></tbody></table>

analysis of gene function and visualization of cilia-generated fluid flow in kupffer's vesicle

الأعضاء الداخلية مثل القلب والمخ والقناة الهضمية وتطوير اليسار واليمين (LR) عدم التماثل التي تعتبر بالغة الأهمية لمهامهم العادية 1. ويشارك في تأسيس أهداب متحركة LR التباين في الأجنة الفقارية، بما في ذلك الماوس، الضفدع، والزرد 2-6. هذه &#39;أهداب LR&#39; غير المتماثلة توليد تدفق السوائل ما هو ضروري لاشعال الحفظ غير المتماثلة العقدية (TGF-β الفصيلة) يشير شلال في الأديم المتوسط ​​الجانبي الأيسر لوحة، والتي يعتقد على توفير المعلومات LR الزخرفة لتطوير أجهزة 7. وبالتالي، لفهم الآليات الكامنة وLR الزخرفة، لا بد من تحديد الجينات التي تنظم تنظيم خلايا مهدبة LR، والحركة وطول أهداب LR وقدرتها على توليد التدفق غير المتماثلة قوية. في الجنين الزرد، وتقع في الحويصلة LR ​​أهداب كوبفر (KV) 2،4،5. وتتألف من KV طبقة واحدة من الخلايا الطلائية monociliatedأن أرفق التجويف مملوءة بسائل. وقد أظهرت الخرائط التي مشتق مصير KV من مجموعة من الخلايا المعروفة باسم 20-30 ~ رائد الخلايا الظهرية (DFCs) التي تهاجر في الهامش الأريمة الظهرية خلال مراحل اكتفار 8،9. خلال المراحل المبكرة الجسيدة، DFCs العنقودية وتفرق في الخلايا الظهارية مهدبة لتشكيل KV في tailbud الجنين 10،11. القدرة على تحديد وتعقب DFCs في تركيبة مع الشفافية البصرية والتطور السريع في الزرد الجنين، جعل الزرد KV نظام نموذجا ممتازا لدراسة الخلايا المهدبة LR. ومن المثير للاهتمام، من سلالة الأسلاف الخلية DFC / KV الاحتفاظ الجسور بين الخلية السيتوبلازمية صفار تصل إلى 4 ساعة بعد الإخصاب (HPF)، في حين الجسور حشوية بين الخلية والخلايا الجنينية صفار أخرى قريبة بعد 2 HPF 8. الاستفادة من هذه الجسور حشوية، وضعنا استراتيجية حقن المرحلة الخاصة لتقديم morpholino oligonucleotides (MO) حصريا لDFCs وضربة قاضية وظيفة الجين المستهدف في هذه الخلايا 12. هذه التقنية تخلق أجنة خيالية التي طرقت ظيفة الجين عليها في النسب DFC / KV النامية في سياق الجنين من النوع البري. غير المتماثلة لتحليل تدفق السوائل في KV، ونحن حقن microbeads الفلورسنت في التجويف KV وسجل الحركة باستخدام حبة videomicroscopy 2. هو تصور تدفق السوائل بسهولة ويمكن كميا من خلال تتبع التشريد حبة مع مرور الوقت. هنا، وذلك باستخدام مرحلة محددة ضربة قاضية الجينات DFC التي تستهدف تقنية وحقن microbeads الفلورسنت في KV لتصور تدفق سنتطرق لبروتوكول يوفر نهجا فعالا لتوصيف دور جينات معينة أثناء نمو KV وظيفة.

المرحلة الخاصة الحقن MO توفر نهجا مفيدا لتحليل وظيفة الجين في حجرات خاصة للجنين. الشكل 1 يمثل الرسم البياني للاستراتيجيات الحقن المستخدمة لاختبار وظيفة الجين في DFC / KV الخلايا وكيفية إدخال الخرز الفلورسنت لتصور تدفق السوائل في KV. يظهر توزيع MO الفلورية في مرحل?...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle at JoVE.com

Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer&#039;s Vesicle

أهداب ولدت في تدفق السوائل حويصلة كوبفر (KV) تسيطر على اليسار واليمين الزخرفة الجنين الزرد. هنا، نحن تصف تقنية لتعديل وظيفة الجين في الخلايا على وجه التحديد KV. وبالإضافة إلى ذلك، وتبين لنا كيفية توصيل الخرز الفلورسنت في KV لتصور تدفق السوائل.

