This work has been funded in part with federal funds from the Centers of Excellence for Influenza Research and Surveillance (CEIRS), National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, under Contract No. HHSN272201400006C.

جميع الخنازير المستخدمة في جمع البيانات التالية ممن تشملهم بالحماية اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام جامعة ولاية أوهايو (استخدام الحيوانات بروتوكول عدد 2009A0134-R1). 1. إعداد الفيروسية نقل متوسطة وجمع العينات قوارير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 37 غرام من الدماغ القلب التسريب إلى 900 مل من المياه النقية وتخلط جيدا مع بقضيب ومحرك مغناطيسي بينما التدفئة إلى 70 درجة مئوية إلى حل تماما المسحوق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأوتوكلاف مرق على 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. باردة على أعلى مقاعد البدلاء حتى مرق تصل درجة حرارة الغرفة. بردت في 4 درجات مئوية خلال الليل إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل، عن طريق خلط مع شريط مغناطيسي، 6،02 غرام من البنسلين G ملح الصوديوم و 10 غرام من كبريتات الستربتومايسين إلى 50 مل من الماء النقي في درجة حرارة الغرفة. إضافة الماء النقى إضافية لتبرزي حجم الكلي إلى 100 مل. تصفية حل من خلال 0.22 ميكرون غشاء polyethersulfone في زجاجة معقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جو معقم و مطهر إضافة البنسلين تصفيتها وحل الستربتومايسين في تبريد الدماغ القلب تسريب مرق وتخلط جيدا (بقضيب أو دوامة القارورة باليد) لجعل وسيلة النقل الفيروسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جو معقم و مطهر اختبار الرقم الهيدروجيني للمتوسطة النقل الفيروسي. إذا لزم الأمر، وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 ± 0.2 باستخدام حمض الهيدروكلوريك أو هيدروكسيد الصوديوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء الاختبار وضمان الجودة على المدى المتوسط ​​النقل الفيروسي عن طريق اختبار للأنفلونزا A البروتين مصفوفة الفيروس عن طريق RRT-PCR، كما وصفها تشانغ وهارمون 22 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء عن 5 مل من متوسطة نقل الفيروس إلى معقمة زجاجات البولي إيثيلين عالي الكثافة بسعة 8 مل. تسمية قارورة لاستخدامها في هذا المجال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين قوارير جاهزة للاستخدام في معيار البرد صناديق في -20 درجة مئوية حتى جمع العينات. </li></ol> 2. جمع الأنف المسحات من الخنازير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد العدد المناسب من قوارير مباشرة قبل جمع العينات. وستكون هناك حاجة قنينة واحدة لكل خنزير عينات. ذوبان في الغرفةدرجة الحرارة يأخذ حوالي 30-45 دقيقة. حافظ على قارورة إذابة باردة على كمادات الثلج حتى الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دون المعدات الشخصية الحماية المناسبة وفقا لما تمليه الحالة (مثل المآزر، ويغطي الحذاء، تنفس، سدادات الأذن، وغيرها). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دخول المنطقة الحيوان. إذا لزم الأمر، حصر خنزير على منطقة صغيرة ولكن لا توجد كبح. لا رووس يستريح الحيوانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع على زوج من القفازات الامتحان التخلص منها. الحرص على عدم تلويث قفازات من خلال لمس الخنازير، والأشخاص أو الجماد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام قفاز لإزالة العقيمة 5.08 سم × 5.08 سم (2 بوصة. × 2 بوصة) وسادة من القطن الشاش من إزار. وينبغي أن تستخدم منصات شاش معقم كلما كان ذلك ممكنا. قطع من الشاش ملفوفة بشكل فردي أكثر ملائمة للاستخدام من تلك ملفوفة مع اثنين من قطع من الشاش في الحزمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد وسادة من القطن الشاش مع أطراف أصابع يد واحدة فضح أكبر قدر من لوحة ممكن لأخذ العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح الشاش عبر خطم الخنزير، مع الأخذالحذر للدخول في فتحتي الأنف الخارجية إن أمكن. جمع الإفرازات الأنفية مرئية (حوالي 1 مل) مع نفس الشاش. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام نفس اليد، طي الشاش على عاتقها تسهيل وضع في قارورة تحتوي على المتوسط ​​النقل الفيروسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ناحية أخرى، وإزالة الغطاء من القنينة ووضع الشاش مطوية في قارورة. خلاصة القارورة ويهز القارورة لضمان اختلاط الشاش والمتوسطة النقل الفيروسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة القفازات ومكان في وعاء مناسب. تغيير القفازات بين كل خنزير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحقق من هوية قارورة. رقم السجل تحديد الخنزير، والعمر، والجنس، وعلامات سريرية، والملاحظات الأخرى التي تعتبر ضرورية من قبل المحققين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هدئ العينات مباشرة بعد جمع. النظر في جعل aliquots من العينة قبل التجميد لمنع متعددة تجميد أذاب دورات. في أقرب وقت ممكن بعد جمع، ووضع العينات في الثلج الجاف لنقلها إلى المختبر. تخزين قوارير في -80° C حتى يتم بدء الاختبار. </li></ol> 3. الكشف عن فيروس إنفلونزا أي الحمض النووي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد العينات في 37 ° C الجاف حمام حبة لمدة 5 دقائق ثم إنهاء ذوبان العينات على أعلى مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة لمدة 20-30 دقيقة. وإضافة في وقت واحد من عدة قوارير لحبات تسبب الحمام للحرارة. ينبغي توخي الحذر حتى لا افراط قارورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 100 ميكرولتر من المتوسطة النقل الفيروسي لاستخراج الحمض النووي الريبي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام إنتاجية عالية (96 شكل لوحة جيدا) منصة حبة المغناطيسي لاستخراج الحمض النووي الريبي من عدد كبير من العينات. 31 </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الوقت الحقيقي المقايسات عكس الناسخ PCR للكشف عن أنفلونزا السريع فيروس (31). </li></ol> 4. عزل فيروس الانفلونزا من الأنف المسحات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد العينات كما هو موضح أعلاه في القسم 3.1 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج عينات إذابة مع جنتاميسين سلفات (1000ميكروغرام / مل)، الأمفوتريسين B (22.5 ميكروغرام / مل)، وكبريتات كانامايسين (325 ميكروغرام / مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم إلى مدين، داربي الكلى الناب (MDCK) الخلايا الظهارية كما هو موضح سابقا. 32 </li></ol>

