فإن الكتاب أود أن أشكر ليزا دايلي للمدخلات مفيدة. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (ES013611 وHL095163)، ومضيفات معهد البحوث الطبية (FAMRI)، وكالة حماية البيئة (CR83346301) وتعلن أي تضارب في المصالح. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة. وإن كان قد مولت البحث الموضحة في هذه المقالة في جزء من وكالة حماية البيئة في الولايات المتحدة من خلال التعاون CR83346301 اتفاق مع مركز الطب البيئي والربو وعلم الأحياء الرئة في جامعة نورث كارولينا، تشابل هيل، لم يخضع ل الوكالة نظير المطلوبة واستعراض السياسات وبالتالي لا تعكس بالضرورة وجهة نظر الوكالة، وليس موافقة رسمية يجب أن يكون تفسيره. يذكر سالأسماء التجارية و أو المنتجات التجارية لا يشكل موافقة أو توصية للاستخدام. ويدعم وريتا مولر من قبل مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية بمنحة الشخصية.

1. إعداد بلاستيك وير: معطف بلايت <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر PureCol (1:100 المخفف بالماء المعقم) إلى كل بئر من لوحة 12 جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة لمدة 30 دقيقة، وإزالة PureCol وشطف مع HBSS الحق قبل أن يتم إضافة خلايا لوحة (راجع الخطوة 3.1 أدناه). </li></ol> 2. والحصول على خزعة من Pretreating NECS الإنسان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خزعة الأنف كشط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول ECS السطحية المبطنة للالمحارات الأنفية تحت الرؤية المباشرة من خلال 9 ملم قابلة لإعادة الاستخدام منظار الأنف البولي بروبلين (نموذج 22009) على منظار الأذن مع منظار التشغيل (نموذج 21700). يوفر هذا الجهاز التصور الأمثل للالمحارات الأنفية والمرونة في الحركة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء الخزعات مع موضوع يجلس منتصبا على كرسي مستقيم المدعومة مع إمالة الرأس إلى الخلف قليلا أو الكذب في موقف ضعيف على طاولة الفحص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج منظار منظار الأذن إلى الأنف وturbi أدنىتصور نيت مع الإضاءة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج مجرفة بالحرارة معقمة من خلال منظار مع طرف مددت بشكل أقصى إلى الجزء الخلفي من المحارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ضغط لطيف على سطح السفلي من المحارة، يوجه مجرفة عبر 5X سطح الغشاء المخاطي وتراجع. وسوف استرجاع ناجحة من الخلايا المخاطية التي عقدها عمل شعري يكون واضحا في كوب من مجرفة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع العينة في أنبوب 15 مل المخروطية التي تحتوي على 8 مل من RPMI 1640، نقل على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط لاسترداد التحقيق، طرد الأنسجة من وحيد القرن التحقيق مع ماصة-P 1000، تجاهل التحقيق </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لتكوير (4 ° C، 400 x ج، 5 دقائق)، طاف نضح (انتباه: الحرص على عدم نضح بيليه). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية في 1 مل BEGM مع 10 ميكرولتر من الدناز 100X 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند RT لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي (4 ° C، 400 x ج، 5 دقائق)، لا NOT نضح طاف! </li></ol> 3. Sعيد على خلايا البلاستيك (يوم 0) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة PureCol من لوحة وشطف مع HBSS (انظر أيضا الخطوة 1.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الحد الأدنى من حجم BEGM + + وسائل الاعلام (80-100 ميكرولتر، حتى يظهر الغضروف المفصلي وسائل الإعلام في وسط البئر) في الآبار 1-4 (اعتمادا على حجم خزعة) من لوحة المغلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ماصة P-1000 لإزالة بعناية بيليه من الأنسجة خزعة من الأنبوب، دون الشفط وسائل الإعلام أكثر من اللازم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بيليه في منتصف الآبار، والحفاظ على خزعة معا كمجموعة من الخلايا، وليس لتفريق لجعل تعليق خلية واحدة. A غلة خزعة جيدة تصل إلى 4 الآبار التي يمكن المصنف. وضع لوحة في نسيج الثقافة الحاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2،&gt; الرطوبة النسبية 90٪). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق بعد ساعتين للتأكد من أن هناك ما يكفي من وسائل الإعلام (من دون إزعاج الغضروف المفصلي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Day1، 24 ساعة بعد البذر: جمع كل الخلايا غير ملتصقة من جميع الآبار (لوحة الميل وجمع وسائل الإعلام مع الخلايا في P-1000، جollect جميع الآبار في 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي (4 ° C، 400 x ج، 5 دقائق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بينما الطرد المركزي تعليق خلية: إضافة حوالي 250 ميكرولتر من BEGM + + و 250 ميكرولتر من BEGM + خليط سائل الإعلام إلى الخلايا المصنفة في اليوم 0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 3،1-3،5 للخلايا غير ملتصقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم 2-5: وسائل الإعلام تغيير الخلايا اليومية، إضافة 500 وسائل الاعلام ميكرولتر إلى كل بئر، والحد من كمية BEGM + + متدرج وسائل الإعلام (اليوم 2 بعد البذر: 125 ميكرولتر BEGM + + بالإضافة إلى 375 ميكرولتر BEGM +، DAY3 بعد البذر والأيام التالية: 73 ميكرولتر BEGM + + بالإضافة إلى 427 ميكرولتر BEGM +). </li></ol> 4. توسيع الخلايا في قوارير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رصد خلايا يوميا؛ بمجرد أن وصلت إلى 80-90٪ confluency (عادة بعد 5-7 أيام من خزعة، إذا كانت تستغرق وقتا أطول فإنها لن تنمو بنجاح) خلايا رفع على النحو التالي: وسائل الإعلام نضح بعناية؛ إضافة 500 ميكرولتر من التربسين 0.25٪ لكل بئر، والاحتفاظ بها في 37 درجة مئوية حتى يتم فصل الخلايا (وعادة ما يستغرق 2-3 دقائق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحاجةحجم الطبعه من فول الصويا التربسين المانع (SBTI) (750 ميكرولتر لكل 1 مل التربسين) في أنبوب 15 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزاحة الخلايا مرارا وتكرارا من قبل pipetting صعودا وهبوطا في حل التربسين، ونقل خلايا منفصلة في أنبوب مخروطي 15 مل مع SBTI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف جميع الآبار في مجموع مع 1 مل HBSS، إضافة HBSS إلى أنبوب مع الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لتكوير (4 ° C، 400 x ج، 5 دقائق)، ونضح وسائل الإعلام، resuspend في 1 مل BEGM + وسائل الإعلام ودوامة الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توسيع الخلايا في T25 T75 قارورة أو اعتمادا على حجم بيليه (هذا هو P1؛ حوالي بئرين متموجة يذهب إلى واحد قارورة T75، متموجة واحد هو جيدا بما فيه الكفاية لT25 واحد، وعادة ما تسفر 2 الآبار متموجة T75 واحد). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة BEGM + لقوارير (5 مل كل لT75، 3 مل لكل لT25). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة تعليق الخلية إلى القوارير. نقل القوارير إلى حاضنة زراعة الأنسجة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 ساعة بعد قارورة-البذر: إضافة وسائل الاعلام إضافية BEGM + إلى قارورة (3 مل إلى T25، 10 مل إلى T75). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"><stroنانوغرام&gt; الحفاظ على الخلايا في قوارير: إزالة وسائل الاعلام (نضح من الزاوية) وإضافة BEGM + وسائل الاعلام (5 ml/T25، 20 ml/T75). يحتاج الإعلام إلى تغيير كل 2-3 أيام. الحفاظ على الخلايا في قارورة حتى هم حوالي 80٪ متموجة (قد لا تكون confluency حتى في جميع أنحاء قارورة بأكمله؛ عادة ما يستغرق ما بين هذا 7-10 أيام، وإذا لم يتم متموجة بعد 10 يوما فإنها لن تنمو بنجاح). </li></ol> 5. بذر خلايا في الأنسجة الثقافة إدراجات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الإعلام من القارورة وإضافة التربسين (3 مل لT25، T75 4 مل قارورة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 37 درجة مئوية حتى يتم فصل الخلايا (حوالي 2-3 دقائق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد SBTI (750 ميكرولتر لكل 1 مل التربسين&gt; 2.25 مل T25، T75 3 مل ل) في أنبوب 15 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزاحة الخلايا عن طريق تسجيل القارورة وpipetting صعودا وهبوطا، ونقل إلى أنبوب مخروطي مع SBTI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف القارورة مع HBSS (1 مل T25، T75 2 مل ل)، إضافة HBSS إلى أنبوب 15 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزيلتكوير (4 ° C، 400 x ج، 5 دقيقة)، وإزالة طاف بعناية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد لوحات: تحديد كيفية العديد من لوحات ستكون المصنفة، تسمية لوحات مع نموذج التعليمات البرمجية والعدد، عدد مرور (أي P2) والتاريخ. إضافة 700 ميكرولتر BEGM + وسائل الإعلام إلى غرفة القاعدية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية خلية في 1 مل سائل الإعلام BEGM ALI من قبل vortexing الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا مع عدادة الكريات (أ T25 عادة ما تنتج حوالي 4 ملايين الخلايا؛ لT75 يمكن أن يصل إلى 20 مليون خلية اعتمادا على جزيرة، واستخدام 1-2000000 الخلايا لمدة 12 لوحة جيدا) وتمييع تعليق الخلية مع وسائل الإعلام BEGM ALI إلى الحجم الكلي اللازم لكمية من لوحات التي ينبغي المصنفة (1.2 × 10 6 خلايا في 2.5 مل سائل الإعلام في لوحة) (ملاحظة: إذا كان جزء من الخلايا تريد أن تكون مجمدة، تسمية أنبوب وإزالة الخلايا هنا: نحن عادة تجميد 2 × 10 6 خلايا في 2 مل من تجميد وسائل الاعلام) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر تعليق خلية إلى الجانب قمية كل خلية كورنينج 12well غير المصقولإدراج (&gt; هذا سيكون حوالي 80،000-150،000 الخلايا / إدراج؛ 12 ملم مع 0.4 ميكرومتر transwells البوليستر المسام (البولي ايثيلين تيريفثاليت (PET)) إدراج غشاء)؛ نقل في نسيج الثقافة الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 24 ساعة، وتغيير وسائل الإعلام القمي (200 ميكرولتر المتوسطة التوسع). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الثقافات الخلية: تغيير وسائل الإعلام (BEGM ALI سائل الإعلام؛ 700 ميكرولتر basolateral و200 قمية ميكرولتر) كل يوم. إدراج يجب الحفاظ المغمور حتى الخلايا هي متكدسة تماما (عدم وجود ثقوب في أحادي الطبقة مرئية). اعتمادا على عدد الخلايا هذا عادة ما يستغرق ما بين 2-6 أيام، وإذا كان يستغرق وقتا أطول فإن الخلايا الأرجح لن تكون قابلة للحياة. </li></ol> 6. إنشاء واجهة الهواء السائل مرة واحدة في الخلايا هي مندمج تماما (عندما خلايا في Transwells هي تماما مندمج) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة في الخلايا هي متكدسة تماما تحل محل كل وسائل الإعلام وقمية basolateral مع وسائل الاعلام BEGM ALI تستكمل مع 500nM حمض الريتينويك لمدة 48 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 48 ساعة بعد إضافة حمض الريتينويك تستكمل BEGM ALI سائل الإعلام: إعداد PneumaCult-ALI الصيانة متوسطة (تعليمات الشركة التالية و): احسب حجم المتوسطة اللازمة (لوحة واحدة عادة 8.5 مل لمقصورات القاعدية)، ويضاف لكل 1 مل PneumaCult كاملة قاعدة متوسطة : 10 ميكرولتر PneumaCult 100X الملحق الصيانة 2 ميكرولتر الهيبارين (من محلول المخزون 2 ملغ / مل) 5 ميكرولتر هيدروكورتيزون (من محلول المخزون 96 ميكرولتر / مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة جميع وسائل الإعلام وإضافة 700 ميكرولتر PneumaCult-ALI سائل الإعلام الصيانة إلى الجانب basolateral فقط (وليس المتوسطة على الجانب القمي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على مزارع الخلايا لمدة 4 أسابيع في ALI: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير وسائل الإعلام كل يوم (الاثنين والأربعاء والجمعة الجدول الزمني يعمل بشكل جيد بالنسبة لنا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أسبوع واحد على ALI، مرة واحدة في الأسبوع (الأربعاء) يتم شطف السطح القمي: إضافة 200 ميكرولتر HBSS إلى الجانب القمي، والاحتفاظ بها لمدة 10 دقيقة في الحاضنة، نضح بعنايةHBSS (استخدام 9 في الزجاج ماصة تعلق على فخ الفراغ في خزانة السلامة البيولوجية، واستخدام 200 ميكرولتر نصائح على غيض من ماصة لشفط قبالة HBSS). </li></ol></li></ol> ملاحظة: تغيير نصائح بين لوحات، وكذلك تغيير نصائح عند الانتقال من سطح قمية مقابل basolateral. بعد حوالي 2 أسابيع في ALI، تبدأ الخلايا على التمايز وتظهر أهداب. مزارع الخلايا تصل إلى التمايز كامل بعد حوالي 4 أسابيع في ALI.

