نشكر مرفق البروتيوميات UAMS الطيفي للحصول على الدعم الشامل. وقدم التمويل لهذا المشروع من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة P20RR015569، P20RR016460 وR01DA025755.

يتم تعديل هذا البروتوكول من بلير وآخرون. 6. 1. LSD1 نزع الميثيل الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الحجم النهائي من 20 ميكرولتر، والجمع بين 125 نانوغرام LSD1 المؤتلف مع 0.25 ميكروغرام ثنائي الميثيل الببتيد H3 هيستون (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK، البيوتين) في المخزن demethylase (50 ملم تريس، الكلور الرقم الهيدروجيني 8.5، 50 ملي بوكل، 5 مم MgCl 2، 5٪ الجلسرين). بالإضافة إلى ذلك، إجراء مراقبة الببتيد وحده لا الانزيم. عنصر التحكم للباب 3 وليس بحاجة مثيلة الاختزالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجمع الببتيدات، إضافة 8 R2 بوروس ميكرولتر الخرز ميكرون 20 إلى كل عينة، وتستنهض الهمم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تعد حبات بوروس من خلال تعليق 1 حجم من الخرز مع 1 حجم من الميثانول، ومن ثم إضافة 10 مجلدا من حمض الفورميك 5٪ / TFA 0.2٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حالة 2 C 18 ZipTips بواسطة الشفط 20 ميكرولتر من TFA 0.1٪ في رأس ودفع مرة أخرى خارجا مع pipettor. فعل هذا مرتين مع تي 0.1٪اتحاد كرة القدم، أربع مرات مع الأسيتونيتريل 70٪ / TFA 0.1٪، وأربع مرات مرة أخرى مع TFA 0.1٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل العينتين (مراقبة وردود الفعل demethylase) على ZipTips C 18 مكيفة بواسطة pipetting الطين حبة وراء الراتنج C 18 في ZipTips ودفع من خلال حجم مع pipettor. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل ZipTips مرتين مع 20 ميكرولتر من TFA 0.1٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أزل في 40 ميكرولتر من الأسيتونيتريل 70٪ / TFA 0.1٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyophilize كل eluant تماما مع مكثف SpeedVac. </li></ol> 2. الاختزالية مثلأيشن يتم تعديل هذا الجزء من البروتوكول من بلير وآخرون. وRayment وآخرون. 6،7. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعادة تعليق على رد فعل demethylase في 100 ميكرولتر من 50 ملي العازلة الفوسفات ودرجة الحموضة 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في رد فعل demethylase، إضافة 8 ميكرولتر من 15 ملغ / مل ثنائي ميثيل أمين borane. يذوب Borane ثنائي ميثيل أمين في 50 ملي العازلة الفوسفات ودرجة الحموضة 7.4، لإعطاء 15 ملغ / مل حل الأوراق المالية.وينبغي بذل هذا الطازجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في رد فعل demethylase، يضيف 16 ميكرولتر من الفورمالديهايد 250 مم deuterated. يتم تحضير 250 ملم الفورمالديهايد deuterated بواسطة تمييع الأوراق المالية في H 2 0. وينبغي بذل هذا الطازجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان في 4 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 2.2 و 2.3 و 2.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 2.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 15 ساعة ~. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لعينة demethylase، إضافة 12.5 ميكرولتر من تريس 1M، ودرجة الحموضة 7.4 إلى إخماد رد فعل مثيلة الاختزالية. </li></ol> 3. MALDI قياس الطيف الكتلي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة بوروس الخرز R2 ميكرون 20 إلى رد فعل demethylase، وجمع في ZipTips كما هو موضح في الخطوات 1،3-1،6. </li></ol> ملاحظة: اعادة تعليق التحكم في 100 ميكرولتر من 50 ملي العازلة الفوسفات ودرجة الحموضة 7.4 وعلاج مثل عينة أخرى بدءا من الخطوة 3.1. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أزل الرقابة وعينات من رد فعل demethylase ZipTips على طبق من ذهب عينة MALDI باستخدام 2 ميكرولتر من 33٪ تشبعد 2،5-dihydroxybenzoic حامض. لإعداد 33٪ حمض 2،5-dihydroxybenzoic، جعل محلول مشبع من 2،5-dihydroxybenzoic حامض في الأسيتونيتريل 70٪ / TFA 0.1٪ ومن ثم تمييع إلى 33٪ في الأسيتونيتريل مشبعة 70٪ / TFA 0.1٪. السماح للعينات مزال حتى يجف وبلورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع أطياف الشامل باستخدام مطياف الكتلة PerkinElmerSciex MALDI-prOTOF أو متاح عالية الدقة MALDI مطياف الكتلة 8،9،10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عرض الأطياف واستخراج المناطق الذروة باستخدام PerkinElmerSciex TOFworks البرنامج أو البرامج المقدمة من قبل الشركة المصنعة مطياف الكتلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق من المنتجات رد فعل من قبل MS 2 مع نظام الإعلام المتاحة الطيفي توفير قدرات الشامل جنبا إلى جنب الطيفي. </li></ol> 4. تحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل التعويض عن التداخل النظائر التي تم إنشاؤها باستخدام الفورمالدهيد الثقيلة (الشكل 1B)، وتحديد منطقة ذروة (أ) نسبة 13 C 2 و 13 C اقاربهم النظائر 4ه إلى ذروة monoisotopic لعينة السيطرة، والتي لم يمر مثيلة مختزلة (الشكل 2A). مكافئ 1: 13C2 / A 12C = R 1 مكافئ 2: 13C4 / A 12C = ص 2 هذا وسوف أعطيك نسبة الببتيد الموجودة في هذه الدول النظائر (ص 1 و ص 2) محددة لتجربتك ومطياف الكتلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام R 1 و R 2 القيم في الصيغ التالية لقياس القيمة النسبية من الببتيد الموجودة في كل ولاية تعديل في العينة رد فعل demethylase (الشكل 2B): مكافئ 3: H3K4me2 = A 1 مكافئ (4): H3K4me = A 2 - ص 1 (A 1) مكافئ 5: H3K4 = A 3 - ص 2 (A 1) - [ص 1 (A 2 - ص 1 (A 1))] </li></ol> 5. ممثل النتائج باستخدام LSD1، وتبين لنا مدى فعالية MassSQUIRM لقياسيسين نزع الميثيل. أجرينا كما هو موضح في القسم نص البروتوكول، وفحص demethylase مع 125 نانوغرام من LSD1 و 0.25 ميكروغرام ثنائي الميثيل هيستون H3 الببتيد (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK، البيوتين). وتعرض لسيطرة وعينات رد فعل demethylase إلى مثيلة الاختزالية وMALDI قياس الطيف الكتلي. وأظهرت ردود الفعل الرقابة التي لم يخضع مثيلة الاختزالية المغلف نموذجي النظائر لهذا الببتيد، وقدمت المناطق الذروة لمعادلات 1 و 2 (الشكل 2A). قدمت الطيف الكتلي للتفاعل demethylase مناطق الذروة لمعادلات 3-5 (الشكل 2B). باستخدام مناطق الذروة من الرقابة ورد فعل demethylase، توصلنا إلى أن LSD1 demethylated الببتيد لإعطاء رد فعل المنتجات التالية: 33.7٪ ثنائي الميثيل Lys4، 42.3٪ أحادية الميثيل Lys4، و 24٪ من الامم المتحدة وميثليته اليس 4. الرجوع إلى بلير وآخرون. لتحليل كامل للنشاط LSD1 demethylase فضلا عن دراسات المانع 6. لاحظ أن تغيير المتغيرات مثل انزيم، وقت رد الفعلوسوف تركز والركيزة تركيز إتاحة الفرصة لإجراء تحليل متعمق للنشاط. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3604/3604fig1.jpg" /> الشكل 1. MassSQUIRM نظرة عامة. (A) وأظهر الببتيد N-محطة من H3 هيستون بأنها الامم المتحدة (الأخضر)، أحادية (الحمراء)، أو ثنائي (الأزرق) في ليسين ميثليته 4. الاختلاف في التركيب الكيميائي للكل الببتيد يؤدي إلى التأين الفرق جعل مجمع الكمي. (ب) مثيلة انتقاصية تحويل جميع مخلفات يسين للدولة ثنائي الميثيل والذي يسبب كل الببتيدات لتأيين بالمثل. استخدام الفورمالدهايد الثقيلة في رد فعل مثيلة الاختزالية يسمح الإبقاء على هوية مثيلة الأصلي. الدوائر المفتوحة تشير مثيلة ضوء في حين تشير الدوائر المغلقة مثيلة الثقيلة. التعديل من بلير وآخرون 6 2011. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3604/3604fig2.jpg" /> الارقام ..ويمكن استخدام ه 2. MassSQUIRM لتحديد الببتيد ميثليته تفاضلي. (أ) تم تحليل وثنائي ميثليته الاصطناعية هيستون H3 الببتيد (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK، البيوتين) باستخدام الطيف الكتلي ونسب الذروة بالنسبة إلى الذروة monoisotopic وكما لوحظ ص 1 و ص 2 في المعادلات 1 و 2. (ب) وحضنت والببتيد نفسه الاصطناعية مع LSD1 نانوغرام 125 في demethylase العازلة لمدة ساعتين في 37 درجة مئوية. وتعرض بعد ذلك عينات لتحليل MassSQUIRM. يسكنها خليط من تداخل القمم يمثل ثلاث ولايات مختلفة مثيلة كما رأينا في الشكل 1B. ولوحظت المناطق الخاضعة لقمم monoisotopic كما A 1، 2، و 3. واستخدمت المناطق الذروة في المعادلات 3-5. الدوائر المفتوحة تشير مثيلة ضوء في حين تشير الدوائر المغلقة مثيلة الثقيلة. التعديل من بلير وآخرون. 2011 6.

