فإن الكتاب يود أن يقر NSERC ديسكفري جرانت 402462 &quot;السقالات الأنسجة المهندسة لمراقبة السلوك الناجم عن الخلايا الجذعية المحفزة&quot;.

ملاحظات قبل البدء في البروتوكول: الفبرينوجين هو بروتين الدم المشتقة ويجب أن تكتمل المناسبة وبالتالي التدريب على السلامة قبل المناولة. هذا البروتوكول يتطلب 2 أيام لاستكمال ذلك الوقت الثقافات الجذعية المطلوبة بشكل مناسب للتأكد من أنهم على استعداد للبذار. من ناحية حساب مقدار الفيزيولوجية لوزن خارج، وثلاثة أطباق بتري 35 ملم من تريس مخزنة المالحة (TBS، ودرجة الحموضة 7.4) التي تحتوي على 110-130 ملغ من الفيبرينوجين حل في 3 مل من TBS ستكون كافية لانتاج 1 24 لوحة تحتوي على 400 جيد السقالات الليفين ميكرولتر في كل بئر. 1. يوم واحد: جعل الحلول الفيزيولوجية وغسيل الكلى بين عشية وضحاها <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخذ الفيزيولوجية مجفف بالتجميد من الثلاجة واتركه لمدة 20 دقيقة للسماح له أن يأتي إلى درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مخزنة أضف 3 مل من تريس المالحة (TBS) إلى كل طبق بيتري 35 مم. كل لوحة من غلة الفيزيولوجية 2-3 مل من محلول الفيزيولوجية التي تتراوح في تركيز 12-20ويمكن حساب ملغ / مل، وبلغ مجموع الفيزيولوجية اللازمة بناء على هذه تقريبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن حوالي 100-130 خارج الفيزيولوجية ملغ (FG) وترش على سطح الحاضر TBS في كل طبق. انتظر 5 دقائق للالفيزيولوجية للبدء في الخوض في حل. تغطية صحن بيتري مع غطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان أطباق بتري في 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة للسماح للالفيزيولوجية للذهاب بشكل كامل في حل TBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الرطب أنابيب غسيل الكلى (7000 ميغاواط قطع) مع TBS. أضعاف نهاية الجزء السفلي من نهاية الأنابيب وأغلقت المشبك مع المشبك لغسيل الكلى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة للحلول الفيزيولوجية من أطباق في أنابيب غسيل الكلى. أضعاف خلال نهاية أعلى ومشبك اغلاق مع المشبك لغسيل الكلى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان أنابيب غسيل الكلى التي تحتوي على حل الفيزيولوجية في وعاء 4 لتر من TBS. حل المزيج باستخدام لوحة ضجة لتعيين سرعة منخفضة (100 دورة في الدقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dialyze حل بين عشية وضحاها على إثارة لوحة ما لا يقل عن 12 ساعة. الحل TBS لا تحتاج إلى أن تتغير خلال هذه الفترة الزمنية. </li></OL&gt; 2. يوم 2: البلمرة من السقالات الليفين والبذر للخلايا الجذعية في السقالات يجب أن يتم تنفيذ كافة الخطوات الموضحة لهذه العملية في غطاء محرك السيارة الأنسجة ثقافة عقيمة كما سيتم المصنف هذه الاطر مع الثقافات الخلايا الجذعية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة حل الفيزيولوجية من أنابيب غسيل الكلى ومكان الى انبوب مخروطي الشكل المناسب الحجم (إما 15 مل أو 50 مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرشح حل الفيزيولوجية مع فلتر ميكرون حقنة 5.0 لإزالة الشوائب الكبيرة في الحل. اعتمادا على حجم من الحل، قد استخدام فلاتر متعددة تكون ضرورية لمعالجة حل كامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرشح العقيمة الحل الفيزيولوجية مع 0.22 ميكرون مرشح في أنبوب 50mL مخروطي. باستخدام ماصة الحجم المناسب، وتحديد حجم من الحل الفيزيولوجية التي تمت تصفيتها لاستخدامها لاحقا عند القيام الحسابات. اعتمادا على حجم من الحل، قد استخدام فلاتر متعددة تكون ضرورية لمعالجة الأنف والحنجرةغضب حل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس الامتصاصية من الحل الفيزيولوجية عند 280 نانومتر باستخدام مقياس الطيف. وثمة عامل تخفيف من 50 غالبا ما يكون ضروريا للحصول على امتصاص أقل من 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب تركيز بروتين موجود في حل الفيزيولوجية باستخدام المعادلة التالية: [الفبرينوجين في ملغ / مل] = (280 × عامل تخفيف) ÷ 1،55 1،55 حيث هي معامل الانقراض في 280 لالفيزيولوجية الإنسان 13. حساب القادم من كمية TBS اللازمة لتخفيف تركيز المحلول إلى 11.1 ملغ / مل من الفيبرينوجين على أساس حجم الأولي. وسوف تركز النهائي من البروتين في السقالات الليفين أن يكون 10 ملغ / مل بعد البلمرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على ثرومبين معقمة وحلول كلوريد الكالسيوم. أولا، إضافة 15 حل ثرومبين ميكرولتر (تركيز: 40 يو / مل - تركيز نهائي في سقالة سيكون يو 2 / مل) على الجانب الأيمن من كل بئر في الصف الأول من لوحة 24 أيضا. المقبل، إضافة 15 ميكرولتر من 50 CHL الكالسيوم مليحل oride إلى الجانب الأيسر من كل بئر. أخيرا، أضف 270 ميكروليتر من الحل الفيزيولوجية للصفيحة. هزة لوحة من جانب إلى آخر تليها تهز الخلف إلى الأمام لضمان اختلاط الحلول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اسمحوا الصف الذي يحتوي على خليط تتبلمر لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. والسقالات أصبح أكثر غموضا لأنها تتبلمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 2.6 و 2.7 حتى يتم بلمرة العدد المرغوب فيه من السقالات الليفين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حضانة آخر 5 دقائق، ووضع لوحات من داخل الحاضنة 37 درجة مئوية للسماح للبلمرة كاملة من السقالات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حضانة مدة ساعة واحدة كاملة، فإن الخطوة التالية هي البذور السقالة مع الهيئات مضغي الشكل. باستخدام pipettemen 20 ميكرولتر، حدد هيئة مضغي الشكل الفردي ومكان في وسط سقالة الليفين. تحقق مع مجهر أن كل بئر يحتوي على جثة مضغي الشكل واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 ميكرولتر من محلول الثرومبين (تركيز: 40 يو / مل) و 5 ميكرولتر من كلوريد الكالسيوم 50 مليحل على رأس كل هيئة مضغي الشكل تليها 90 ميكرولتر من حل الفيزيولوجية إلى كل بئر. وينبغي أن الحل تشكيل فقاعة التغليف الهيئات مضغي الشكل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة مكان الظهر في 37 حاضنة درجة مئوية لمدة ساعة إضافية لضمان البلمرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد مرور فترة الحضانة، إضافة 1 مل من وسائل الإعلام خلية ثقافة المناسبة لكل لوحة بشكل جيد ومكان العودة الى 37 درجة مئوية الحاضنة. </li></ol> 3. ممثل النتائج ويظهر الشكل 1 التخطيطي لعرض الجانب للفرد تحتوي أيضا على ثقافة 3D سقالة الليفين نظام المصنف مع هيئة مضغي الشكل. الشكل 2A معارض الصور ممثل الناجمة الماوس الخلايا الجذعية المحفزة التي يجري تربيتها في الطبقات الجنينية الماوس تغذية الخلايا الليفية. وبفعل هذه الخلايا بعد ذلك لتشكيل هيئات مضغي الشكل، مجاميع من الخلايا التي تحتوي على الأسلاف العصبية، وذلك باستخدام 8 يوم علاج حمض الريتينويك بروتوكول (الشكل 2B) كما previouslووصف ص 14 في حين يبين الشكل 3 مظهر من هيئة IPS-المستمدة مضغي الشكل بعد 3 أيام من داخل الثقافة من السقالات الليفين 3D. وقد تم الحصول على نتائج مماثلة في السابق باستخدام الخلايا الجذعية الجنينية 7. بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام هذا الأسلوب للثقافة IPS-المستمدة الهيئات مضغي الشكل المنتجة باستخدام بروتوكول المختلفة التي تنطوي على حمض الريتينويك وpurmorphamine 15 من داخل السقالات الليفين 3D، مما يدل على براعة هذا النظام ثقافة. <img alt="الشكل 1." src="/files/ftp_upload/3641/3641fig1.jpg" /> الشكل 1. تخطيطي يظهر منظر جانبي للفرد التي تحتوي على بئر الليفين 3D سقالة المصنف مع هيئة مضغي الشكل. <img alt="الشكل 2." src="/files/ftp_upload/3641/3641fig2.jpg" /> الشكل 2. فأر الجذعية المحفزة التي يسببها (آي بي إس) زراعة الخلايا وتمايزها. لتمييز هذه الخلايا إلى neurالظواهر القاعدة ويتم استزراع خلايا الجذع في تعليق لإنتاج الركام من خلايا تسمى الهيئات مضغي الشكل (EBS). ثم يتم التعامل مع هذه EBS مع حمض الريتينويك للحث على تمايز العصبية، وكان يستخدم سابقا هذا البروتوكول للحث على تمايز العصبية من الخلايا الجذعية الجنينية. أ) خلية غير مميزة الجذع مستعمرة الماوس مثقف على ماوس الجنينية الليفية طبقة المغذية. ب) الهيئات مضغي الشكل مشتقة من خلايا الجذع فأر في الثقافة تعليق اتخذت يوم 8 بعد العلاج مع حمض الريتينويك للحث على تمايز العصبية. شريط المقياس 100 ميكرون. <img alt="الشكل 3." src="/files/ftp_upload/3641/3641fig3.jpg" /> مضغي الشكل النتائج مثال الشكل 3. من الجذع الماوس الجسم بعد 3 أيام من ثقافة من داخل سقالة الليفين 3D. وبدأت الخلايا على الهجرة وتفرق داخل سقالة الليفين. شريط الحجم هو 500 ميكرون.