<ol>
	<li>Swamy, M., Jamora, C., Havran, W., Hayday, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+decision+makers:+in+search+of+the+'epimmunome.">Epithelial decision makers: in search of the 'epimmunome.</a> Nat. Immunol. 11, 656-665 (2010).</li><li>Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+airway+epithelium:+soldier+in+the+fight+against+respiratory+viruses.">The airway epithelium: soldier in the fight against respiratory viruses.</a> Clin. Microbiol Rev. 24, 210-229 (2011).</li><li>Muller, L., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cells,+the+"switchboard"+of+respiratory+immune+defense+responses:+Effects+of+air+pollutants.">Epithelial cells, the "switchboard" of respiratory immune defense responses: Effects of air pollutants.</a> Swiss Med. Wkly. , (2012).</li><li>Sanders, C. J., Doherty, P. C., Thomas, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+epithelial+cells+in+innate+immunity+to+influenza+virus+infection.">Respiratory epithelial cells in innate immunity to influenza virus infection.</a> Cell Tissue Res. 343, 13-21 (2011).</li><li>Robertson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+chemokines+in+the+biology+of+natural+killer+cells.">Role of chemokines in the biology of natural killer cells.</a> J. Leukoc. Biol. 71, 173-183 (2002).</li><li>Adachi, M., Matsukura, S., Tokunaga, H., Kokubu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+cytokines+on+human+bronchial+epithelial+cells+induced+by+influenza+virus.">Expression of cytokines on human bronchial epithelial cells induced by influenza virus.</a> A. Int. Arch. Allergy Immunol. 113, 307-311 (1997).</li><li>Borchers, M. T., Harris, N. L., Wesselkamper, S. C., Vitucci, M., Cosman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKG2D+ligands+are+expressed+on+stressed+human+airway+epithelial+cells.">NKG2D ligands are expressed on stressed human airway epithelial cells.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 291, L222-L231 (2006).</li><li>Groh, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Costimulation+of+CD8alphabeta+T+cells+by+NKG2D+via+engagement+by+MIC+induced+on+virus-infected+cells.">Costimulation of CD8alphabeta T cells by NKG2D via engagement by MIC induced on virus-infected cells.</a> Nat. Immunol. 2, 255-260 (2001).</li><li>Obeidy, P., Sharland, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKG2D+and+its+ligands.">NKG2D and its ligands.</a> Int J. Biochem. Cell Biol. 41, 2364-2367 (2009).</li><li>Horvath, K. M., Brighton, L. E., Zhang, W., Carson, J. L., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+Cells+From+Smokers+Modify+Dendritic+Cell+Responses+in+the+Context+of+Influenza+Infection+1.">Epithelial Cells From Smokers Modify Dendritic Cell Responses in the Context of Influenza Infection 1.</a> Am. J. Resp. Cell. , (2010).</li><li>Muller, L., Brighton, L. E., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ozone+exposed+epithelial+cells+modify+co-cultured+natural+killer+cells.">Ozone exposed epithelial cells modify co-cultured natural killer cells.</a> AJP Lung. , (2013).</li><li>Turi, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+activates+anion+exchange+protein+2+and+AP-1+in+airway+epithelial+cells.">Oxidative stress activates anion exchange protein 2 and AP-1 in airway epithelial cells.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, 791-798 (2002).</li><li>Zimmermann, G. S., Neurohr, C., Villena-Hermoza, H., Hatz, R., Behr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-inflammatory+effects+of+antibacterials+on+human+Bronchial+epithelial+cells.">Anti-inflammatory effects of antibacterials on human Bronchial epithelial cells.</a> Respir. Res. 10, 89 (2009).</li><li>Lopez-Souza, N., Avila, P. C., Widdicombe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+cultures+of+human+airway+epithelium+from+nasal+scrapings+and+bronchial+brushings.">Polarized cultures of human airway epithelium from nasal scrapings and bronchial brushings.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 39 (2003), 266-269 (2003).</li><li>Gray, T. E., Guzman, K., Davis, C. W., Abdullah, L. H., Nettesheim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucociliary+differentiation+of+serially+passaged+normal+human+tracheobronchial+epithelial+cells.">Mucociliary differentiation of serially passaged normal human tracheobronchial epithelial cells.</a> Am. J. Respir. Cell Mo.l Biol. 14, 104-112 (1996).</li><li>Adler, K. B., Schwarz, J. E., Whitcutt, M. J., Wu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Chamber+System+for+Maintaining+Differentiated+Guinea-Pig+Respiratory+Epithelial-Cells+between+Air+and+Liquid-Phases.">A New Chamber System for Maintaining Differentiated Guinea-Pig Respiratory Epithelial-Cells between Air and Liquid-Phases.</a> Biotechniques. 5, 462 (1987).</li><li>Whitcutt, M. J., Adler, K. B., Wu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biphasic+chamber+system+for+maintaining+polarity+of+differentiation+of+cultured+respiratory+tract+epithelial+cells.">A biphasic chamber system for maintaining polarity of differentiation of cultured respiratory tract epithelial cells.</a> In Vitro Cell. Dev. Biol. 24, 420-428 (1988).</li><li>Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+expression+of+IRF7+in+nasal+epithelial+cells+from+smokers+after+infection+with+influenza.">Reduced expression of IRF7 in nasal epithelial cells from smokers after infection with influenza.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 43, 368-375 (2010).</li><li>Muller, L., Brighton, L. E., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ozone+exposed+epithelial+cells+modify+cocultured+natural+killer+cells.">Ozone exposed epithelial cells modify cocultured natural killer cells.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 304, 332-341 (2013).</li><li>Ochs, M., Weibel, E. R., Fishmanetal, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fishman's Pulmoary Diseases and Disorders. 4, 23-69 (2008).</li><li>Kesic, M. J., Meyer, M., Bauer, R., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+Ozone+Modulates+Human+Airway+Protease/Antiprotease+Balance+Contributing+to+Increased+Influenza+A+Infection.">Exposure to Ozone Modulates Human Airway Protease/Antiprotease Balance Contributing to Increased Influenza A Infection.</a> PLoS ONE. 7, e35108 (2012).</li><li>Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diesel+exhaust+enhances+influenza+virus+infections+in+respiratory+epithelial+cells.">Diesel exhaust enhances influenza virus infections in respiratory epithelial cells.</a> Toxicol. Sci. 85, 990-1002 (2005).</li><li>Jaspers, I., Flescher, E., Chen, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ozone-induced+IL-8+expression+and+transcription+factor+binding+in+respiratory+epithelial+cells.">Ozone-induced IL-8 expression and transcription factor binding in respiratory epithelial cells.</a> Am. J. Physiol. 272, L504-L511 (1997).</li><li>Blume, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barrier+responses+of+human+bronchial+epithelial+cells+to+grass+pollen+exposure.">Barrier responses of human bronchial epithelial cells to grass pollen exposure.</a> Eur. Respir. J. , (2012).</li><li>Bauer, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+enhances+caspase-1+in+bronchial+epithelial+cells+from+asthmatic+volunteers+and+is+associated+with+pathogenesis.">Influenza enhances caspase-1 in bronchial epithelial cells from asthmatic volunteers and is associated with pathogenesis.</a> J. Allergy Clin. Immunol. 130, 958-967 (2012).</li><li>Ostrowski, L. E., Stewart, D., Hazucha, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+gamma+stimulates+accumulation+of+gas+phase+nitric+oxide+in+differentiated+cultures+of+normal+and+cystic+fibrosis+airway+epithelial+cells.">Interferon gamma stimulates accumulation of gas phase nitric oxide in differentiated cultures of normal and cystic fibrosis airway epithelial cells.</a> Lung. 190, 563-571 (2012).</li><li>Jardim, M. J., Fry, R. C., Jaspers, I., Dailey, L., Diaz-Sanchez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+microRNA+expression+in+human+airway+cells+by+diesel+exhaust+particles+is+linked+to+tumorigenesis-associated+pathways.">Disruption of microRNA expression in human airway cells by diesel exhaust particles is linked to tumorigenesis-associated pathways.</a> Environ. Health Perspect. 117, 1745-1751 (2009).</li><li>Horvath, K. M., Brighton, L. E., Herbst, M., Noah, T. L., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Attenuated+Influenza+Virus+(LAIV)+induces+different+mucosal+T+cell+function+in+nonsmokers+and+smokers.">Live Attenuated Influenza Virus (LAIV) induces different mucosal T cell function in nonsmokers and smokers.</a> Clin. Immunol. 142, 232-236 (2012).</li><li>Horvath, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+lavage+natural+killer+cell+function+is+suppressed+in+smokers+after+live+attenuated+influenza+virus.">Nasal lavage natural killer cell function is suppressed in smokers after live attenuated influenza virus.</a> Respir. Res. 12, 102 (2011).</li><li>Noah, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+smoke+exposure+and+altered+nasal+responses+to+live+attenuated+influenza+virus.">Tobacco smoke exposure and altered nasal responses to live attenuated influenza virus.</a> Environ. Health Perspect. 119, 78-83 (2011).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