<ol>
	<li>Goldberg, A. D., Allis, C. D., Bernstein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics:+a+landscape+takes+shape.">Epigenetics: a landscape takes shape.</a> Cell. 128, 635-638 (2007).</li><li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifications+and+their+function.">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li><li>Blair, L. P., Cao, J., Zou, M. R., Sayegh, J., Yan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+Regulation+by+Lysine+Demethylase+5+(KDM5)+Enzymes+in+Cancer.">Epigenetic Regulation by Lysine Demethylase 5 (KDM5) Enzymes in Cancer.</a> Cancers (Basel). 3, 1383-1404 (2011).</li><li>Cole, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+probes+for+histone-modifying+enzymes.">Chemical probes for histone-modifying enzymes.</a> Nat. Chem. Biol. 4, 590-597 (2008).</li><li>Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+demethylation+mediated+by+the+nuclear+amine+oxidase+homolog+LSD1.">Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1.</a> Cell. 119, 941-953 (2004).</li><li>Blair, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MassSQUIRM:+An+assay+for+quantitative+measurement+of+lysine+demethylase+activity.">MassSQUIRM: An assay for quantitative measurement of lysine demethylase activity.</a> Epigenetics. 6, 490-499 (2011).</li><li>Rayment, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+myosin+subfragment-1:+a+molecular+motor.">Three-dimensional structure of myosin subfragment-1: a molecular motor.</a> Science. 261, 50-508 (1993).</li><li>Collom, S. L., Jamakhandi, A. P., Tackett, A. J., Radominska-Pandya, A., Miller, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CYP2E1+active+site+residues+in+substrate+recognition+sequence+5+identified+by+photoaffinity+labeling+and+homology+modeling.">CYP2E1 active site residues in substrate recognition sequence 5 identified by photoaffinity labeling and homology modeling.</a> Arch. Biochem. Biophys. 459, 59-69 (2007).</li><li>Gradolatto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+cerevisiae+Yta7+Regulates+Histone+Gene+Expression.">Saccharomyces cerevisiae Yta7 Regulates Histone Gene Expression.</a> Genetics. 179, 291-304 (2008).</li><li>Taverna, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yng1+PHD+finger+binding+to+histone+H3+trimethylated+at+lysine+4+promotes+NuA3+HAT+activity+at+Lysine+14+of+H3+and+transcripiton+at+a+subset+of+targeted+ORFs.">Yng1 PHD finger binding to histone H3 trimethylated at lysine 4 promotes NuA3 HAT activity at Lysine 14 of H3 and transcripiton at a subset of targeted ORFs.</a> Mol. Cell. 24, 785-796 (2006).</li></ol>

ليس لدينا ما يكشف.