<ol>
	<li>Keung, A. J., Healy, K. E., Kumar, S., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysics+and+dynamics+of+natural+and+engineered+stem+cell+microenvironments.">Biophysics and dynamics of natural and engineered stem cell microenvironments.</a> Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med. 2, 49-64 (2010).</li><li>Willerth, S. M., Sakiyama-Elbert, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+stem+cells+and+biomaterial+scaffolds+for+constructing+tissues+and+cell+delivery.">Combining stem cells and biomaterial scaffolds for constructing tissues and cell delivery.</a> StemBook. , (2008).</li><li>Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+matrices:+state+of+the+art.">Three-dimensional cell culture matrices: state of the art.</a> Tissue Eng. Part B Rev. 14, 61-86 (2008).</li><li>Ahmed, T. A., Dare, E. V., Hincke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin:+a+versatile+scaffold+for+tissue+engineering+applications.">Fibrin: a versatile scaffold for tissue engineering applications.</a> Tissue Eng. Part B Rev. 14, 199-215 (2008).</li><li>Breen, A., O'Brien, T., Pandit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+as+a+delivery+system+for+therapeutic+drugs+and+biomolecules.">Fibrin as a delivery system for therapeutic drugs and biomolecules.</a> Tissue Eng. Part B Rev. 15, 201-214 (2009).</li><li>Willerth, S. M., Faxel, T. E., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+soluble+growth+factors+on+embryonic+stem+cell+differentiation+inside+of+fibrin+scaffolds.">The effects of soluble growth factors on embryonic stem cell differentiation inside of fibrin scaffolds.</a> Stem Cells. 25, 2235-2244 (2007).</li><li>Willerth, S. M., Arendas, K. J., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+fibrin+scaffolds+for+differentiation+of+murine+embryonic+stem+cells+into+neural+lineage+cells.">Optimization of fibrin scaffolds for differentiation of murine embryonic stem cells into neural lineage cells.</a> Biomaterials. 27, 5990-6003 (2006).</li><li>Gorodetsky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+Microbeads+Loaded+with+Mesenchymal+Cells+Support+Their+Long-Term+Survival+While+Sealed+at+Room+Temperature.">Fibrin Microbeads Loaded with Mesenchymal Cells Support Their Long-Term Survival While Sealed at Room Temperature.</a> Tissue Eng. Part C Methods. , (2011).</li><li>Barsotti, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+acts+as+biomimetic+niche+inducing+both+differentiation+and+stem+cell+marker+expression+of+early+human+endothelial+progenitor+cells.">Fibrin acts as biomimetic niche inducing both differentiation and stem cell marker expression of early human endothelial progenitor cells.</a> Cell Prolif. 44, 33-48 (2011).</li><li>Park, J. S., Yang, H. N., Woo, D. G., Jeon, S. Y., Park, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenesis+of+human+mesenchymal+stem+cells+in+fibrin+constructs+evaluated+in+vitro+and+in+nude+mouse+and+rabbit+defects+models.">Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells in fibrin constructs evaluated in vitro and in nude mouse and rabbit defects models.</a> Biomaterials. 32, 1495-1507 (2011).</li><li>Mooney, R., Tawil, B., Mahoney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+fibrinogen+and+thrombin+concentrations+promote+neuronal+rather+than+glial+growth+when+primary+neural+cells+are+seeded+within+plasma-derived+fibrin+gels.">Specific fibrinogen and thrombin concentrations promote neuronal rather than glial growth when primary neural cells are seeded within plasma-derived fibrin gels.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 1607-1619 (2010).</li><li>Liu, H., Collins, S. F., Suggs, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+for+expansion+and+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Three-dimensional culture for expansion and differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Biomaterials. 27, 6004-6014 (2006).</li><li>Dellenback, R. J., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extinction+coefficient+of+fibrinogen+from+man,+dog,+elephant,+sheep,+and+goat+at+280+mmu.">The extinction coefficient of fibrinogen from man, dog, elephant, sheep, and goat at 280 mmu.</a> Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 134, 353-355 (1970).</li><li>Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cells+express+neuronal+properties+in+vitro.">Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro.</a> Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).</li><li>Li, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+ventral+spinal+progenitors+and+motor+neurons+from+human+embryonic+stem+cells+by+small+molecules.">Directed differentiation of ventral spinal progenitors and motor neurons from human embryonic stem cells by small molecules.</a> Stem Cells. 26, 886-893 (2008).</li><li>Lorentz, K. M., Kontos, S., Frey, P., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+aprotinin+for+improved+stability+of+fibrin+biomaterials.">Engineered aprotinin for improved stability of fibrin biomaterials.</a> Biomaterials. 32, 430-438 (2011).</li><li>Willerth, S. M., Rader, A., Sakiyama-Elbert, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+controlled+growth+factor+delivery+on+embryonic+stem+cell+differentiation+inside+fibrin+scaffolds.">The effect of controlled growth factor delivery on embryonic stem cell differentiation inside fibrin scaffolds.</a> Stem Cell Res. 1, 205-218 (2008).</li><li>Chen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+improvement+of+focal+cerebral+ischemia+injury+by+subdural+transplantation+of+induced+pluripotent+stem+cells+with+fibrin+glue.">Functional improvement of focal cerebral ischemia injury by subdural transplantation of induced pluripotent stem cells with fibrin glue.</a> Stem Cells Dev. 19, 1757-1767 (2010).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