<ol>
	<li>Ma, W., Kahn, R. E., Richt, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pig+as+a+mixing+vessel+for+influenza+viruses:+Human+and+veterinary+implications.">The pig as a mixing vessel for influenza viruses: Human and veterinary implications.</a> J. Mol. Genet. Med. 3 (1), 158-166 (2008).</li><li>Nelson, M. I., Vincent, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+zoonosis+of+influenza+to+swine:+new+perspectives+on+the+human-animal+interface.">Reverse zoonosis of influenza to swine: new perspectives on the human-animal interface.</a> Trends Microbiol. 23, (2015).</li><li>Zhou, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+reassortment+of+avian,+swine,+and+human+influenza+A+viruses+in+American+pigs.">Genetic reassortment of avian, swine, and human influenza A viruses in American pigs.</a> J. Virol. 73 (10), 8851-8856 (1999).</li><li>Webby, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+swine+H3N2+influenza+viruses+in+the+United+States.">Evolution of swine H3N2 influenza viruses in the United States.</a> J. Virol. 74 (18), 8243-8251 (2000).</li><li>Vincent, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+influenza+A+virus+in+swine+worldwide:+a+call+for+increased+surveillance+and+research.">Review of influenza A virus in swine worldwide: a call for increased surveillance and research.</a> Zoonoses Public Health. 61 (1), 4-17 (2014).</li><li>Karasin, A. I., Olsen, C. W., Anderson, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+characterization+of+an+H1N2+influenza+virus+isolated+from+a+pig+in+Indiana.">Genetic characterization of an H1N2 influenza virus isolated from a pig in Indiana.</a> J. Clin. Microbiol. 38 (6), 2453-2456 (2000).</li><li>Zhou, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+H3N2+reassortant+influenza+A+viruses+in+North+American+pigs.">Emergence of H3N2 reassortant influenza A viruses in North American pigs.</a> Vet. Microbiol. 74 (1-2), 47-58 (2000).</li><li>Corzo, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+Surveillance+for+Influenza+A+Virus+among+Swine,+Midwestern+United+States,+2009-2011.">Active Surveillance for Influenza A Virus among Swine, Midwestern United States, 2009-2011.</a> Emerg. Infect. Dis. 19 (6), 954-960 (2013).</li><li>Lorusso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+antigenic+characterization+of+H1+influenza+viruses+from+United+States+swine+from+2008.">Genetic and antigenic characterization of H1 influenza viruses from United States swine from 2008.</a> J. Gen. Virol. 92 (Pt 4), 919-930 (2011).</li><li>Loving, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+in+pigs+of+inactivated+and+live+attenuated+influenza+virus+vaccines+against+infection+and+transmission+of+an+emerging+H3N2+similar+to+the+2011-2012+H3N2v.">Efficacy in pigs of inactivated and live attenuated influenza virus vaccines against infection and transmission of an emerging H3N2 similar to the 2011-2012 H3N2v.</a> J. Virol. 87 (17), 9895-9903 (2013).</li><li>Vincent, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+inactivated+swine+influenza+virus+vaccines+against+the+2009+A/H1N1+influenza+virus+in+pigs.">Efficacy of inactivated swine influenza virus vaccines against the 2009 A/H1N1 influenza virus in pigs.</a> Vaccine. 28 (15), 2782-2787 (2010).</li><li>Smith, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+evolutionary+genomics+of+the+2009+swine-origin+H1N1+influenza+A+epidemic.">Origins and evolutionary genomics of the 2009 swine-origin H1N1 influenza A epidemic.</a> Nature. 459 (7250), 1122-1125 (2009).</li><li>Vijaykrishna, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reassortment+of+Pandemic+H1N1/2009+Influenza+A+Virus+in+Swine.">Reassortment of Pandemic H1N1/2009 Influenza A Virus in Swine.</a> Science. 328 (5985), 1529 (2010).</li><li>Ducatez, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Reassortment+between+Pandemic+(H1N1)+2009+and+Endemic+Influenza+Viruses+in+Pigs,+United+States.">Multiple Reassortment between Pandemic (H1N1) 2009 and Endemic Influenza Viruses in Pigs, United States.</a> Emerg. Infect. Dis. 17 (9), 1624-1629 (2011).</li><li>Jhung, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outbreak+of+variant+influenza+A(H3N2)+virus+in+the+United+States.">Outbreak of variant influenza A(H3N2) virus in the United States.</a> Clin. Infect. Dis. 57 (12), 1703-1712 (2013).</li><li>Vincent, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+an+influenza+A+virus+isolated+from+pigs+during+an+outbreak+of+respiratory+disease+in+swine+and+people+during+a+county+fair+in+the+United+States.">Characterization of an influenza A virus isolated from pigs during an outbreak of respiratory disease in swine and people during a county fair in the United States.</a> Vet. Microbiol. 137 (1-2), 51-59 (2009).</li><li>Killian, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Infection+of+Pigs+and+People+with+Triple-Reassortant+Swine+Influenza+Virus+H1N1+at+a+U.S.+County+Fair.">Simultaneous Infection of Pigs and People with Triple-Reassortant Swine Influenza Virus H1N1 at a U.S. County Fair.</a> Zoonoses Public Health. 60 (3), 196-201 (2013).</li><li>Wong, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outbreak+of+influenza+A+(H3N2)+variant+virus+infection+among+attendees+of+an+agricultural+fair,+Pennsylvania,+USA,+2011.">Outbreak of influenza A (H3N2) variant virus infection among attendees of an agricultural fair, Pennsylvania, USA, 2011.</a> Emerg. Infect. Dis. 18 (12), 1937-1944 (2011).</li><li>Bowman, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+evidence+for+interspecies+transmission+of+H3N2pM/H3N2v+influenza+A+viruses+at+an+Ohio+agricultural+fair,+July+2012.">Molecular evidence for interspecies transmission of H3N2pM/H3N2v influenza A viruses at an Ohio agricultural fair, July 2012.