توفير ECS الجهاز التنفسي ليس فقط حاجز مادي لحماية جسم الإنسان من مؤثرات خارجية 20، ولكن أيضا بمثابة لوحة مفاتيح لبدء وتنظيم الاستجابات الدفاع المناعي الجهاز التنفسي 1-3 عن طريق إفراز وسطاء للذوبان أو مستقبلات يجند المباشر التفاعلات خلية خلية. من أجل مواصلة ?...

الهدف من هذه التقنية الخلايا الظهارية (ECS) في الشعب الهوائية هي من بين المواقع الأولى أن تتعرض مباشرة إلى الضغوطات البيئية المستنشقة، مثل مسببات الأمراض، والمواد المسببة للحساسية أو ملوثات الهواء. ECS أكثر من حاجز الهيكلية: وهي بمثابة لوحة مفاتيح لبدء وتنظيم الاستجابة المناعية في الجهاز التنفسي 1-3 عن طريق الافراج عن وسطاء للذوبان 4-6 والتعبير عن بروابط / المستقبلات على السطحية بهم 7-9. بينما خطوط الخلايا مخلد يمكن استخدامها كنماذج لدراسة الجهاز التنفسي ECS في المختبر، فإنها تفشل على التمايز إلى السكان الخلية غير متجانسة تتكون من خلايا مهدبة الاستقطاب والمخاط المنتجة، على غرار ما لوحظ في الجسم الحي. لألخص الخصائص المهمة للظهارة التنفسية لوحظت في الجسم الحي، ويمكن استخدام ECS الهوائية الأولية. وبالتالي، كان هدفنا لتحسين أسلوبنا استخدام الأنف ECS (NECS) تم الحصول عليها من متطوعين من البشر. يتم توسيع NECS وتربيتها في المختبر، مما أسفر عن ثقافة نموذج الخلية من NECS متباينة الذي يحاكي العديد من الميزات من الظهارة الأنفية ينظر في الجسم الحي. الأساس المنطقي استخدام نماذج في المختبر مع ECS الابتدائي الإنسان في محاكاة الوضع الجسم الحي - كما هو موضح في هذه الدراسة - يعطي إمكانيات فريدة لدراسة الاختلافات مرض معين من ECS، المعلمات الفسيولوجية المرتبطة ظهارة الهوائية، أو التفاعلات بين ECS وأنواع الخلايا الأخرى، مثل الخلايا الجذعية 10، والخلايا القاتلة الطبيعية 11 أو الضامة. العديد من الأساليب القائمة الاستفادة ECS الشعب الهوائية، والتي يمكن الحصول عليها عبر خزعات جراحية فرشاة خلال bronchoscopies، أو خلاف ذلك من التخلص منها أنسجة الرئة 12-17. بالإضافة إلى ذلك، للحصول على مصادر تجارية متباينة تماما الهوائية الإنسان الثقافات الخلايا الظهارية وجود (نموذج EpiAirway من ماتيك، آشلاند، MA، Cloneticsمن ونزا، بازل، سويسرا، MucilAir من Epithelix سارس، جنيف سويسرا)، حيث يمكن للمحققين اختيار من مختلف الجهات المانحة. ومع ذلك، نظرا لمجموعة محدودة من الخلايا الظهارية المتاحة تجاريا، أو مجموعة محدودة من المعلمات المقررة، فإن التكلفة المرتبطة الحصول على تجاريا الهوائية الإنسان الأساسية ECS، ومحدودية فرص الحصول على التخلص من أنسجة الرئة أو التي تم الحصول عليها حديثا الأنسجة الخزعة القصبي الإنسان، وتحظر العديد من المحققين من إجراء دراسات في مجرى الهواء ECS الإنسان متباينة تماما. لذلك، شرعنا في تطوير تقنية من شأنها أن 1) الاستفادة NECS الإنسان الحصول عليها غير جراحية، 2) توفير بروتوكول الغلة ثقافات متباينة ظهارة الهوائية الإنسان، و 3) أن تكون قابلة للتكرار في معظم الإعدادات المختبر مع البنية التحتية القائمة زراعة الأنسجة. المزايا على تقنيات موجودة / نماذج الحصول على NECS جديدة، بالمقارنة مع الشعب الهوائية أو الشعب الهوائية الصغيرة ECS، هو أقل بكثير الغازية، الفرديةو يمكن تحتاج فحص عدة مرات مع عدم وجود آثار جانبية كبيرة، ويمكن أن تجرى سطحية الخزعات كشط الأنف في السكان المريضة التي لولاها لم يكن مؤهلا للحصول bronchoscopies البحوث ذات الصلة. موسع الخزعات كشط سطحي للحصول على NECS تسمح المحقق لوضع مواصفات المانحة بداهة، بما في ذلك السن والجنس والحالة المرضية، الخ وفقا لهدف البحث إلى أن يتحقق. وبالتالي، عند تصميم الدراسات البحثية المحققين لا تقتصر من قبل الأنسجة المتوفرة سريريا / عينة الظهارية، وشراء مكلفة متباينة نماذج ثقافة الخلية من الباعة التجارية، أو تصميم الدراسات القصبات الغازية. بالإضافة إلى ذلك، وسهولة الحصول على NECS يزيد من القدرة على إجراء التجارب في الخلايا من مختلف الجهات المانحة، مما يعزز من التحقق من صحة النتائج الإحصائية لوحظ. أخيرا، الأنف هي واحدة من المواقع الأولى أن تتعرض إلى أي نوع من الضغوطات المحمولة جوا. وبالتالي، وتوليد عضوي النمط فيالمختبر أنظمة محاكاة الثقافة الظهارة الأنفية هي مفيدة لدراسة استنشاق الجسيمات الفيروسية، والملوثات، حساسية، أو الغازات، وهو ما يمكن تحقيقه بسهولة باستخدام هذا النظام ثقافة الخلية.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nasal speculum</td>
 <td>Welch Allyn</td>
 <td>Model 22009</td>
 <td>9 mm, reusable polyproylene</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Operating otoscope</td>
 <td>Welch Allyn</td>
 <td>Model 21700</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rhino probe cell cuvette</td>
 <td>Arlington Scientific</td>
 <td>SY-96-092</td>
 <td>bend the head of the cuvette a little more</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12-well culture plates</td>
 <td>Corning</td>
 <td>3512</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Transwell membrane cell culture inserts</td>
 <td>Corning</td>
 <td>3460</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue culture flask </td>
 <td>Corning</td>
 <td>430639 and 430641</td>
 <td>T25 and T75 vented flask</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI 1640 media (with L-Glutamine)</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>11875</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bronchial/Tracheal Epithelial Cell Growth Medium</td>
 <td>Cell applications</td>
 <td>511-500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BEGM Bronchial Epithelial Cell Growth Medium</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>CC-3170</td>
 <td>This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium Bicarbonate 7.5% solution</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>25080</td>
 <td>Use as it is.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NuSerum</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>355104</td>
 <td>Use as it is.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BAMBANKER freezing media</td>
 <td>BAMBANKER</td>
 <td>302-14681</td>
 <td>Use as it is.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CoolCell </td>
 <td>Biocision</td>
 <td>HTBCS-136</td>
 <td>(CryoPrep alcohol-free cell freezing container)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PureCol</td>
 <td>AdvancedBioMatrix</td>
 <td>5005-B</td>
 <td>dilute 1:100 with sterile water (should be roughly 0.03 mg/ml)use 500 &mu;l/well of a 12-well plate</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HBSS with Ca2 and Mg2+</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>14025</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNAse 1</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>DN25</td>
 <td>Dissolve at 1.5 mg/ml, which is a 100x solution, add 10 &mu;l to each ml of media</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin, 0.25%, 1x, with phenol red</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>25200-056</td>
 <td>Use at it is</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Soy Bean Trypsin Inhibitor (SBTI)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>T6522</td>
 <td>Use dissolved in HBSS at a concentration of 1 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Retinoic acid</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>R7632</td>
 <td>Make it up 100 &mu;M stock solution (see below), dilute to 10 &mu;M with absolute alcohol, take 5 &mu;l of this and add it to 1 ml BEGM media (our working solution). 
 