هذا البروتوكول المفصلة أعلاه يوفر طريقة لتوليد 3D السقالات الليفين للالجذعية المحفزة ثقافة الخلية، وتحديدا لالجنينية الماوس والناجم عن الخلايا الجذعية المحفزة. هذه مادة بيولوجية 3D نظام يستند إلى ثقافة أكثر دقة يقلد محراب الخلايا الجذعية الموجودة في الجسم الحي،</e...

المعدات المطلوبة: ميزان تحليلي درجة الحموضة متر الأنسجة حاضنة الثقافة (37 درجة مئوية، ونسبة 5٪ CO 2) إثارة لوحة طيفي معقم غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة تريس مخزنة المالحة (الرقم الهيدروجيني 7.4) (4 L تحتاج زائد بما فيه الكفاية لتذويب الفيزيولوجية) 50 ملي مول كلوريد الكالسيوم حل مخروطي أنابيب معقمة (15 أو 50 مل) 35 ملم أطباق بتري أنابيب غسيل الكلى (7،000 ميغاواط قطع) غسيل الكلى لقطات 5.0 ميكرون مرشحات محقنة ملفوفة بشكل فردي عقيم حقنة 0.22 ميكرون مرشحات محقنة 24 زراعة الأنسجة بشكل جيد لوحات <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> الفيبرينوجين (الإنسان) </td><td> Calbiocتنحنح </td><td> 341578 </td><td></td></tr><tr><td> ثرومبين (الإنسان) </td><td> سيغما </td><td> T7009 </td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of 3d fibrin scaffolds for stem cell culture applications

