ويدعم هذا العمل في شكل منح المعاهد الوطنية للصحة جزء R01 A1064826-01، U19 AI062627-01، NO1، HHSN26600500032C (لSM). ونحن نشكر أعضاء مختبرنا للحصول على مساعدة مناقشة والتقنية، وتينا هايل لمراجعة نقدية للمخطوطة. نود أن نشكر ديفيد بينا، وميلووكي مختبر وزارة الصحة للثقافة وفيروس PCR.

<ol>
	<li>Hirst, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+agglutination+of+red+cells+by+allantoic+fluid+of+chick+embryos+infected+with+influenza+virus.">The agglutination of red cells by allantoic fluid of chick embryos infected with influenza virus.</a> Science. 94, 22-23 (1941).</li><li>Jonsson, N., Gullberg, M., Lindberg, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+polymerase+chain+reaction+as+a+rapid+and+efficient+alternative+to+estimation+of+picornavirus+titers+by+tissue+culture+infectious+dose+50%+or+plaque+forming+units.">Real-time polymerase chain reaction as a rapid and efficient alternative to estimation of picornavirus titers by tissue culture infectious dose 50% or plaque forming units.</a> Microbiol. Immunol. 53, 149-154 (2009).</li><li>Kalter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemagglutinating+Behavior+of+Mouse+and+Egg-adapted+Type+A+(PR8)+Influenza+Virus.">Hemagglutinating Behavior of Mouse and Egg-adapted Type A (PR8) Influenza Virus.</a> Science. 110, 184-184 (1949).</li><li>Dulbecco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Plaques+in+Monolayer+Tissue+Cultures+by+Single+Particles+of+an+Animal+Virus.">Production of Plaques in Monolayer Tissue Cultures by Single Particles of an Animal Virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 38, 747-752 (1952).</li><li>Deyde, V. M., Nguyen, T., Bright, R. A., Balish, A., Shu, B., Lindstrom, S., Klimov, A. I., Gubareva, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+molecular+markers+of+antiviral+resistance+in+influenza+A+(H5N1)+viruses+using+a+pyrosequencing+method.">Detection of molecular markers of antiviral resistance in influenza A (H5N1) viruses using a pyrosequencing method.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 53, 1039-1047 (2009).</li><li>Jonsson, N., Gullberg, M., Lindberg, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+polymerase+chain+reaction+as+a+rapid+and+efficient+alternative+to+estimation+of+picornavirus+titers+by+tissue+culture+infectious+dose+50%+or+plaque+forming+units.">Real-time polymerase chain reaction as a rapid and efficient alternative to estimation of picornavirus titers by tissue culture infectious dose 50% or plaque forming units.</a> Microbiol. Immunol. 53, 149-154 (2009).</li><li>Rahman, M., Kieke, B. A., Vandermause, M. F., Mitchell, P. D., Greenlee, R. T., Belongia, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+Directigen+flu+A+B+enzyme+immunoassay+and+direct+fluorescent+assay+for+detection+of+influenza+infection+during+the+2004-2005+season.">Performance of Directigen flu A+B enzyme immunoassay and direct fluorescent assay for detection of influenza infection during the 2004-2005 season.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 58, 413-418 (2007).</li><li>Landry, M. L., Ferguson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suboptimal+detection+of+influenza+virus+in+adults+by+the+Directigen+Flu+A+B+enzyme+immunoassay+and+correlation+of+results+with+the+number+of+antigen-positive+cells+detected+by+cytospin+immunofluorescence.">Suboptimal detection of influenza virus in adults by the Directigen Flu A+B enzyme immunoassay and correlation of results with the number of antigen-positive cells detected by cytospin immunofluorescence.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 3407-3409 (2003).</li><li>Herrmann, B., Larsson, C., Zweygberg, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+and+typing+of+influenza+viruses+A+and+B+by+a+nested+reverse+transcription-PCR:+comparison+to+virus+isolation+and+antigen+detection+by+immunofluorescence+and+optical+immunoassay+(FLU+OIA).">Simultaneous detection and typing of influenza viruses A and B by a nested reverse transcription-PCR: comparison to virus isolation and antigen detection by immunofluorescence and optical immunoassay (FLU OIA).</a> J. Clin. Microbiol. 39, 134-138 (2001).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints.">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> Am. J. Epidemiol. 27, 493-497 (1938).</li><li>Doerr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins:+into+the+infrared.">Fluorescent proteins: into the infrared.</a> Nat. Meth. 6, 482-483 (2009).</li><li>Shu, B., Wu, K. H., Emery, S., Villanueva, J., Johnson, R., Guthrie, E., Berman, L., Warnes, C., Barnes, N., Klimov, A., Lindstrom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+performance+of+the+CDC+real-time+reverse+transcriptase+PCR+swine+flu+panel+for+detection+of+2009+A+(H1N1)+pandemic+influenza+virus.">Design and performance of the CDC real-time reverse transcriptase PCR swine flu panel for detection of 2009 A (H1N1) pandemic influenza virus.</a> J. Clin. Microbiol. 49, 2614-2619 (2011).</li></ol>