MassSQUIRM هي طريقة غير مكلفة والكمية لتحليل شامل لنشاط demethylases يسين المشاركين في أحادية و ثنائي مثيلة. MassSQUIRM تقدم الكميات ليس فقط من نتاج رد فعل، بل أيضا من أجل وسيطة. ويمكن استخدام هذا الاختبار باعتبارها أداة قوية في دراسة آلية demethylases هيستون LSD1 وغيرها. وسوف يكون من المفيد...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td> LSD1 </td><td> BPS العلوم البيولوجية </td><td> 50100 </td></tr><tr><td> H3K4me2-البيوتين الببتيد </td><td> أعدت في المنزل </td><td> لا شيء </td></tr><tr><td> بوروس R2 20 حبات ميكرون </td><td> النظم البيولوجية التطبيقية </td><td> 1-1129-06 </td></tr><tr><td> C 18 ZipTip </td><td> ميليبور </td><td> ZTC18M </td></tr><tr><td> Trifluoroacetic حامض (TFA) </td><td> الحرارية </td><td> 28904 </td></tr><tr><td> الأسيتونيتريل </td><td> الصياد </td><td> A996 </td></tr><tr><td> 2،5-dihydroxybenzoic حامض </td><td> سيغما </td><td> 85707 </td></tr><tr><td> Borane ثنائي ميثيل أمين </td><td> سيغما </td><td> 180238 </td></tr><tr><td> الثقيلة isotopically د 2-الفورمالديهايد </td><td> كامبردج النظائر مختبرات </tد&gt; <td> DLM-805-20 </td></tr><tr><td> تريس </td><td> الصياد </td><td> BP154 </td></tr><tr><td> بوكل </td><td> الصياد </td><td> BP366 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> الصياد </td><td> BP214 </td></tr><tr><td> الغليسيرول </td><td> الصياد </td><td> G33 </td></tr><tr><td> حمض الفورميك </td><td> Fluka </td><td> 06440 </td></tr><tr><td> الميثانول </td><td> الصياد </td><td> A452 </td></tr><tr><td> NA-فوسفات </td><td> الصياد </td><td> BP329 </td></tr><tr><td> SpeedVac المكثف </td><td> رجل علم </td><td> DNA110 </td></tr><tr><td> MALDI-prOTOF مطياف الكتلة والبرمجيات TOFworks </td><td> PerkinElmerSciex </td><td> لا شيء </td></tr></tbody></table>

application of masssquirm for quantitative measurements of lysine demethylase activity