تم العثور على خلايا جذعية في طبيعيا microenvironments 3D في الجسم الحي، والتي غالبا ما يشار الى جذع الخلية المتخصصة 1. زراعة الخلايا الجذعية داخل السقالات مادة بيولوجية 3D يوفر وسيلة لتحاكي بدقة هذه microenvironments، وتوفير ميزة على الطرق التقليدية لثقافة 2D باستخدام البوليسترين، فضلا عن طريقة لاستبدال الأنسجة الهندسة 2. في حين تم استخدام 2D polystrene زراعة الأنسجة لغالبية تجارب زراعة الخلايا، ويمكن 3D السقالات مادة بيولوجية عن كثب تكرار microenvironments وجدت في الجسم الحي من خلال تمكين إنشاء أكثر دقة للقطبية الخلية في البيئة والتي تمتلك الخصائص البيوكيميائية والميكانيكية مماثلة إلى الأنسجة اللينة. (3) ومجموعة متنوعة من مشتقة بشكل طبيعي وجرى التحقيق الاصطناعية السقالات مادة بيولوجية كما بيئات 3D لدعم نمو الخلايا الجذعية. بينما يمكن توليفها السقالات الاصطناعية لديها أكبر Rأنج من الخواص الميكانيكية والكيميائية وغالبا ما يكون أكبر استنساخ، وتتكون غالبا الحيوية الطبيعية من البروتينات والسكريات الموجودة في مصفوفة extracelluar ونتيجة لذلك تحتوي على مواقع الربط للالتصاق الخلايا ودعم ثقافة الخلية بسهولة. وقد تم الليفين السقالات، التي تنتجها البلمره والفيبرينوجين بروتين تم الحصول عليها من البلازما، والتحقيق فيها على نطاق واسع لمجموعة متنوعة من تطبيقات هندسة الأنسجة على حد سواء في التجارب المختبرية والحية 4. ويمكن تعديل هذه السقالات باستخدام مجموعة متنوعة من وسائل لدمج أنظمة إطلاق للرقابة لتوفير العوامل العلاجية 5. وقد أظهرت الأعمال السابقة التي يمكن أن تستخدم مثل هذه السقالات للخلايا الجذعية الجنينية ثقافة بنجاح، ويمكن استخدامها لهذا النظام القائم على ثقافة سقالة لفحص الآثار المترتبة على عوامل النمو المختلفة على تمايز الخلايا الجذعية داخل المصنف 6،7. هذه تفاصيل بروتوكول عملية polymerizinز الليفين السقالات من الحلول الفيزيولوجية باستخدام النشاط الأنزيمي من ثرومبين. تستغرق العملية 2 أيام لاستكمال، بما في ذلك خطوة لغسيل الكلى بين عشية وضحاها من أجل حل الفيزيولوجية لإزالة citrates التي تمنع البلمرة. هذه الأساليب مفصلة تعتمد على تركيز الفيبرينوجين مصممة على أن تكون الأمثل لالجنينية الجذعية المحفزة التي يسببها وثقافة الخلية. حققت الجماعات الأخرى مزيد من السقالات الليفين لمجموعة واسعة من أنواع الخلايا والتطبيقات - مما يدل على براعة هذا النهج 8-12.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications at JoVE.com

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

تفاصيل هذا العمل في إعداد الليفين 3D الاطر لزراعة الخلايا الجذعية والتمييز plutipotent. ويمكن استخدام مثل هذه السقالات لفحص آثار المركبات البيولوجية المختلفة على سلوك الخلايا الجذعية كذلك بصيغته المعدلة لاحتواء نظم لتقديم الأدوية.