</a> Emerg. Microbes. Infect. 1 (10), e33 (2012).</li><li>Wells, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swine+influenza+virus+infections.+Transmission+from+ill+pigs+to+humans+at+a+Wisconsin+agricultural+fair+and+subsequent+probable+person-to-person+transmission.">Swine influenza virus infections. Transmission from ill pigs to humans at a Wisconsin agricultural fair and subsequent probable person-to-person transmission.</a> JAMA. 265 (4), 478-481 (1991).</li><li>Bowman, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swine-to-human+transmission+of+influenza+A(H3N2)+virus+at+agricultural+fairs,+Ohio,+USA,+2012.">Swine-to-human transmission of influenza A(H3N2) virus at agricultural fairs, Ohio, USA, 2012.</a> Emerg. Infect. Dis. 20 (9), 1472-1480 (2012).</li><li>Bowman, A. S., Nolting, J. M., Nelson, S. W., Slemons, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subclinical+influenza+virus+A+infections+in+pigs+exhibited+at+agricultural+fairs,+Ohio,+USA,+2009-2011.">Subclinical influenza virus A infections in pigs exhibited at agricultural fairs, Ohio, USA, 2009-2011.</a> Emerg. Infect. Dis. 18 (12), 1945-1950 (2012).</li><li>Gray, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+A(H1N1)pdm09+Virus+among+Healthy+Show+Pigs,+United+States.">Influenza A(H1N1)pdm09 Virus among Healthy Show Pigs, United States.</a> Emerg. Infect. Dis. 18 (9), 1519-1521 (2012).</li><li>Van Reeth, K., Brown, I. H., Olsen, C. W., Zimmerman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+40,+Influenza+virus.">Ch. 40, Influenza virus.</a> Diseases of Swine. , 557-571 (2012).</li><li>Culhane, M. R., Detmer, S. E., Spackman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+21,+Sample+types,+collection,+and+transport+for+influenza+A+viruses+of+swine.">Ch. 21, Sample types, collection, and transport for influenza A viruses of swine.</a> Methods in Molecular Biology. Animal Influenza Virus, 259-263 (2014).</li><li>Sheldon, C. C., Sonsthagen, T., Topel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Animal Restraint for Veterinary Professionals. , (2006).</li><li>Detmer, S. E., Patnayak, D. P., Jiang, Y., Gramer, M. R., Goyal, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Influenza+A+virus+in+porcine+oral+fluid+samples.">Detection of Influenza A virus in porcine oral fluid samples.</a> J. Vet. Diagn. Invest. 23 (2), 241-247 (2011).</li><li>Goodell, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probability+of+detecting+influenza+A+virus+subtypes+H1N1+and+H3N2+in+individual+pig+nasal+swabs+and+pen-based+oral+fluid+specimens+over+time.">Probability of detecting influenza A virus subtypes H1N1 and H3N2 in individual pig nasal swabs and pen-based oral fluid specimens over time.</a> Vet. Microbiol. 166 (3-4), 3-4 (2013).</li><li>Romagosa, A., Gramer, M., Joo, H. S., Torremorell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+of+oral+fluids+for+detecting+influenza+A+virus+in+populations+of+vaccinated+and+non-vaccinated+pigs.">Sensitivity of oral fluids for detecting influenza A virus in populations of vaccinated and non-vaccinated pigs.</a> Influenza Other Respir. Viruses. 6 (2), 110-118 (2012).</li><li>Edwards, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+snout+wipe+samples+for+influenza+A+virus+surveillance+in+exhibition+swine+populations.">Utility of snout wipe samples for influenza A virus surveillance in exhibition swine populations.</a> Influenza Other Respir. Viruses. 8 (5), 574-579 (2014).</li><li>Zhang, J., Harmon, K. M., Spackman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+23,+RNA+extraction+from+swine+samples+and+detection+of+influenza+A+virus+in+swine+by+real-time+RT-PCR.">Ch. 23, RNA extraction from swine samples and detection of influenza A virus in swine by real-time RT-PCR.</a> Animal Influenza Virus. , 277-293 (2014).</li><li>Zhang, J., Gauger, P. C., Spackman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+22,+Isolation+of+swine+influenza+virus+in+cell+cultures+and+embryonated+chicken+eggs.">Ch. 22, Isolation of swine influenza virus in cell cultures and embryonated chicken eggs.</a> Animal Influenza Virus. , 265-276 (2014).</li><li>Bowman, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Inability+to+Screen+Exhibition+Swine+for+Influenza+A+Virus+Using+Body+Temperature.">The Inability to Screen Exhibition Swine for Influenza A Virus Using Body Temperature.</a> Zoonoses Public Health. , (2015).</li><li>Prickett, J. R., Kim, W., Simer, R., Yoon, K. J., Zimmerman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral-fluid+samples+for+surveillance+of+commercial+growing+pigs+for+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+and+porcine+circovirus+type+2+infections.">Oral-fluid samples for surveillance of commercial growing pigs for porcine reproductive and respiratory syndrome virus and porcine circovirus type 2 infections.</a> J. Swine Health Prod. 16 (2), 86-91 (2008).</li><li>Prickett, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+infection+in+porcine+oral+fluid+samples:+a+longitudinal+study+under+experimental+conditions.">Detection of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection in porcine oral fluid samples: a longitudinal study under experimental conditions.</a> J. Vet. Diagn. Invest. 20 (2), 156-163 (2008).</li><li>Pepin, B., Liu, F. F., Main, R., Ramirez, A., Zimmerman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collection+of+oral+fluid+from+individually+housed+sows.">Collection of oral fluid from individually housed sows.</a> J. Swine Health Prod. 23 (1), 35-37 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