تحليل وظائف الجينات والتخيل ولدت سيليا من تدفق السوائل في حويصلة كوبفر

Internal organs such as the  heart, brain, and gut develop left-right (LR) asymmetries that are critical for  their normal functions1. Motile cilia are ...

analysis-gene-function-visualization-cilia-generated-fluid-flow

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle

14.8K Views.  Upstate Medical University. أهداب ولدت في تدفق السوائل حويصلة كوبفر (KV) تسيطر على اليسار واليمين الزخرفة الجنين الزرد. هنا، نحن تصف تقنية لتعديل وظيفة الجين في الخلايا على وجه التحديد KV. وبالإضافة إلى ذلك، وتبين لنا كيفية توصيل الخرز الفلورسنت في KV لتصور تدفق السوائل.

Video: Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinjection الجنين اسماك الزرد إلى تحليل وظائف الجينات

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

التعريفي واختبار نقص الأكسجة في الثقافة خلية

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Annotation of Plant Gene Function via Combined Genomics, Metabolomics and Informatics

Given the ever expanding number of model plant species for which complete genome sequences are available and the abundance of bio-resources such as knockout mutants, wild accessions and advanced breeding populations, there is a rising burden for gene functional annotation. In this protocol, annotation of plant gene function using combined co-expression gene analysis, metabolomics and informatics is provided (Figure 1). This approach is based on the theory of using target genes of known function to allow the identification of non-annotated genes likely to be involved in a certain metabolic process, with the identification of target compounds via metabolomics. Strategies are put forward for applying this information on populations generated by both forward and reverse genetics approaches in spite of none of these are effortless. By corollary this approach can also be used as an approach to characterise unknown peaks representing new or specific secondary metabolites in the limited tissues, plant species or stress treatment, which is currently the important trial to understanding plant metabolism.

Combination of genomics, co-expression gene analysis and the identification of target compounds via metabolism give gene functional annotation.

شرح وظيفة الجينات النباتية عن طريق الجينوم المشترك، الايض والمعلوماتية

Given the ever expanding number of model plant species for which complete genome sequences are available and the abundance of bio-resources such as ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

عزلة البروتينية ريبوسوم الوليدة منضم<em&gt; في المختبر</em&gt; لتحديد المواقع وقفة بالحركة على طول مرنا

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

التصور والتحليل من جزيئات الرنا المرسال عن طريق الإسفار<em&gt; في الموضع</em&gt; التهجين في<em&gt; خميرة الخباز</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

إعادة إعماره الوظيفية وآخر قناة قياسات تنقية Wildtype والمسخ CFTR البروتين

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as well as pathological changes in endothelial phenotype and gene expression. In particular, maladaptive effects of periodic, unidirectional flow induced shear stress can trigger a variety of effects on several vascular cell types, particularly endothelial cells. While by now endothelial cells from diverse anatomic origins have been cultured, in-depth analyses of their responses to fluid shear have been hampered by the relative complexity of shear models (e.g., parallel plate flow chamber, cone and plate flow model). While these all represent excellent approaches, such models are technically complicated and suffer from drawbacks including relatively lengthy and complex setup time, low surface areas, requirements for pumps and pressurization often requiring sealants and gaskets, creating challenges to both maintenance of sterility and an inability to run multiple experiments. However, if higher throughput models of flow and shear were available, greater progress on vascular endothelial shear responses, particularly periodic shear research at the molecular level, might be more rapidly advanced. Here, we describe the construction and use of shear rings: a novel, simple-to-assemble, and inexpensive tissue culture model with a relatively large surface area that easily allows for a high number of experimental replicates in unidirectional, periodic shear stress studies on endothelial cells.

The Assembly and Application of &#039;Shear Rings&#039;: A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of 'shear rings': a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.

الجمعية وتطبيق &quot;خواتم القص &#39;: رواية غشائي نموذج لالمداري، أحادي الاتجاه والدوري السائل تدفق وإجهاد القص

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

تحليل الكائنات المجهرية باستخدام ثنائي الخطوة PCR والجيل التالي من 16S rRNA التسلسل الجيني

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. The sipunculid worm Sipunculus nudus is a crucial fishery resource as it has high nutritional and medicinal values. Currently, the research on the molecular biology of Sipunculus nudus is still in its infancy. The purpose of this article is to develop a sensitive method for localizing specific mRNA in Sipunculus nudus coelomic fluid. The protocol includes detailed steps of ISH, including digoxigenin-labeled antisense and sense riboprobe preparation, coelomic fluid collection and section preparation, specific riboprobe hybridization, antibody incubation, coloration and post-coloration treatments. The representative results obtained from a successful experiment using this method are demonstrated. The protocol should be applicable to other Sipuncula species as well.

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

This protocol describes an effective in situ hybridization approach to detect the mRNA expression levels and spatial patterns of target genes in Sipunculus nudus coelomic fluid.

في الموقع التهجين لسيبونكولوس nudus Coelomic السائل

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

في فيترو تحليل E3 يوبيكيتين ليجاز وظيفة

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...