مؤخرا، تم اكتشاف المنظمين جينية واللاعبين الرئيسيين في العديد من الأمراض المختلفة 1-3. ونتيجة لذلك، هذه الانزيمات من الاهداف الرئيسية لدراسات جزيء صغير والمخدرات 4 التنمية. المنظمين جينية كثيرة في الآونة الأخيرة فقط تم اكتشاف و لا تزال في طور تصنيفها. من بين هذه الانزيمات هي demethylases ليسين التي إزالة مجموعات الميثيل من lysines على histones والبروتينات الأخرى. نظرا لطبيعة رواية من هذا النوع من الانزيمات، وقد وضعت بعض المقايسات لدراسة نشاطها. وكان هذا كتلة الطريق إلى تصنيف كل من وعالية الإنتاجية من الدراسة demethylases هيستون. حاليا، المقايسات demethylase عدد قليل جدا من الوجود. تلك التي لا توجد تميل الى ان تكون ذات طابع نوعي، ولا يمكن تبين في وقت واحد بين الولايات مثيلة ليسين مختلفة (الامم المتحدة، أحادي، ثنائي وثلاثي). ويشيع استخدام الطيف الكتلي لتحديد نشاط demethylase ولكن هل الحالي المقايسات الطيفي الشامللا تتناول ما إذا الببتيدات ميثليته تفاضلي تأين بشكل مختلف. التأين الفرق من الببتيدات ميثليته يجعل من الصعب المقارنة بين الولايات مثيلة وبالتأكيد ليس كمي (الشكل 1A). وبالتالي ليست الأمثل المقايسات المتاحة لتحليل شامل للنشاط demethylase. نحن هنا وصف طريقة تسمى MassSQUIRM (تحديد الكميات الطيفي الشامل باستخدام مثيلة الاختزالية النظائر) والتي تقوم على مثيلة الاختزالية للجماعات أمين مع الفورمالدهيد deuterated لاجبار جميع lysines ليكون ثنائي ميثليته، مما يجعلها أساسا الأنواع الكيميائية نفسها، وبالتالي تأيين نفس (الشكل 1B). الفرق الكيميائية فقط بعد مثيلة الاختزالية هو الهيدروجين والديوتيريوم، الذي لا يؤثر على الكفاءة التأين MALDI. الفحص MassSQUIRM غير محددة لمنتجات التفاعل مع demethylase lysines الامم المتحدة، أحادية أو ثنائي ميثليته. الفحص ينطبق أيضا على methyltransferases يسين إعطاء SAلي منتجات التفاعل. هنا، ونحن نستخدم مزيج من الكيمياء مثيلة الاختزالية وMALDI مطياف الكتلة لقياس نشاط LSD1، وهو demethylase يسين قادر على إزالة ثنائي وأحادي الميثيل الجماعات، على ركيزة الببتيد الاصطناعية 5. هذا الفحص بسيط وقابلة بسهولة إلى أي مختبر مع الوصول إلى مطياف الكتلة MALDI في المختبر أو من خلال مرفق البروتيوميات. الفحص له ~ 8 أضعاف نطاق الدينامية وغير قابلة للتطوير بسهولة على شكل لوحة 5.

Watch this Scientific Journal Video about Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity at JoVE.com

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

نحن نقدم طريقة لاستخدام MALDI قياس الطيف الكتلي والاختزالية الكيمياء مثيلة لقياس التغيرات في مثيلة ليسين.

تطبيق MassSQUIRM لقياسات كمية من نشاط Demethylase ليسين

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small ...

application-masssquirm-for-quantitative-measurements-lysine

Research

JoVE Journal

Biology

13.3K Views.  University of Arkansas for Medical Sciences. نحن نقدم طريقة لاستخدام MALDI قياس الطيف الكتلي والاختزالية الكيمياء مثيلة لقياس التغيرات في مثيلة ليسين.

Video: Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

على الفحص لقياس نشاط القولونية محرض يسين Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base excision repair (BER) molecular beacons. The substrate (beacon) is comprised of a deoxyoligonucleotide containing a single base lesion with a 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) moiety conjugated to the 5'end and a Dabcyl moiety conjugated to the 3' end of the oligonucleotide. The BER molecular beacon is 43 bases in length and the sequence is designed to promote the formation of a stem-loop structure with 13 nucleotides in the loop and 15 base pairs in the stem1,2. When folded in this configuration the 6-FAM moiety is quenched by Dabcyl in a non-fluorescent manner via F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET)3,4. The lesion is positioned such that following base lesion removal and strand scission the remaining 5 base oligonucleotide containing the 6-FAM moiety is released from the stem. Release and detachment from the quencher (Dabcyl) results in an increase of fluorescence that is proportionate to the level of DNA repair. By collecting multiple reads of the fluorescence values, real-time assessment of BER activity is possible. The use of standard quantitative real-time PCR instruments allows the simultaneous analysis of numerous samples. The design of these BER molecular beacons, with a single base lesion, is amenable to kinetic analyses, BER quantification and inhibitor validation and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor cell lysates or with purified proteins. The analysis of BER activity in tumor lysates or tissue aspirates using these molecular beacons may be applicable to functional biomarker measurements. Further, the analysis of BER activity with purified proteins using this quantitative assay provides a rapid, high-throughput method for the discovery and validation of BER inhibitors.