جمع عينات من الخنازير باستخدام مسحات أنفية ذات الرؤوس البوليستر وقد ثبت مفيدة في إجراء المراقبة IAV. ومع ذلك، فإن استخدام الإجراء مسحة الأنف يعيق جهود المراقبة بسبب استخدام المطلوبة فخا لضبط النفس. مناديل الأنف تمثل صقل التقنيات الحالية أخذ العينات الخنازير لتقليل ا?...

<html> فيروسات الانفلونزا (IAV) تسبب أمراض الجهاز التنفسي في كثير من الأنواع، بما في ذلك الطيور الداجنة والخنازير والبشر. بسبب إعادة التشكيل من مجزأة IAV الجينوم الفيروسي التطور السريع يمكن أن يحدث وسلالات IAV جديدة تظهر في كثير من الأحيان. الخنازير هي الأنواع التي يمكن أن تكون بمثابة وعاء خلط لإعادة التشكيل من IAVs من الأنواع المضيفة متعددة. 1 يوجد حاليا ثلاثة أنواع فرعية رئيسية من IAV المتداولة عادة بين الخنازير في أمريكا الشمالية (H1N1، H1N2، H3N2)، ولكن مقدمات IAV متعددة من البشر لها أدى إلى تنوع IAV واسعة النطاق داخل تلك الأنواع الفرعية. وقد 2 التطور السريع لIAVs تصيب الخنازير واضحا منذ عام 1998 عندما متفارز الثلاثي IAV التي تحتوي على أجزاء من جينات من الفيروسات البشرية والطيور والخنازير 3 أصبح واسع الانتشار بين الخنازير في الولايات المتحدة. 4 الجين الداخلي ولا تزال شرائح من أن متفارز IAV الثلاثي واسع الانتشار بين IAVs اصابة حاليا الخنازير. 5 &quot;&gt; جميع أنحاء العالم، IAV هو سبب كبير من أمراض الجهاز التنفسي في الخنازير التي تشمل العلامات السريرية النموذجية الحمى وفقدان الشهية والخمول، والسعال وصعوبة التنفس والعطس ورشح الأنف وعدم زيادة الوزن. IAV يمكن أن يكون مكلفا ولا سيما لزرع المزارع حيث الإنجابية وقد تم توثيق فشل بسبب الحمى التي يسببها IAV والخنازير ضعيفة المولد. 6،7 داخل الولايات المتحدة، تم الكشف عن IAV عادة في قطعان الخنازير التجارية والتنوع الجيني الأنتيجين واسعة والتطور المستمر بين IAV تصيب الخنازير أعاق السيطرة على هذه فيروس 8-11 شواغل الصحة العامة عن ظهور سلالة IAV الوبائية الناتجة عن الاندماج تلك في الخنازير تحققت في عام 2009 عندما IAV الخنازير النسب التي تحتوي على مقاطع جينية من الثلاثي متفارز أمريكا الشمالية النسب الخنازير ومثل أنفلونزا الطيور، نسب الخنازير الأوراسي تسبب وباء عالمي في البشر. 12 باء فيروس (A (H1N1) pdm09) منذ ذلك الحينreassorted مع الخنازير المتوطنة IAV سلالات 13،14 وبعض هذه السلالات reassorted حديثا قد أحيلت إلى البشر. 15 تواتر الأحداث بوادر ظهوره وظهور سلالات جديدة IAV مع القدرة على إحداث جائحة يجعل المراقبة النشطة للفيروسات IAV في الخنازير الضروري، وخاصة في واجهة الخنازير البشري. واجهة-الخنازير البشري مهم للثنائي الاتجاه بين الأنواع انتقال IAV. من الانسان الى الخنازير انتقال تحدث في إنتاج الخنازير التجاري هو المسؤول عن كمية كبيرة من IAV التنوع الموجودة حاليا في عدد السكان الخنازير. المعارض الزراعية هي أكبر إعدادات comingling من الناس والخنازير في الولايات المتحدة، ومواقع لنقل الحيوانية من IAV. 15-21 وفي عام 2012 عرفت، خلال اندلاع البديل H3N2 IAV، ذكرت 93٪ من الحالات حضور خلال المعرض الزراعي في الأيام التي سبقت ظهور المرض. 15 تحليل الجينوممن العزلات الفيروسية من الخنازير معرض مقارنة مع العزلات بشرية مؤكدة انتقال الحيوانية. الخنازير المعرض 21 مصاب IAV في كثير من الأحيان لا تظهر العلامات السريرية للمرض، 21-23 تشير إلى الحاجة إلى اختبارات تشخيصية مباشرة. أخذ عينات من الخنازير سوء واضح وحدها لا تحدد بنجاح انتشار IAV في الخنازير ولا يمكن الاعتماد على تحديد سلالات جديدة من IAV الناشئة بين الخنازير. المراقبة النشطة ضرورية للغاية للكشف عن سلالات الناشئة من IAV في الخنازير وتقييم تهديدهم لكل من الخنازير والصحة العامة. معظم أنشطة المراقبة IAV طوعية، وبالتالي هناك حاجة الأساليب التخريبية الحد الأدنى. إجراءات جمع العينات الثلاث الرئيسية السابقة للوفاة لIAV تصيب الخنازير هي: مسحات الأنف والسوائل عن طريق الفم، وتقضي على الأنف. التوصيات الحالية لأخذ عينات الخنازير الفردية للكشف عن قائمة IAV ادراج الاصطناعية الألياف يميل مسحات في فتحتي الأنف كما الأسلوب المفضللجمع الإفرازات الأنفية والخلايا الظهارية. 