ليس لدينا ما يكشف.

اندلاع وباء انفلونزا الطيور مؤخرا في جنوب شرق آسيا والخوف العالمي من وباء انفلونزا الخنازير فرض مخاوف هائلة على الصحة والسلامة العامة. فقد تم تخصيص التركيز الحاسمة في توليد لقاحات للسلالات الحالية والجديدة من فيروس الانفلونزا. وسوف توفر تقنيات عالية الإنتاجية سريع للكشف عن حسابات دقيقة ودقيقة عيار الفيروسية تحسن بشكل هائل العلاج. التقنيات الأكثر شيوعا المستخدمة لحساب عيار فيروس تشمل فحوصات لوحة التراص تشكيل والأنفلونزا. وقد وضعت لأول مرة فحص لوحة تشكيل لتقدير التتر عاثية واعتمد من قبل Dulbecco ريناتو لحساب التتر فيروسي حيواني 4. لإجراء هذا الاختبار، يتم إعداد بمقدار 10 أضعاف التخفيفات من الأوراق المالية أو إنفلونزا عينات حيوانية مثل السائل BAL ويتم تلقيح 0،1 aliquots مل على لأحادي الطبقة من الخلايا MDCK في 6 لوحات جيدة. ولا يسمح للفيروس إلى كثف على الخلايا MDCK يليه إعلانdition من وسيط المواد الغذائية والاغاروز. أثناء الحضانة، والخلايا الأصلية المصابة الافراج عن سلالة الفيروسية التي تنتشر فقط على الخلايا المجاورة. تأثير ممرض للخلايا من عدوى الانفلونزا الفيروسية وتنتج منطقة دائرية من الخلايا المصابة تسمى لوحة. يفترض أن يتم تشكيل كل لوحة بعد الإصابة من خلية واحدة مع جسيمات الفيروس واحدة تليها تكرار الفيروس. ويمكن تعزيز التباين بين الخلايا الحية واللوحات وبواسطة الأصباغ مثل البنفسجي وضوح الشمس. والعيب الرئيسي من هذا الفحص هو عدم وجود استنساخ والتغيرات الهائلة في التجارب. آخر فحص تستخدم لتحديد عيار الأنفلونزا الفيروسية هو مقايسة التراص. الحاضر راصة دموية بروتين على سطح فيروس الانفلونزا تربط بكفاءة للبروتينات التي تحتوي على حامض N-acetylneuraminic في الثدييات والطيور خلايا الدم الحمراء 1. هذا التفاعل بين فيروس الانفلونزا وكريات الدم الحمراء ويؤدي إلى تراص في شكل شعرية. لامويستخدم إيفل من تراص لتقدير عيار من فيروس الانفلونزا في عينات الاختبار. وتستخدم كريات الدم الحمراء مقايسة التراص فقط لتحديد المعايرة من فيروس يعرف، ولا يمكن أن تستخدم لأغراض تحديد سلالة. منذ هذا الاختبار لا يفرق بين الحي والميت للفيروسات، فإنه من الصعب الحصول على حساب دقيق من التتر الفيروسية. وتستند التشخيصات السريرية الحالية من عدوى الإنفلونزا على اختبار مصل الدم، بوليميريز سلسلة من ردود الفعل، مباشرة المناعي عينة والثقافة الخلية 1،6. ووصف الطريقة الجديدة هنا أيضا إمكانية التشخيص السريري والمختبري. إنفلونزا كشف مجموعات Directigen الانفلونزا A. دينار بحريني (علوم الأحياء، سان خوسيه، كاليفورنيا) وBinaxNow (Binax، وشركة، سكاربورو، ME) استخدام فحص للكشف عن immunochromatography مستضد الفيروسية مثل البروتين النووي 7 ويمكن استخدام هذه المجموعات، والكشف عن فيروس يمكن تحقيقه في غضون 15 دقيقة، ولكن جميع العينات سلبية من الضروري أن تكون الصورة أيضاcreened من قبل خلية أسلوب ثقافة. وأفادت دراسات مختلفة أيضا انخفاض الحساسية لهذه