 All-trans Retinol has a coefficient of extinction of 52,480 in ethanol at 325 nm. Dissolve 25 mg in 50 ml absolute ethanol. Serial dilutions need to be made, dilute 50 ml of stock in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, and again take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute Ethanol, take 100 ml of this and dilute in 900 ml absolute ethanol and read in the spectrophotometer at 325 nm, this number is then multiplied by its' dilution factor, then divided by the extinction coefficient of 52,480, this will give a number in mM. Make a 100 mM stock (store at -20 &deg;C) and from this stock a 10 mM aliquot is made, the daily retinoic acid needed would be 5 ml of this 10 mM aliquot in 995 ml ALI media.
 Example: 325nm reading is 1.15. 1.15 x 10,000 (dilution factor) / 52,480 = 0.219 = 219 mM, make a 100 mM stock from this, in absolute ethanol.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine and sodium pyruvate</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>11995</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bovine Pituitary Extract</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>13028-014</td>
 <td>Used for BEGM ALI media.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nystatin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>N4014-50 mg</td>
 <td>Make up a solution of 3.3 mg/ml.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bovine Serum Albumin</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP1600-100</td>
 <td>Make up a solution of 10 mg/ml solution in milliQ water.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PneumaCult-ALI media</td>
 <td>StemCell</td>
 <td>5001</td>
 <td>This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements. For details see below.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydrocortisone </td>
 <td>StemCell</td>
 <td>7904</td>
 <td>Dissolve 2.4 mg hydrocortisone in 1 ml ddH2O (used to make the 200x Hydrocortisone stock solution)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heparin Sodium Salt in PBS (2 mg/ml)</td>
 <td>StemCell</td>
 <td>7980</td>
 <td>Use at it is. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filter flasks (500 ml)</td>
 <td>Corning</td>
 <td>431097</td>
 <td>0.22 &mu;m pore size</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filter tubes (50 ml)</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>SCGP00525</td>
 <td>Steriflip, 0.22 &mu;m pore size</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pipette tips - ART Barrier Tips</td>
 <td>Molecular Bioproducts</td>
 <td>2139RI, 2069RI, 2179RI</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Conical tubes, sterile, 15 ml and 50 ml</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ddH2O, absolute ethanol, ice</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CO2 incubator</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>refrigerated centrifuge</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>biological safety cabinet</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pipettes (p2, p200, p1000), 9 in glass pipettes</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>gloves</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>lab coat with tight cuffs</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Media and solutions used:</td>
 <td>Recipe</td>
 <td>Used for</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="3">General remark: always warm the media to room temperature</td>
 </tr>
 <tr>
 <td rowspan="2">BEGM media</td>
 <td><ul><li> 500 ml BEGM Cell Application media with one aliquot of retinoic acid</li></ul> </td>
 <td>(mix them half-half and filter )</td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 500 ml BEGM Lonza media with one aliquot of single quot supplements </li></ul></td>
 <td><ul><li> digestion of the biopsy</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td rowspan="3">BEGM+ media</td>
 <td><ul><li> 50 ml BEGM media </li></ul></td>
 <td><ul><li> maintaining cells on plastic in the plates (passage0) </li></ul></td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 10 &mu;l retinoic acid (working solution)</li></ul> </td>
 <td><ul><li> seeding cells in the flask (passage1; partially)</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td><ul><li> maintain the cells in the flask </li></ul></td>
 </tr>
 <tr>
 <td rowspan="3">BEGM++ media</td>
 <td><ul><li> 50 ml Lonza's BEGM media with supplements</li></ul> </td>
 <td><ul><li> seeding fresh cells in 12-well plate on plastic</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 1 ml Sodium BiCarb</li></ul> </td>
 <td><ul><li> maintaining cells in the plates on plastic (passage0; only partially)</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 2.5 ml NuSerum</li></ul> </td>
 <td><ul><li> seeding cells in the flask (passage1; partially)</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td rowspan="5">BEGM ALI media</td>
 <td><ul><li> 250 ml DMEM-H </li></ul></td>
 <td rowspan="5"><ul><li> Maintaining cells on the transwell before they go ALI</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 250 ml BEGM including supplements</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 2 ml Bovine Pituitary Extract (12.5 mg/ml solution)</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 1 ml Nystatin (3.3 mg/ml solution)</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 75 &mu;l BSA (10 mg/ml solution)</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td rowspan="5">200X Hydrocortisone Stock Solution (96 &mu;l/ml solution)</td>
 <td><ul><li> 200 &mu;l dissolved hydrocortisone</li></ul> </td>
 <td rowspan="5"><ul><li> As a supplement to the PneumaCult-ALI Complete Base Medium for the last day in the flask and when cells are on inserts</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 4250 &mu;l dissolved sodium chloride </li></ul></td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 540 &mu;l ddH2O</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 10 &mu;l absolute ethanol</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filter solution through 0.22 &mu;m filter, aliquot solution and store at -20 &deg;C, avoid additional freeze/thaw cycles</td>
 </tr>
 <tr>
 <td rowspan="3">PneumaCult-ALI Complete Base Media</td>
 <td><ul><li> 450 ml PneumaCult-ALI Basal Medium</li></ul> </td>
 <td><ul><li> Base medium for all three PneumaCult-ALI media </li></ul></td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 50 ml PneumaCult 10x Supplement </li></ul></td>
 <td><ul><li> The PneumaCult media is light sensitive, thus always keep it in the dark</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(this is stable for 2 weeks at 2-8 &deg;C or for up to 6 months at -20 &deg;C)</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td rowspan="4">PneumaCult-ALI Maintenance Medium</td>
 <td>Per 1 ml of PneumaCult-ALI Complete Base Medium add:</td>
 <td rowspan="4">ALI culture on inserts</td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 10 &mu;l PneumaCult 100x Maintenance Supplement </li></ul></td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 2 &mu;l Heparin (of a 2 mg/ml stock solution) </li></ul></td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 5 &mu;l Hydrocortisone (of a 96 &mu;l/ml stock solution) </li></ul></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
 </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface

نماذج في المختبر باستخدام خلايا الظهارية الابتدائي الإنسان ضرورية في فهم المهام الرئيسية للظهارة التنفسية في سياق الالتهابات الميكروبية أو وكلاء استنشاقه. مقارنات مباشرة من الخلايا التي تم الحصول عليها من السكان المريضة تسمح لنا لتوصيف الظواهر المختلفة وتشريح الآليات الكامنة وراء التوسط تغييرات في وظيفة الخلايا الظهارية. زراعة الخلايا الظهارية من المنطقة رغامي قصبي الإنسان قد تم توثيقه جيدا، ولكن محدودة بسبب توافر أنسجة الرئة الإنسان أو الغازية المرتبطة الحصول على فرش الخزعات الشعب الهوائية. ويتم الحصول على الخلايا الظهارية من خلال الأنف أقل بكثير الغازية سطحية الخزعات كشط الأنف والموضوعات يمكن تحتاج فحص عدة مرات مع عدم وجود آثار جانبية كبيرة. بالإضافة إلى ذلك، والأنف هو نقطة الدخول إلى الجهاز التنفسي، وبالتالي واحدة من المواقع الأولى أن تتعرض إلى أي نوع من الضغوطات المحمولة جوا، مثل العوامل الميكروبية، والملوثات، أو المواد المسببة للحساسية. لفترة وجيزة، يتم توسيع الخلايا الظهارية الأنف تم الحصول عليها من متطوعين من البشر على المغلفة لوحات زراعة الأنسجة، ثم نقل على إدراج ثقافة الخلية. عند بلوغ confluency، تستمر الخلايا المراد تربيتها في واجهة الهواء السائل (علي)، لعدة أسابيع، مما يخلق أكثر من الناحية الفسيولوجية الظروف ذات الصلة. يستخدم حالة الثقافة ALI سائل الإعلام المعرفة مما يؤدي إلى ظهارة متباينة التي يسلك الخصائص المورفولوجية والوظيفية مشابهة لظهارة الأنف البشري، مع كل من خلايا مهدبة والمخاط المنتجة. إدراج زراعة الأنسجة مع الخلايا الظهارية الأنف متباينة يمكن التلاعب بها في مجموعة متنوعة من الطرق اعتمادا على أسئلة البحث (العلاج مع وكلاء الدوائية، تنبيغ مع ناقلات lentiviral، والتعرض للغازات، أو العدوى الميكروبية مع وكلاء) وتحليل للعديد من نقاط النهاية مختلفة تتراوح بين مسارات الخلوية والجزيئية، الفصل الوظيفيفي نفس الفئة، مورفولوجيا، الخ نماذج في المختبر من خلايا الظهارية البشرية المتباينة الأنف ستمكن المحققين لمعالجة الرواية وأسئلة بحثية هامة باستخدام نماذج تجريبية عضوي النمط التي تحاكي إلى حد كبير الظهارة الأنفية في الجسم الحي.

مثقف NECS بعد بروتوكول هنا وصفت إعادة التفريق، في طبقة غير متجانسة من ECS يتألف من خلايا مهدبة وغير مهدبة، ويمثل الوضع في الجسم الحي (الشكل 1). بعض NECS المتباينة هي المخاط إنتاج (خلايا تلطيخ في الزرقاء باستخدام AB / PAS، الشكل 1B). على الرغم من أن بروتوكول ...

Watch this Scientific Journal Video about Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface at JoVE.com

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

الخلايا الظهارية الأنفية، تم الحصول عليها من خلال كشط سطحية خزعة من متطوعين من البشر، يتم توسيع ونقل على إدراج زراعة الأنسجة. عند بلوغ confluency، وتزرع الخلايا في واجهة السائل الهواء، مما أسفر عن ثقافات خلايا مهدبة وغير مهدبة. متباينة الثقافات الخلايا الظهارية الأنف تقديم نماذج تجريبية قابلة للحياة لدراسة الغشاء المخاطي في الجهاز التنفسي.