24،25 لأن الخنازير قد يحاول تجنب هذا الإجراء، قام فريق من الموظفين المدربين يجب كبح جماح الخنازير إما يدويا أو مع فخا تبعا لحجم الحيوان. 26 عملية ضبط النفس هي شاقة لل الموظفين، والمجهدة للخنازير. بالإضافة إلى ذلك، وغالبا ما تشارك المعرض الخنازير في مسابقات متعددة في معرض ذلك التصور مزيد من التوتر على حيوان المنافسة يمكن أن تجعل أصحاب مقاومة للجهود المراقبة. مع احتمالات الكشف IAV تتراوح 80-100٪ في IAV قطعان المصابة، أصبحت السوائل الفموية شعبية بديلة لالأنف مسحات للكشف الجزيئي للIAV في السكان من الخنازير. 27،28 بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن توفر السوائل الفموية نافذة أوسع من كشف IAV من مسحات الأنف بعد الإصابة الأولية. ومع ذلك، فقد كان IAV بمعزل عن السوائل الفموية إشكالية مع 50٪ فقط من فيروس محاولات العزل مما أدى إلى IAV الانتعاش. 29 باستخدام مناديل الأنف بدلا من مسحات الأنف أثناء الترصد IAV في الخنازير يتغلب على القيود المذكورة أعلاه. مناديل الأنف لا تتطلب استخدام فخا الزجرية ويمكن أن يؤديها من دون مشددا على الحيوانات أو الشهود من هذا الإجراء. هناك حاجة إلى التدريب التقني الحد الأدنى لجمع مناديل الأنف، الذي يسمح للمهنيين غير للطب البيطري، بما في ذلك أصحاب الخنازير، لجمع عينات المراقبة. مناديل الأنفية وقد سبق بالمقارنة مع مسحات الأنف للكشف وعزل الإنفلونزا يوصف فيروس (30) وبروتوكول مفصلة لهذا الأسلوب غير الغازية لأخذ العينات أدناه.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1051">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BBL Brain Heart Infusion</td>
			<td style="width:360px;">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:119px;">211059</td>
			<td style="width:356px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin G Sodium Salt</td>
			<td style="width:360px;">MP Biomedicals, LLC</td>
			<td style="width:119px;">021194537</td>
			<td>1500 u/mg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Streptomycin Sulfate</td>
			<td style="width:360px;">AMRESCO LLC</td>
			<td style="width:119px;">0382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gentamicin Solution</td>
			<td style="width:360px;">Mediatech, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">30-005-CR</td>
			<td>50 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Amphotericin B Solution</td>
			<td style="width:360px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S 24 25</td>
			<td>250 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kanamycin Sulfate</td>
			<td style="width:360px;">Teknova</td>
			<td style="width:119px;">K2105</td>
			<td>5000 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TPP Rapid Filtermax System</td>
			<td style="width:360px;">TPP Techno Plastic Products AG&#160;</td>
			<td style="width:119px;">99150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nalgen Diagnostic Bottles</td>
			<td style="width:360px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">342002-9025</td>
			<td>HDPE with white PP closure</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:216px;">Dermacea Gauze Sponge, 8 ply</td>
			<td style="width:360px;">Covidien</td>
			<td style="width:119px;">441211</td>
			<td>5.08 cm &#215; 5.08 cm (2 in. &#215; 2 in)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nitrile Exam Gloves</td>
			<td style="width:360px;">Saftey Choice</td>
			<td style="width:119px;">19-170-010 (A-D)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nasal wipes for influenza a virus detection and isolation from swine