المجموعات، وخصوصا، عندما العدوى كانت معتدلة أو منخفضة 8. في طريقة لنا، ونحن باستمرار اكتشاف ما يصل الى 100 PFU من الفيروس. وهذا يوحي لنا تقنية مفيدة في الكشف عن الفيروس H1N1 في العينات السريرية، حتى عندما تكون الإصابة خفيفة. وتم الإبلاغ عن طريقة مضان القائم على كشف المستضدات الفيروسية، حيث تم تحليل العينات إما بشكل مباشر أو نضح البلعوم تم تلقيح في الصعود إلى أحادي الطبقة من الخلايا عرضة لتكاثر الفيروس والتحليلات اللاحقة 9. ومع ذلك، وتقتصر هذه الطرق لأغراض التشخيص وغير مناسبة لإجراء العمليات الحسابية عيار الفيروس. Q-PCR يساعد على تحديد وجود الحمض النووي الريبي الفيروسي ولا تقدير العدوى من فيروسات حية. بالمقارنة مع هذه المقايسات، والأشعة تحت الحمراء نظام الفحص قائم على الأصباغ مساعدة في الكشف عن والفيروسية تعداد عيار في العينات السريرية والمخبرية. في حالة اندلاع الانفلونزا، فمنحاسم لتشخيص آلاف العينات في فترة زمنية قصيرة. يمكن أن أسلوبنا يستند على طبق من 384 جيدا، والماسحة الضوئية الحمراء تفحص 6 لوحات في وقت واحد (&gt; 2000 عينة)، وتقدم بالتالي أكبر ميزة على أساليب أخرى فلوري مباشرة. يمكن أن الجدوى من سرعة معالجة الآلاف من العينات السريرية تقليل اختبار تقلباته، وطول الوقت وتكاليف الفحص. استخدام جسم مضاد M2 محددة توفر ميزة كونها مستقلة عن الخلافات السلالة في البروتينات H و N. يتم حفظها نسبيا من البروتين M2، في معظم سلالات الأنفلونزا تصيب البشر. إذا يتم الجمع بين الأضداد محددة لالبقع المنتشرة مع نظامنا لا يمكن للمرء قياس كل من عيار من الفيروسات والتعرف على السلالة. ومع ذلك، منذ M2 هو الهدف لهذه الأدوية مثل الأمانتادين، يمكن أن تنشأ المسوخ التي قد تغيير موقع ملزم لخريطة موقع المستخدمة هنا. وهذا يمثل الحد المحتملة لهذا النظام في الأفراد الذين يخضعون للعلاج بواسطة هذه العقاقير. متعدديتم استخدام فحوصات تعداد التتر الأنفلونزا في عينات الاختبار. لحساب فيروس عيار، 50٪ جرعة زراعة الأنسجة المعدية (TCID 50) والبيض السقائي فحوصات السائل المستندة إلى وتستخدم على نطاق واسع 1،10. ومع ذلك، متطلبات عدة أيام جعل هذه الأساليب أقل موثوقية. علاوة على ذلك، في هذه الأساليب الحسابات على اساس تغير 50٪ في عدد من لوحات توفير المعايرة الفيروسية النظرية ولكن ليست دقيقة. لا يمكن أن يؤديها لوحة تشكيل المقايسات خلال 96 ساعة، ولكن عدم وجود استنساخ هو مصدر قلق كبير في العمليات الحسابية عيار الفيروسية. الأسلوب الحالي وصفها هنا له مزايا عدة متميزة. الأول، وهو أسلوب استنساخه للغاية مع نتائج متسقة. وتستند الثانية، وحسابات عيار الفيروسية في تقدير بسيط من كثافة مضان أن تتم مقارنة ضد منحنيات معيار محدد. الثالث، ويمكن استخدام اثنين أو أكثر من الأجسام المضادة الأولية لتشخيص الأنماط المصلية متعددة في نموذج معين. أيضا، IR صبغ مترافق الأجسام المضادة لها قطرةوقد استخدمت شركة تألق ذاتي والتصوير الخلية 11. الأشعة فوق البنفسجية أو الأشعة المرئية (300-600 نانومتر) النتائج في تألق ذاتي الخلوية مرتفعة بسبب وجود fluorophores ذات العوائد المرتفعة الكم الذاتية. وتشمل هذه الأحماض الأمينية العطرية ويبو أصباغ، النيوكليوتيدات pyridinic (NADPH)، الإيلاستين والكولاجين والإنزيمات المساعدة فلافين. هذه الخاصية الجوهرية للخلايا يجعل من الصعب الاستفادة من هذه المصادر من الإشعاع كما مجسات لقياس التعبير عن بروتينات معينة. في المقابل، القريب من الأشعة تحت الحمراء الأصباغ تثير وتطلق بين 670-1000 نانومتر. جزيئات المضيف العديد من الخلوية والهيدروكربونات العطرية المتعددة لا تثير في هذه الموجة، ونظرا لتشتت الضوء المنخفض، تنبعث منها منخفضة للغاية مضان الخلفية. علاوة على ذلك، وطرأ تحسن كبير على النافذة الخلفية وبين كشف محددة نتيجة لمعامل انقراض عالية من fluorophores القريب من الأشعة تحت الحمراء. صمود للضوء، متفوقة إشارة إلى نسبة الضوضاء، وثيق الصلة للغاية في تحديد مقدار التتر الفيروسية. استخدام microflوسوف الغرف uidic أتمتة عملية الفرز من خلال الضوابط الروبوتية، ويمكن أن تسمح لنا لاختبار عينات سريرية شديدة العدوى بسهولة. وهكذا، فإن استخدام الأشعة تحت الحمراء القريبة من الأصباغ في هذه الأساليب هو المثالي وموثوق بها للغاية لتعداد التتر فيروسية في عينات الأنسجة.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> ألبومين المصل البقري </td><td> اتلانتا البيولوجية </td><td> S11750 </td><td></td></tr><tr><td> PR8 فيروس </td><td></td><td></td><td> من الدكتور توماس موران M </td></tr><tr><td> ماعز مكافحة فأر IRDye @ 800 </td><td> LI-COR العلوم البيولوجية </td><td> 926-32210 </td><td> 1:200 التخفيف </td></tr><tr><td> LI-COR أوديسي IR الماسح الضوئي </td><td> LI-COR-العلوم البيولوجية </td><td> 9201-01 </td><td></td></tr><tr><td> 384 بئرا لوحة مسطحة القاع </td><td> Nalge نونك الدولية </td><td> 164730 </td><td></td></tr><tr><td> 96-الآبار لوحة مسطحة القاع </td><td> Nalge نونك الدولية </td><td> 165305 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM المتوسطة </td><td> Invitrogen </td><td> 11965126 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI المتوسطة </td><td> إينفيتروجن </td><td> 11875135 </td><td></td></tr><tr><td> بيكربونات الصوديوم </td><td> إينفيتروجن </td><td> 25080 </td><td></td></tr><tr><td> L-100X الجلوتامين </td><td> إينفيتروجن </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> Trypson-EDTA </td><td> إينفيتروجن </td><td> R001100 </td><td></td></tr><tr><td> الصوديوم البيروفات </td><td> إينفيتروجن </td><td> 11360070 </td><td></td></tr><tr><td> المضادة للM-2 الضد </td><td></td><td></td><td> من الدكتور توماس موران M </td></tr><tr><td> مكافحة NP خريطة موقع </td><td> مركز السيطرة على الأمراض </td><td> V2S2208 </td><td> حصل مع MTA </td></tr></tbody></table>