زراعة خلايا الإنسان الظهارية الأنف في واجهة الهواء السائل

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

culturing-of-human-nasal-epithelial-cells-at-the-air-liquid-interface

Research

JoVE Journal

Biology

36.6K Views.  The University of North Carolina at Chapel Hill.  الخلايا الظهارية الأنفية، تم الحصول عليها من خلال كشط سطحية خزعة من متطوعين من البشر، يتم توسيع ونقل على إدراج زراعة الأنسجة. عند بلوغ confluency، وتزرع الخلايا في واجهة السائل الهواء، مما أسفر عن ثقافات خلايا مهدبة وغير مهدبة. متباينة الثقافا?...

Video: Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the function and structure of human epithelial cells. Here we describe in detail the method of growing bronchial epithelial cells from bronchial airway tissue that is harvested by the surgeon at the times of lung surgery (e.g. lung cancer or lung volume reduction surgery). With ethics approval and informed consent, the surgeon takes what is needed for pathology and provides us with a bronchial portion that is remote from the diseased areas. The tissue is then used as a source of explants that can be used for growing primary bronchial epithelial cells in culture. Bronchial segments about 0.5-1cm long and &le;1cm in diameter are rinsed with cold EBSS and excess parenchymal tissue is removed. Segments are cut open and minced into 2-3mm3 pieces of tissue. The pieces are used as a source of primary cells. After coating 100mm culture plates for 1-2 hr with a combination of collagen (30 &mu;g/ml), fibronectin (10 &mu;g/ml), and BSA (10 &mu;g/ml), the plates are scratched in 4-5 areas and tissue pieces are placed in the scratched areas, then culture medium (DMEM/Ham F-12 with additives) suitable for epithelial cell growth is added and plates are placed in an incubator at 37&deg;C in 5% CO2 humidified air. The culture medium is changed every 3-4 days. The epithelial cells grow from the pieces forming about 1.5 cm diameter rings in 3-4 weeks. Explants can be re-used up to 6 times by moving them into new pre-coated plates. Cells are lifted using trypsin/EDTA, pooled, counted, and re-plated in T75 Cell Bind flasks to increase their numbers. T75 flasks seeded with 2-3 million cells grow to 80% confluence in 4 weeks. Expanded primary human epithelial cells can be cultured and allowed to differentiate on air-liquid interface. Methods described here provide an abundant source of human bronchial epithelial cells from freshly isolated tissues and allow for studying these cells as models of disease and for pharmacology and toxicology screening.

Here we describe a detailed method for growing primary human bronchial epithelial cells from explants of human bronchial airway tissue including differentiated growth on an air-liquid interface. This method provides an abundant source of primary cells for investigating the role of the airway epithelium in human lung health and disease.

الإنسان الشعبي الأساسي الخلايا الظهارية نمت من Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

الاستقراء وتحليل الظهارية الوسيطة الانتقالية ل

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health and performance. Nucleic acid aptamers have been increasingly applied as recognition elements on biosensor platforms, but selecting aptamers toward small molecule targets requires special design considerations. This work describes modification and critical steps of a method designed to select structure-switching aptamers to small molecule targets. Binding sequences from a DNA library hybridized to complementary DNA capture probes on magnetic beads are separated from nonbinders via a target-induced change in conformation. This method is advantageous because sequences binding the support matrix (beads) will not be further amplified, and it does not require immobilization of the target molecule. However, the melting temperature of the capture probe and library is kept at or slightly above RT, such that sequences that dehybridize based on thermodynamics will also be present in the supernatant solution. This effectively limits the partitioning efficiency (ability to separate target binding sequences from nonbinders), and therefore many selection rounds will be required to remove background sequences. The reported method differs from previous structure-switching aptamer selections due to implementation of negative selection steps, simplified enrichment monitoring, and extension of the length of the capture probe following selection enrichment to provide enhanced stringency. The selected structure-switching aptamers are advantageous in a gold nanoparticle assay platform that reports the presence of a target molecule by the conformational change of the aptamer. The gold nanoparticle assay was applied because it provides a simple, rapid colorimetric readout that is beneficial in a clinical or deployed environment. Design and optimization considerations are presented for the assay as proof-of-principle work in buffer to provide a foundation for further extension of the work toward small molecule biosensing in physiological fluids.

A protocol is provided to select structure-switching aptamers for small molecule targets based on a tunable stringency magnetic bead selection method. Aptamers selected with structure-switching properties are beneficial for assays that require a conformational change to signal the presence of a target, such as the described gold nanoparticle assay.

منهج في اختيار الأبتامرات تبديل الهيكل تطبيقها على اللونية الذهب جسيمات متناهية الصغر الفحص

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Target selective AuNP based color assays have been developed in controlled proof-of-concept laboratory settings. However, these schemes have not been exerted to a point of failure to determine their practical use beyond laboratory settings. This work describes a generic approach to design, develop, and troubleshoot an aptamer-AuNP colorimetric assay for small molecule analytes and using the assay for in-the-field settings. The assay is advantageous because adsorbed aptamers passivate the nanoparticle surfaces and provide a means to reduce and eliminate false positive responses to non-target analytes. Transitioning this system to practical uses required defining not only the shelf-life of the aptamer-AuNP assay, but establishing methods and procedures for extending the long-term storage capabilities. Also, one of the recognized concerns with colorimetric readout is the burden placed on analysts to accurately identify often subtle changes in color. To lessen the responsibility on analysts in the field, a color analysis protocol was designed to perform the color identification duties without the need for performing this task on laboratory grade equipment. The method for creating and testing the data analysis protocol is described. However to understand and influence the design of adsorbed aptamer assays, the interactions associated with the aptamer, target, and AuNPs require further study. The knowledge gained could lead to tailoring aptamers for improved functionality.

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Additionally, a smart-device colorimetric application (app) was validated and long-term storage of the assay was established for use in the field.

تصميم وتطوير أبتمر الذهب الجسيمات النانوية وبناء اللونية فحوصات للتطبيقات الموجودة على الشبكة العالمية الحقل

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

واجهة المستخدم الرسومية لتتبع بمساعدة برنامج تركيز البروتين في النتوءات الخلوية الديناميكية

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

The Ingestion of Fluorescent, Magnetic Nanoparticles for Determining Fluid-uptake Abilities in Insects

Fluid-feeding insects ingest a variety of liquids, which are present in the environment as pools, films, or confined to small pores. Studies of liquid acquisition require assessing mouthpart structure and function relationships; however, fluid uptake mechanisms are historically inferred from observations of structural architecture, sometimes unaccompanied with experimental evidence. Here, we report a novel method for assessing fluid-uptake abilities with butterflies (Lepidoptera) and flies (Diptera) using small amounts of liquids. Insects are fed with a 20% sucrose solution mixed with fluorescent, magnetic nanoparticles from filter papers of specific pore sizes. The crop (internal structure used for storing fluids) is removed from the insect and placed on a confocal microscope. A magnet is waved by the crop to determine the presence of nanoparticles, which indicate if the insects are able to ingest fluids. This methodology is used to reveal a widespread feeding mechanism (capillary action and liquid bridge formation) that is potentially shared among Lepidoptera and Diptera when feeding from porous surfaces. In addition, this method can be used for studies of feeding mechanisms among a variety of fluid-feeding insects, including those important in disease transmission and biomimetics, and potentially other studies that involve nano- or micro-sized conduits where liquid transport requires verification.