مراقبة لفيروسات الأنفلونزا A في الخنازير أمر بالغ الأهمية لصحة الإنسان والحيوان بسبب فيروس الانفلونزا يتطور بسرعة في السكان الخنازير وسلالات جديدة آخذة في الظهور باستمرار. الخنازير قادرة على أن تصاب الأنساب متنوعة من فيروس إنفلونزا أي جعلها تستضيف مهم لظهور وصيانة أنفلونزا رواية A سلالات الفيروس. أخذ العينات الخنازير في إعدادات متنوعة مثل المزارع التجارية الخنازير، المعارض الزراعية، وأسواق الحيوانات الحية مهم لتوفير رؤية شاملة لتعميم حاليا سلالات IAV. وقبل الوفاة تقنية أخذ العينات الحالية معيار الذهب (أي جمع مسحات الأنف) هي العمل المكثفة لأنه يتطلب ضبط النفس الجسدي من الخنازير. مناديل الأنف تنطوي على فرك قطعة من القماش عبر خطم الخنزير بدون أدنى درجات ضبط النفس من الحيوان. الأنف مسح إجراء بسيط لأداء و لا يتطلب موظفين ذوي البيطرية المهنية أو التدريب التعامل مع الحيوانات. While قليلا أقل حساسية من مسحات الأنف، ومعدلات الكشف عن الفيروسات والعزلة كافية لجعل الأنف مناديل بديل قابل للتطبيق لأخذ عينات الخنازير الفردية عندما يطلب الضغط المنخفض طرق أخذ العينات. ويحدد البروتوكول إجراءات والخطوات اللازمة لجمع الأنف قابلة للحياة مسح من خنزير الفردية.