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates. The assay yields rates of DNA Repair activity amenable to kinetic analysis and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor lysates or with purified proteins.

كمي، في الوقت الحقيقي وتحليل قاعدة الختان في نشاط إصلاح Lysates خلية الاستفادة من الآفات محددة منارات الجزيئية

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

التصور والتحليل من جزيئات الرنا المرسال عن طريق الإسفار<em&gt; في الموضع</em&gt; التهجين في<em&gt; خميرة الخباز</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

قياس الكالسيوم عصاري خلوي في الخلايا الظهارية الكلوية بواسطة التدفق الخلوي

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays crucial roles in cell development and many diseases. Approximately 5,000 lysine methylation sites were identified on different proteins, which are set by few dozens of protein lysine methyltransferases. This suggests that each PKMT methylates multiple proteins, however till now only one or two substrates have been identified for several of these enzymes. To approach this problem, we have introduced peptide array based substrate specificity analyses of PKMTs. Peptide arrays are powerful tools to characterize the specificity of PKMTs because methylation of several substrates with different sequences can be tested on one array. We synthesized peptide arrays on cellulose membrane using an Intavis SPOT synthesizer and analyzed the specificity of various PKMTs. Based on the results, for several of these enzymes, novel substrates could be identified. For example, for NSD1 by employing peptide arrays, we showed that it methylates K44 of H4 instead of the reported H4K20 and in addition H1.5K168 is the highly preferred substrate over the previously known H3K36. Hence, peptide arrays are powerful tools to biochemically characterize the PKMTs.

Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

تحليل خصوصية البروتين ليسين ميثيل عن طريق SPOT الببتيد صفائف

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

إعادة إعماره الوظيفية وآخر قناة قياسات تنقية Wildtype والمسخ CFTR البروتين

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and exhibit a pro-inflammatory phenotype. Although the development of microfluidic devices has been embraced by engineers over two decades, their biological applications remain limited. A more physiologically relevant in vitro microvessel model validated by biological applications is important to advance the field and bridge the gaps between in vivo and in vitro studies. Here, we present detailed procedures for the development of cultured microvessel network using a microfluidic device with a long-term perfusion capability. We also demonstrate its applications for quantitative measurements of agonist-induced changes in EC [Ca2+]i and nitric oxide (NO) production in real time using confocal and conventional fluorescence microscopy. The formed microvessel network with continuous perfusion showed well-developed junctions between ECs. VE-cadherin distribution was closer to that observed in intact microvessels than statically cultured EC monolayers. ATP-induced transient increases in EC [Ca2+]i and NO production were quantitatively measured at individual cell levels, which validated the functionality of the cultured microvessels. This microfluidic device allows ECs to grow under a well-controlled, physiologically relevant flow, which makes the cell culture environment closer to in vivo than that in the conventional, static 2D cultures. The microchannel network design is highly versatile, and the fabrication process is simple and repeatable. The device can be easily integrated to the confocal or conventional microscopic system enabling high resolution imaging. Most importantly, because the cultured microvessel network can be formed by primary human ECs, this approach will serve as a useful tool to investigate how pathologically altered blood components from patient samples affect human ECs and provide insight into clinical issues. It also can be developed as a platform for drug screening.

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

تطوير وتوصيف<em&gt; في المختبر</em&gt; شبكة Microvessel والقياسات الكمية من غشائي [كا<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; ط</sub&gt; والنيتريك إنتاج أكسيد