high-throughput detection method for influenza virus

فيروس الانفلونزا هي العوامل المسببة للأمراض في الجهاز التنفسي الذي يسبب درجة عالية من كل عام معدلات الاعتلال والوفيات في مناطق متعددة من العالم. لذلك فإن التشخيص الدقيق للاصابة بسلالة وفحص سريع عالية الإنتاجية من أعداد هائلة من العينات السريرية أمر بالغ الأهمية للسيطرة على انتشار الأمراض الوبائية. وتستند التشخيصات السريرية الحالية من عدوى الإنفلونزا على اختبار مصل الدم، بوليميريز سلسلة من ردود الفعل، مباشرة المناعي العينات وخلية 1،2 الثقافة. هنا، ونحن التقرير تطور تقنية جديدة للتشخيص المستخدمة للكشف عن فيروسات الأنفلونزا الحية. استخدمنا الإنسان الفأر تتكيف A/PR/8/34 (PR8، H1N1) فيروس 3 لاختبار فعالية هذه التقنية باستخدام الخلايا MDCK 4. تم زراعة الخلايا MDCK (10 4 أو 5 × 10 3 لكل بئر) في 96 - أو تم الكشف عن 384 لوحات جيدة، مصابة PR8 والبروتينات الفيروسية استخدام الألغام المضادة للM2 تليها ثانية صبغ مترافق IRondary الأجسام المضادة. M2 (5) وراصة دموية 1 هي علامة اثنين من البروتينات الرئيسية المستخدمة في فحوصات التشخيص كثير مختلفة. التقليل من توظيف IR-صبغ مترافق الأجسام المضادة الثانوية تألق ذاتي المرتبطة الأصباغ الفلورية الأخرى. يسمح للاستخدام الألغام المضادة للأجسام المضادة M2 لنا لاستخدام كثافة مستضد محدد مضان باعتباره متري مباشرة من كمية الفيروس. تعداد كثافة مضان، استخدمنا LI-COR الماسحة الضوئية الحمراء أوديسي مقرها. هذا النظام يستخدم اثنين من قناة الليزر القائمة على اكتشافات الأشعة تحت الحمراء لتحديد fluorophores وتمييزها من الضوضاء في الخلفية. القناة الأولى يثير في 680 نانومتر، وتنبعث عند 700 نانومتر للمساعدة في تحديد الخلفية. القناة الثانية بالكشف عن fluorophores التي تثير في 780 نانومتر، وتنبعث منها في 800 نانومتر. وأشار المسح الضوئي للPR8 الخلايا المصابة MDCK في الماسحة الضوئية الحمراء فيروسية عيار التي تعتمد على مضان مشرق. ويمكن لعلاقة إيجابية من كثافة مضان لعيار الفيروس بدءا من 10 2 5 -10 PFU يكون يخدعولاحظ sistently. الحد الأدنى من الإيجابية ولكن يمكن اكتشافها ينظر باستمرار مع 10 2 -10 3 PFU PR8 التتر الفيروسية أظهرت حساسية عالية من الأصباغ القريب من الأشعة تحت الحمراء. تم تحديد نسبة الإشارة إلى الضوضاء من خلال مقارنة وهمية المصابة أو isotype الأجسام المضادة الخلايا المعالجة MDCK. استخدام كثافات مضان من 96 - أو صيغ لوحة 384 بشكل جيد، وضعنا منحنيات المعايرة القياسية. في هذه الحسابات، المتغير الأول هو عيار الفيروس في حين أن المتغير الثاني هو كثافة مضان. لذا، كنا التوزيع الأسي لإنشاء منحنى مناسبا لتحديد العلاقة متعدد الحدود بين التتر الفيروسية وكثافة مضان. بشكل جماعي، فإننا نستنتج أن الأشعة تحت الحمراء كشف عن البروتين صبغ النظام القائم يمكن أن تساعد في تشخيص اصابة السلالات الفيروسية وتعداد بالضبط عيار من مسببات العدوى.