الاستخدام الناجح لهذه الطريقة تعطي RRT-PCR النتائج التي، ترافق مع استخدام الرقابة الداخلية خلال استخراج الحمض النووي الريبي وRRT-PCR، وتظهر عينات لا تحتوي على مثبطات PCR من أي حطام البيئي التقطت خلال أخذ العينات. بعد عينة التلقيح، وينبغي أن يكون الفيروس الآبار العزلة خالية...

Watch this Scientific Journal Video about Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine at JoVE.com

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

الأنف المسحات لمكافحة الأنفلونزا A الكشف عن الفيروسات وعزل من الخنازير

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

nasal-wipes-for-influenza-a-virus-detection-and-isolation-from-swine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.3K Views.  The Ohio State University. The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses. 

Video: Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

توليد المؤتلف فيروسات الأنفلونزا من الحمض النووي البلازميد

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

باستخدام التصوير Bioluminescent بالتحقيق في التآزر بين العقدية الرئوية والأنفلونزا من الفيروسات في الفئران الرضع

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5 For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus have been demonstrated.6-11 The identification and subtyping of influenza on DNA microarrays has applications in both public health and the clinic for early detection, rapid intervention, and minimizing the impact of an influenza pandemic. Traditional fluorescence is currently the most commonly used microarray detection method. However, as microarray technology progresses towards clinical use,1 replacing expensive instrumentation with low cost detection technology exhibiting similar performance characteristics to fluorescence will make microarray assays more attractive and cost-effective.
The ampliPHOX colorimetric detection technology is intended for research applications, and has a limit of detection within one order of magnitude of traditional fluorescence11, with a main advantage being an approximate ten-fold lower instrument cost compared to the confocal microarray scanners required for fluorescence microarray detection. Another advantage is the compact size of the instrument which allows for portability and flexibility, unlike traditional fluorescence instruments. Because the polymerization technology is not as inherently linear as fluorescence detection, however, it is best suited for lower density microarray applications in which a yes/no answer for the presence of a certain sequence is desired, such as for pathogen detection arrays. Currently the maximum spot density compatible with ampliPHOX detection is &tilde;1800 spots/array. Because of the spot density limitations, higher density microarrays are not suitable for ampliPHOX detection.
Here, we present ampliPHOX colorimetric detection technology as a method of signal amplification on a low density microarray developed for the detection and characterization of influenza viruses (FluChip). Although this protocol uses the FluChip (a DNA microarray) as one specific application of ampliPHOX detection, any microarray incorporating biotinylated target can be labeled and detected in a similar manner. The microarray design and biotinylation of the target to be captured are the responsibility of the user. Once the biotinylated target has been captured on the array, ampliPHOX detection can be performed by first tagging the array with a streptavidin-label conjugate (ampliTAG). Upon light exposure using the ampliPHOX Reader instrument, polymerization of a monomer solution (ampliPHY) occurs only in regions containing ampliTAG-labeled targets. The polymer formed can be subsequently stained with a non-toxic solution to improve visual contrast, followed by imaging and analysis using a simple software package (ampliVIEW). The entire FluChip assay from un-extracted sample to result can be performed in about 6 hours, and the ampliPHOX detection steps described above can be completed in about 30 min.