Fluid-feeding insects have the ability to acquire minute quantities of liquids from porous surfaces. This protocol describes a method to directly determine the ability for insects to ingest liquids from porous surfaces using feeding solutions with fluorescent, magnetic nanoparticles.

ابتلاع فلوري، جسيمات نانوية مغناطيسية لتحديد قدرات امتصاص السوائل في الحشرات

Fluid-feeding insects ingest a variety of liquids, which are present in the environment as pools, films, or confined to small pores. Studies of liquid ...

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful in cases of attenuated, oligo- or mono-symptomatic forms of CF usually diagnosed later in life, and of CF-related disorders such as congenital bilateral absence of vas deferens, idiopathic chronic pancreatitis, allergic bronchopulmonary aspergillosis, and bronchiectasis. In both clinical and preclinical settings, the test has been used as a biomarker to quantify responses to targeted therapeutic strategies for CF. Adapting the test to a mouse is challenging and can entail an associated mortality. This paper describes the adequate depth of anesthesia required to maintain a nasal catheter in situ for continuous perfusion. It lists measures to avoid broncho-aspiration of solutions perfused in the nose. It also describes the animal care at the end of the test, including administration of a combination of antidotes of the anesthetic drugs, leading to rapidly reversing the anesthesia with full recovery of the animals. Representative data obtained from a CF and a wild-type mouse show that the test discriminates between CF and non-CF. Altogether, the protocol described here allows reliable measurements of the functional status of trans-epithelial chloride and sodium transporters in spontaneously breathing mice, as well as multiple tests in the same animal while reducing test-related mortality.

Here, we present a protocol to measure nasal potential difference in mice. The test quantifies the function of transmembrane ion transporters such as the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and the epithelial sodium channel. It is valuable to evaluate the efficacy of novel therapies for cystic fibrosis.

الآنف الفرق المحتملة التحديد الكمي للنقل عبر الظهارية أيون في الفئران

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

An Air-liquid Interface Bronchial Epithelial Model for Realistic, Repeated Inhalation Exposure to Airborne Particles for Toxicity Testing

For toxicity testing of airborne particles, air-liquid interface (ALI) exposure systems have been developed for in vitro tests in order to mimic realistic exposure conditions. This puts specific demands on the cell culture models. Many cell types are negatively affected by exposure to air (e.g., drying out) and only remain viable for a few days. This limits the exposure conditions that can be used in these models: usually relatively high concentrations are applied as a cloud (i.e., droplets containing particles, which settle down rapidly) within a short period of time. Such experimental conditions do not reflect realistic long-term exposure to low concentrations of particles. To overcome these limitations the use of a human bronchial epithelial cell line, Calu-3 was investigated. These cells can be cultured at ALI conditions for several weeks while retaining a healthy morphology and a stable monolayer with tight junctions. In addition, this bronchial model is suitable for testing the effects of repeated exposures to low, realistic concentrations of airborne particles using an ALI exposure system. This system uses a continuous airflow in contrast to other ALI exposure systems that use a single nebulization producing a cloud. Therefore, the continuous flow system is suitable for repeated and prolonged exposure to airborne particles while continuously monitoring the particle characteristics, exposure concentration, and delivered dose. Taken together, this bronchial model, in combination with the continuous flow exposure system, is able to mimic realistic, repeated inhalation exposure conditions that can be used for toxicity testing.

Described is the cell culture and exposure method of an in vitro bronchial model for realistic, repeated inhalation exposure to particles for toxicity testing.

نموذج ظهاري لواجهة هوائية-سائلة لتعرض واقعي ومكرر للاستنشاق للجسيمات المحمولة جواً لاختبار السمية

For toxicity testing of airborne particles, air-liquid interface (ALI) exposure systems have been developed for in vitro tests in order to mimic realistic ...

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an application of smFISH to measure the rates of transcription and mRNA degradation in Escherichia coli. As smFISH is based on fixed cells, we perform smFISH at multiple time points during a time-course experiment, i.e., when cells are undergoing synchronized changes upon induction or repression of gene expression. At each time point, sub-regions of an mRNA are spectrally distinguished to probe transcription elongation and premature termination. The outcome of this protocol also allows for analyzing intracellular localization of mRNAs and heterogeneity in mRNA copy numbers among cells. Using this protocol many samples (~50) can be processed within 8 h, like the amount of time needed for just a few samples. We discuss how to apply this protocol to study the transcription and degradation kinetics of different mRNAs in bacterial cells.

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

This protocol describes an application of single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) to measure the in vivo kinetics of mRNA synthesis and degradation.

فحص حركية الميرنا في المكان والزمان في الإشريكية القولونية باستخدام الفلورس أحادي الجزيء بلونين في التهجين الموقعي

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...

Isolation of Epithelial Cells from Human Dental Follicle

The dental follicle (DF) was harvested during the removal of an impacted third molar by an oral maxillofacial surgeon. Epithelial cell isolation was performed on the day of DF harvest. The DF was washed three times with DPBS and then dissected with tissue scissors until the tissue had a pulpy or squishy consistency. Single-cell populations were pelleted by centrifugation and washed with keratinocyte serum-free medium. Heterogeneous cell populations were distributed in a culture dish. Keratinocyte serum-free medium was used to select the epithelial cells. The culture medium was changed daily until no floating debris or dead cells were observed. Epithelial cells appeared within 7-10 days after cell population distribution. Epithelial cells survived in serum-free medium, while &#945;-modification minimal essential medium supplemented with 10% fetal bovine serum allowed the proliferation of mesenchymal-type cells. The DF is a tissue source for the isolation of dental epithelial cells.
The purpose of this study was to establish a method for the isolation of epithelial cells from human DF. Periodontal ligament (PDL) was used for the isolation of human dental epithelial cells. Procuring epithelial cells from human PDL is not always successful due to the small tissue volume, leading to low numbers of epithelial cells. DF has a larger volume than PDL and contains more cells. DF can be a tissue source for the primary culture of human dental epithelial cells. This protocol is easier and more efficient than the isolation method using PDL. Procuring human dental epithelial cells may facilitate further studies of dental epithelial-mesenchymal interactions.

The dental follicle contains an epithelial population and mesenchymal cells. The epithelial population was selected from the heterogeneous dental follicle cell population by providing a distinct culture medium. Epithelial cells survived and formed colonies in a serum-free medium.

عزل الخلايا الظهارية من بصيلات الأسنان البشرية

The dental follicle (DF) was harvested during the removal of an impacted third molar by an oral maxillofacial surgeon. Epithelial cell isolation was ...