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Detection Method for Influenza Virus at JoVE.com

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

هذه الطريقة يصف استخدام الأشعة تحت الحمراء صبغ نظام التصوير القائم للكشف عن فيروس H1N1 في السائل قصيبية (بال) غسل من الفئران المصابة في حساسية عالية. لا يمكن أن يؤديها هذه المنهجية في 96 - أو 384 لوحة جيدا، يتطلب &lt;10 ميكرولتر من حجم المواد واختبار لديه القدرة على فحص متزامن من مسببات الأمراض متعددة.

الإنتاجية العالية لطريقة الكشف عن فيروس الإنفلونزا

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

high-throughput-detection-method-for-influenza-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

26.0K Views.  Blood Research Institute. هذه الطريقة يصف استخدام الأشعة تحت الحمراء صبغ نظام التصوير القائم للكشف عن فيروس H1N1 في السائل قصيبية (بال) غسل من الفئران المصابة في حساسية عالية. لا يمكن أن يؤديها هذه المنهجية في 96 - أو 384 لوحة جيدا، يتطلب 

Video: High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

توليد المؤتلف فيروسات الأنفلونزا من الحمض النووي البلازميد

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

باستخدام التصوير Bioluminescent بالتحقيق في التآزر بين العقدية الرئوية والأنفلونزا من الفيروسات في الفئران الرضع

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5 For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus have been demonstrated.6-11 The identification and subtyping of influenza on DNA microarrays has applications in both public health and the clinic for early detection, rapid intervention, and minimizing the impact of an influenza pandemic. Traditional fluorescence is currently the most commonly used microarray detection method. However, as microarray technology progresses towards clinical use,1 replacing expensive instrumentation with low cost detection technology exhibiting similar performance characteristics to fluorescence will make microarray assays more attractive and cost-effective.
The ampliPHOX colorimetric detection technology is intended for research applications, and has a limit of detection within one order of magnitude of traditional fluorescence11, with a main advantage being an approximate ten-fold lower instrument cost compared to the confocal microarray scanners required for fluorescence microarray detection. Another advantage is the compact size of the instrument which allows for portability and flexibility, unlike traditional fluorescence instruments. Because the polymerization technology is not as inherently linear as fluorescence detection, however, it is best suited for lower density microarray applications in which a yes/no answer for the presence of a certain sequence is desired, such as for pathogen detection arrays. Currently the maximum spot density compatible with ampliPHOX detection is &tilde;1800 spots/array. Because of the spot density limitations, higher density microarrays are not suitable for ampliPHOX detection.
Here, we present ampliPHOX colorimetric detection technology as a method of signal amplification on a low density microarray developed for the detection and characterization of influenza viruses (FluChip). Although this protocol uses the FluChip (a DNA microarray) as one specific application of ampliPHOX detection, any microarray incorporating biotinylated target can be labeled and detected in a similar manner. The microarray design and biotinylation of the target to be captured are the responsibility of the user. Once the biotinylated target has been captured on the array, ampliPHOX detection can be performed by first tagging the array with a streptavidin-label conjugate (ampliTAG). Upon light exposure using the ampliPHOX Reader instrument, polymerization of a monomer solution (ampliPHY) occurs only in regions containing ampliTAG-labeled targets. The polymer formed can be subsequently stained with a non-toxic solution to improve visual contrast, followed by imaging and analysis using a simple software package (ampliVIEW). The entire FluChip assay from un-extracted sample to result can be performed in about 6 hours, and the ampliPHOX detection steps described above can be completed in about 30 min.

ampliPHOX colorimetric detection technology is presented as an inexpensive alternative to fluorescence detection for microarrays. Based on photopolymerization, ampliPHOX produces solid polymer spots visible to the naked eye in just a few minutes. Results are then imaged and automatically interpreted with a simple yet powerful software package.

ampliPHOX الكشف اللونية على ميكروأري الحمض النووي لمكافحة الأنفلونزا

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5  For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