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. These transport mechanisms are mediated by the activities of specialized transporter proteins. Specifically,pH dynamics are finely controlled by plasma membrane proton (H+) extrusion systems, such as the Na+/H+ exchanger (NHE) protein family. Despite extensive efforts to study the mechanisms underlying NHE regulation, our current understanding of the biophysical and molecular properties of the NHE family is inadequate because of the limited availability of methods to effectively measure NHE activity. In this manuscript, we used H+-selective electrodes during whole-cell patch clamping recording to measure NHE-induced H+ flux. We proposed this approach to overcome some limitations of typically used methods to measure NHE activity, such as radioactive uptake and fluorescent membrane permeants. Measurement of NHE activity using the described method enables high sensitivity and time resolution and more efficient control of intracellular H+ concentrations. H+-selective electrodes are based on the fact that transporter activity creates an ion gradient in close proximity to the cell membrane. An H+-selective electrode moving up to and away from the cell membrane in a repetitive, oscillatory fashion records a voltage difference that is dependent on H+ flux. While H+-selective electrodes are used to detect H+ flux moving out of the cell, the patch clamp method in the whole-cell configuration is used to control the intracellular ion composition. Moreover, application of the giant patch clamp technique allows modification of the intracellular composition of not only ions but also lipids. The transporter activity of NHE isoform 3 (NHE3) was measured using this technical approach to study the molecular basis of NHE3 regulation by phosphoinositides.

This manuscript describes the applications of proton-selective electrodes and patch clamping methods to measure the activity of proton transport systems. These methods overcome some limitations of techniques commonly used to study proton transport activity, such as moderate sensitivity, time resolution and insufficient intracellular milieu control.

تطبيق القياس الكهربية لدراسة نشاط الناقلين محايدة الكهربائية

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein functions, for example, by changing enzymatic activity or by mediating interactions. Precise quantification of site-specific protein acylation occupancy, or stoichiometry, is essential for understanding the functional consequences of both global low-level stoichiometry and individual high-level acylation stoichiometry of specific lysine residues. Other groups have reported measurement of lysine acetylation stoichiometry by comparing the ratio of peptide precursor isotopes from endogenous, natural abundance acylation and exogenous, heavy isotope-labeled acylation introduced after quantitative chemical acetylation of proteins using stable isotope-labeled acetic anhydride. This protocol describes an optimized approach featuring several improvements, including: (1) increased chemical acylation efficiency, (2) the ability to measure protein succinylation in addition to acetylation, and (3) improved quantitative accuracy due to reduced interferences using fragment ion quantification from data-independent acquisitions (DIA) instead of precursor ion signal from data-dependent acquisition (DDA). The use of extracted peak areas from fragment ions for quantification also uniquely enables differentiation of site-level acylation stoichiometry from proteolytic peptides containing more than one lysine residue, which is not possible using precursor ion signals for quantification. Data visualization in Skyline, an open source quantitative proteomics environment, allows for convenient data inspection and review. Together, this workflow offers unbiased, precise, and accurate quantification of site-specific lysine acetylation and succinylation occupancy of an entire proteome, which may reveal and prioritize biologically relevant acylation sites.

Here, we present unbiased quantification of site-specific protein acetylation and/or succinylation occupancy (stoichiometry) of an entire proteome through a ratiometric analysis of endogenous modifications to modifications introduced after quantitative chemical acylation using stable isotope-labeled anhydrides. In combination with sensitive data-independent acquisition mass spectrometry, accurate site occupancy measurements are obtained.

التحديد الكمي للبروتين خاصة بالموقع يسين Acetylation و Succinylation Stoichiometry الكتلي حيازة مستقلة عن البيانات باستخدام

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...

Particle Templated Emulsification enables Microfluidic-Free Droplet Assays

Reactions performed in monodispersed droplets afford enhanced accuracy and sensitivity compared to equivalent ones performed in bulk. However, the requirement of microfluidics to form controlled droplets imposes a barrier to non-experts, limiting their use. Here, we describe particle templated emulsification, an approach to generate monodisperse droplets without microfluidics. Using templating hydrogel spheres, we encapsulate samples in monodispersed droplets by simple vortexing. We demonstrate the approach by using it to perform microfluidic-free digital PCR.

Water-in-oil droplet assays are useful for analytical chemistry, enzyme evolution, and single cell analysis, but typically require microfluidics to form the droplets. Here, we describe particle templated emulsification, a microfluidic-free approach to perform droplet assays.