إعداد الفايبرين 3D السقالات لتطبيقات الجذعية زراعة الخلايا

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

preparation-of-3d-fibrin-scaffolds-for-stem-cell-culture-applications

Research

JoVE Journal

Bioengineering

25.1K Views.  University of Victoria. تفاصيل هذا العمل في إعداد الليفين 3D الاطر لزراعة الخلايا الجذعية والتمييز plutipotent. ويمكن استخدام مثل هذه السقالات لفحص آثار المركبات البيولوجية المختلفة على سلوك الخلايا الجذعية كذلك بصيغته المعدلة لاحتواء نظم لتقديم الأدوية.

Video: Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

سقالات الإبلاغ الذاتي للخلية ثقافة 3 الأبعاد

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with some of the spatial and molecular complexity of tissue. For example, many cell lines form 3D structures given appropriate in vitro conditions. Colon cancer cell lines form 3D cell culture spheroids, in vitro mimics of avascular tumor nodules. While immunohistochemistry and other classical imaging methods are popular for monitoring the distribution of specific analytes, mass spectrometric imaging examines the distribution of classes of molecules in an unbiased fashion. While MALDI mass spectrometric imaging was originally developed to interrogate samples obtained from humans or animal models, this report describes the analysis of in vitro three dimensional cell cultures, including improvements in sample preparation strategies. Herein is described methods for growth, harvesting, sectioning, washing, and analysis of 3D cell cultures via matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) imaging. Using colon carcinoma 3D cell cultures as a model system, this protocol demonstrates the ability to monitor analytes in an unbiased fashion across the 3D cell culture system with MALDI-MSI.

Immortalized cancer cell lines can be grown as 3D cell cultures, a valuable model for biological research. This protocol describes mass spectrometry imaging of 3D cell cultures, including improvements in the sample preparation platform. The goal of this protocol is to instruct users to prepare 3D cell cultures for mass spectrometry imaging analysis.

عينة استراتيجيات التحضير للتصوير الطيف الكتلي لل3D الثقافة خلية نماذج

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer cartilage tissue offer a promising solution to repair articular cartilage. To select the optimal cell source for tissue repair, it is important to develop an appropriate culture platform to systematically examine the biological and biomechanical differences in the tissue-engineered cartilage by different cell sources. Here we applied a three-dimensional (3D) biomimetic hydrogel culture platform to systematically examine cartilage regeneration potential of juvenile, adult, and osteoarthritic (OA) chondrocytes. The 3D biomimetic hydrogel consisted of synthetic component poly(ethylene glycol) and bioactive component chondroitin sulfate, which provides a physiologically relevant microenvironment for in vitro culture of chondrocytes. In addition, the scaffold may be potentially used for cell delivery for cartilage repair in vivo. Cartilage tissue engineered in the scaffold can be evaluated using quantitative gene expression, immunofluorescence staining, biochemical assays, and mechanical testing. Utilizing these outcomes, we were able to characterize the differential regenerative potential of chondrocytes of varying age, both at the gene expression level and in the biochemical and biomechanical properties of the engineered cartilage tissue. The 3D culture model could be applied to investigate the molecular and functional differences among chondrocytes and progenitor cells from different stages of normal or aberrant development.

Cartilage repair represents an unmet medical challenge and cell-based approaches to engineer human articular cartilage are a promising solution. Here, we describe three-dimensional (3D) biomimetic hydrogels as an ideal tool for the expansion and maturation of human articular chondrocytes.

3D هيدروجيل السقالات لالمفصلي خلية غضروفية الثقافة والجيل الغضروف

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model substrates for organ-scale tissue development. Sprague Dawley rat kidneys are cannulated by inserting a catheter into the renal artery and perfused with a series of low-concentration detergents (Triton X-100 and sodium dodecyl sulfate (SDS)) over 26 hr to derive intact, whole-kidney scaffolds with intact perfusable vasculature, glomeruli, and renal tubules. Following decellularization, the renal scaffold is placed inside a custom-designed perfusion bioreactor vessel, and the catheterized renal artery is connected to a perfusion circuit consisting of: a peristaltic pump; tubing; and optional probes for pH, dissolved oxygen, and pressure. After sterilizing the scaffold with peracetic acid and ethanol, and balancing the pH (7.4), the kidney scaffold is prepared for seeding via perfusion of culture medium within a large-capacity incubator maintained at 37 &#176;C and 5% CO2. Forty million renal cortical tubular epithelial (RCTE) cells are injected through the renal artery, and rapidly perfused through the scaffold under high flow (25 ml/min) and pressure (~230 mmHg) for 15 min before reducing the flow to a physiological rate (4 ml/min). RCTE cells primarily populate the tubular ECM niche within the renal cortex, proliferate, and form tubular epithelial structures over seven days of perfusion culture. A 44 &#181;M resazurin solution in culture medium is perfused through the kidney for 1 hr during medium exchanges to provide a fluorometric, redox-based metabolic assessment of cell viability and proliferation during tubulogenesis. The kidney perfusion bioreactor permits non-invasive sampling of medium for biochemical assessment, and multiple inlet ports allow alternative retrograde seeding through the renal vein or ureter. These protocols can be used to recellularize kidney scaffolds with a variety of cell types, including vascular endothelial, tubular epithelial, and stromal fibroblasts, for rapid evaluation within this system.