نشر فيروس الانفلونزا في أجنة بيض الدجاج

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

الأنف المسحات لمكافحة الأنفلونزا A الكشف عن الفيروسات وعزل من الخنازير

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

في المختبر التفكيك من الأنفلونزا من الفيروسات Capsids بواسطة الطرد المركزي التدرج

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of combining reactions together. We designed and evaluated a panel based on this principle to rapidly identify the presence of common disease agents in dogs and horses with acute respiratory illness. This manuscript describes a nanoscale diagnostic PCR workflow for sample preparation, amplification, and analysis of target pathogen sequences, focusing on procedures that are different from microliter scale reactions. In the respiratory panel presented, 18 assays were each set up in triplicate, accommodating up to 48 samples per plate. A universal extraction and pre-amplification workflow was optimized for high-throughput sample preparation to accommodate multiple matrices and DNA and RNA based pathogens. Representative data are presented for one RNA target (influenza A matrix) and one DNA target (equine herpesvirus 1). The ability to quickly and accurately test for a comprehensive, syndrome-based group of pathogens is a valuable tool for improving efficiency and ergonomics of diagnostic testing and for acute respiratory disease diagnosis and management.

High-throughput testing of DNA and RNA based pathogens by nanoscale PCR is described using a syndromic canine and equine respiratory PCR panel.

كشف الإنتاجية العالية للجهاز التنفسي مسببات الأمراض في العينات الحيوانية التي كتبها النانو PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone considering direct medical and hospitalization expenses and work absenteeism2. Animal models are crucial in Influenza A virus (IAV) studies to evaluate viral pathogenesis, host-pathogen interactions, immune responses, and the efficacy of current and/or novel vaccine approaches as well as antivirals. Mice are an advantageous small animal model because their immune system is evolutionarily similar to that found in humans, they are available from commercial vendors as genetically identical subjects, there are multiple strains that can be exploited to evaluate the genetic basis of infections, and they are relatively inexpensive and easy to manipulate. To recapitulate IAV infection in humans via the airways, mice are first anesthetized prior to intranasal inoculation with infectious IAVs under proper biosafety containment. After infection, the pathogenesis of IAVs is determined by monitoring daily the morbidity (body weight loss) and mortality (survival) rate. In addition, viral pathogenesis can also be evaluated by assessing virus replication in the upper (nasal mucosa) or lower (lungs) respiratory tract of infected mice. Humoral responses upon IAV infection can be rapidly evaluated by non-invasive bleeding and secondary antibody detection assays aimed at detecting the presence of total or neutralizing antibodies. Here, we describe the common methods used to infect mice intranasally (i.n) with IAV and evaluate pathogenesis, humoral immune responses and protection efficacy.

Influenza A viruses (IAVs) are important human respiratory pathogens. To understand the pathogenicity of IAVs and to perform preclinical testing of novel vaccine approaches, animal models mimicking human physiology are required. Here, we describe techniques to evaluate IAV pathogenesis, humoral responses and vaccine efficacy using a mouse model of infection.

فيروس الإنفلونزا أ الفيروس دراسات في نموذج ماوس للإصابة

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface glycoproteins of the virus. The generation of escape variants is a powerful method in elucidating how viruses escape immune detection and in identifying critical residues required for antibody binding. Here, we describe a protocol on how to generate influenza A virus escape variants by utilizing human or murine monoclonal antibodies (mAbs) directed against the viral hemagglutinin (HA). With the use of our technique, we previously characterized critical residues required for the binding of antibodies targeting either the head or stalk of the novel avian H7N9 HA. The protocol can be easily adapted for other virus systems. Analyses of escape variants are important for modeling antigenic drift, determining single nucleotide polymorphisms (SNPs) conferring resistance and virus fitness, and in the designing of vaccines and/or therapeutics.

We describe a method by which we identify critical residues required for the binding of human or murine monoclonal antibodies that target the viral hemagglutinin of influenza A viruses. The protocol can be adapted to other virus surface glycoproteins and their corresponding neutralizing antibodies.

جيل متغيرات الهروب من تحييد الأجسام المضادة فيروس الإنفلونزا

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

استخراج سريعة وآمنة وبسيطة دليل السرير الحمض النووي للكشف عن الفيروس في عينات الدم كله

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...