ampliPHOX colorimetric detection technology is presented as an inexpensive alternative to fluorescence detection for microarrays. Based on photopolymerization, ampliPHOX produces solid polymer spots visible to the naked eye in just a few minutes. Results are then imaged and automatically interpreted with a simple yet powerful software package.

ampliPHOX الكشف اللونية على ميكروأري الحمض النووي لمكافحة الأنفلونزا

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5  For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

الإنتاجية العالية لطريقة الكشف عن فيروس الإنفلونزا

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

تنقية تقارب من المجمعات الأنفلونزا فيروس بروتين نووي ريبوزي من لونين من الخلايا المصابة

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

نشر فيروس الانفلونزا في أجنة بيض الدجاج

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

والمنمنمة غليكان ميكروأري الفحص لتقييم الطمع وخصوصية الأنفلونزا من الفيروسات Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

في المختبر التفكيك من الأنفلونزا من الفيروسات Capsids بواسطة الطرد المركزي التدرج

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone considering direct medical and hospitalization expenses and work absenteeism2. Animal models are crucial in Influenza A virus (IAV) studies to evaluate viral pathogenesis, host-pathogen interactions, immune responses, and the efficacy of current and/or novel vaccine approaches as well as antivirals. Mice are an advantageous small animal model because their immune system is evolutionarily similar to that found in humans, they are available from commercial vendors as genetically identical subjects, there are multiple strains that can be exploited to evaluate the genetic basis of infections, and they are relatively inexpensive and easy to manipulate. To recapitulate IAV infection in humans via the airways, mice are first anesthetized prior to intranasal inoculation with infectious IAVs under proper biosafety containment. After infection, the pathogenesis of IAVs is determined by monitoring daily the morbidity (body weight loss) and mortality (survival) rate. In addition, viral pathogenesis can also be evaluated by assessing virus replication in the upper (nasal mucosa) or lower (lungs) respiratory tract of infected mice. Humoral responses upon IAV infection can be rapidly evaluated by non-invasive bleeding and secondary antibody detection assays aimed at detecting the presence of total or neutralizing antibodies. Here, we describe the common methods used to infect mice intranasally (i.n) with IAV and evaluate pathogenesis, humoral immune responses and protection efficacy.

Influenza A viruses (IAVs) are important human respiratory pathogens. To understand the pathogenicity of IAVs and to perform preclinical testing of novel vaccine approaches, animal models mimicking human physiology are required. Here, we describe techniques to evaluate IAV pathogenesis, humoral responses and vaccine efficacy using a mouse model of infection.

فيروس الإنفلونزا أ الفيروس دراسات في نموذج ماوس للإصابة

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface glycoproteins of the virus. The generation of escape variants is a powerful method in elucidating how viruses escape immune detection and in identifying critical residues required for antibody binding. Here, we describe a protocol on how to generate influenza A virus escape variants by utilizing human or murine monoclonal antibodies (mAbs) directed against the viral hemagglutinin (HA). With the use of our technique, we previously characterized critical residues required for the binding of antibodies targeting either the head or stalk of the novel avian H7N9 HA. The protocol can be easily adapted for other virus systems. Analyses of escape variants are important for modeling antigenic drift, determining single nucleotide polymorphisms (SNPs) conferring resistance and virus fitness, and in the designing of vaccines and/or therapeutics.

We describe a method by which we identify critical residues required for the binding of human or murine monoclonal antibodies that target the viral hemagglutinin of influenza A viruses. The protocol can be adapted to other virus surface glycoproteins and their corresponding neutralizing antibodies.

جيل متغيرات الهروب من تحييد الأجسام المضادة فيروس الإنفلونزا

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...