This protocol describes decellularization of Sprague Dawley rat kidneys by antegrade perfusion of detergents through the vasculature, producing acellular renal extracellular matrices that serve as templates for repopulation with human renal epithelial cells. Recellularization and use of the resazurin perfusion assay to monitor growth is performed within specially-designed perfusion bioreactors.

الظهارية إعادة تعمير خلية وإعداد القوارض خارج الخلية مصفوفة السقالات للتنمية نسيج الكلى

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness and low bioactivity of metals. In this study, we have developed a new method towards fabricating a new type of bioactive and mechanically reliable porous metal scaffolds-densified porous Ti scaffolds. The method consists of two fabrication processes, 1) the fabrication of porous Ti scaffolds by dynamic freeze casting, and 2) coating and densification of the porous scaffolds. The dynamic freeze casting method to fabricate porous Ti scaffolds allowed the densification of porous scaffolds by minimizing the chemical contamination and structural defects. The densification process is distinctive for three reasons. First, the densification process is simple, because it requires a control of only one parameter (degree of densification). Second, it is effective, as it achieves mechanical enhancement and sustainable release of biomolecules from porous scaffolds. Third, it has broad applications, as it is also applicable to the fabrication of functionally graded porous scaffolds by spatially varied strain during densification.

Bioactive and mechanically reliable metal scaffolds have been fabricated through a method which consists of two processes, dynamic freeze casting for the fabrication of porous Ti, and coating and densification of the Ti scaffolds. The densification process is simple, effective and applicable to the fabrication of functionally graded scaffolds.

تصنيع ميكانيكيا الانضباطي والحيويه المعادن سقالات للتطبيقات الطبية الحيوية

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

إعداد 3D الهلام الكولاجين وMicrochannels لدراسة التفاعلات 3D<em&gt; في فيفو</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micropatterning وجمعية Microvessels 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

تشكيل الضوء بوساطة والزخرفة من الهلاميات المائية للتطبيقات خلية ثقافة

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

الانضباطي الهلاميات المائية من الرئوي خارج الخلية مصفوفة للثقافة خلية 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block co-polymers featuring cholesterol units as side-chain pendant groups, resulting in smectic-A (SmA) liquid crystal elastomers (LCEs). Foam-like scaffolds, prepared using metal templates, feature interconnected microchannels, making them suitable as 3D cell culture scaffolds. The combined properties of the regular structure of the metal foam and of the elastomer result in a 3D cell scaffold that promotes not only higher cell proliferation compared to conventional porous templated films, but also better management of mass transport (i.e., nutrients, gases, waste, etc.). The nature of the metal template allows for the easy manipulation of foam shapes (i.e., rolls or films) and for the preparation of scaffolds of different pore sizes for different cell studies while preserving the interconnected porous nature of the template. The etching process does not affect the chemistry of the elastomers, preserving their biocompatible and biodegradable nature. We show that these smectic LCEs, when grown for extensive time periods, enable the study of clinically relevant and complex tissue constructs while promoting the growth and proliferation of cells.

This study presents a methodology to prepare 3D, biodegradable, foam-like cell scaffolds based on biocompatible side-chain liquid crystal elastomers (LCEs). Confocal microscopy experiments show that foam-like LCEs allow for cell attachment, proliferation, and the spontaneous alignment of C2C12s myoblasts.

توليف حيويا الكريستال السائل المرنة كسوات كما السقالات الخليوي لزراعات الخلايا 3D المكانية

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block ...