يسمح بروتوكولنا للباحثين بدراسة عملية تكوين شبكة الأوعية بطريقة واضحة ويمكن تعقبها بسهولة ، مما يفتح الأبواب أمام دراسات جديدة ويلقي الضوء على سلوك الأوعية الدموية. هذه التقنية تقدم إمكانية إنشاء شبكات الأوعية الدموية عالية التنظيم والتكرار مع الاستجابة للبيئة المحيطة بها. يمكن استرجاع الخلايا البطانية من المرضى الذين يعانون من مرض الأوعية الدموية في استخدام هذا النظام ، مما يجعل من الممكن إعادة إنشاء أمراض الأوعية الدموية وإيجاد العلاج المناسب.
يمكن توسيع الطريقة المقترحة لدراسة سلوك شبكة الأوعية الدموية عند إقرانها بأنواع مختلفة من الخلايا ، مما يسمح بمراقبة تفاعل الأوعية النامية مع نوع معين من الأنسجة. تبدأ بغمر السقالات في الإيثانول 70٪ لمدة لا تقل عن 15 دقيقة، ثم غسلها مرتين في برنامج تلفزيوني. مزيج 1.5 ميكرولتر من محلول الأسهم فيبروكتين مع 28.5 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لكل سقالة لتكون المصنف.
إعداد واحد فيبروكتين تخفيف لاستخدامها لجميع السقالات لتجنب أخطاء pipetting. ضع السقالات بشكل متفرق فوق سطح كاره للماء وقم بتغطية كل سقالة ب 30 ميكرولتر من تخفيف فيبروكتين. استبدل غطاء اللوحة وضع السقالات المغطاة بالفيبروكتين في حاضنة تعيين إلى 37 درجة مئوية والرطوبة 100٪ لمدة ساعة واحدة على الأقل.
بعد الحضانة، شطف طفيفة السقالات في برنامج تلفزيوني لإزالة بقايا فيبروكتين. يمكن الاحتفاظ السقالات في برنامج تلفزيوني في أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع. إعداد الخلية البطانية أو المتوسطة EC عن طريق خلط المتوسط القاعدي مع مكونات عدة المتوسطة المقابلة, بما في ذلك محلول مضاد حيوي, FBS, ومكملات نمو الخلايا البطانية كما هو مبين من قبل الشركة المصنعة.
جعل تعليق الخلايا البطانية الأوعية الدموية الدقيقة الدهنية الإنسان في المتوسط EC مع تركيز أربعة ملايين خلية لكل ملليلتر. باستخدام ملقط، ضع سقالة واحدة مغلفة فيبروكتين لكل بئر في لوحة غير TC 24-well. قم بتغطية كل سقالة ب 25 قطرة ميكرولتر من تعليق الخلية، مع التأكد من عدم السماح للتعليق بالتدفق بعيدا عن السقالة.
ضع الغطاء على اللوحة وضعه في حاضنة عند 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون والرطوبة 100٪ لمدة 60 إلى 90 دقيقة. بعد الحضانة، ملء كل بئر مع 700 ميكرولتر من المتوسطة EC. احتضان السقالات البطانية حتى يمكن ملاحظة التقاء EC باستخدام المجهر الفلوري أو لمدة ثلاثة أيام.
تغيير المتوسطة كل يومين. إعداد DPSC المتوسطة عن طريق خلط 500 ملليلتر من انخفاض الجلوكوز DMEM، 57.5 ملليلتر من FBS، 5.75 ملليلتر من الأحماض الأمينية غير الأساسية، 5.75 ملليلتر من الغلوتاماكس، و 5.75 ملليلتر من محلول البنسلين-ستريبتومايسين-نيستاتين. نقل السقالات البطانية إلى لوحة جديدة غير TC 24 جيدا.
تجاهل جميع وسائل الإعلام من لوحة الحالية باستخدام ماصة أو شفط فراغ، مع الحرص على عدم تطبيق فراغ مباشرة إلى السقالة. ضع سقالة واحدة في وسط كل بئر، ثم جفف المنطقة المحيطة بها بفراغ خفيف. تمييع thrombin وحلول الأسهم الفيبرينوجين مع برنامج تلفزيوني إلى تركيز النهائي من خمس وحدات لكل ملليلتر و 15 ملليغرام لكل ملليلتر على التوالي.
إعداد ثمانية ملايين DPSC لكل تعليق ملليلتر في تخفيف الثرومبين وتوزيع 12.5 ميكرولتر من التعليق في الأنابيب الصغيرة الفردية لكل سقالة ليتم بذرها. تعيين ماصة 5-50 ميكرولتر إلى 12.5 ميكرولتر وملئه بمحلول الفيبرينوجين. دون إزالة طرف، تعيين ماصة إلى 25 ميكرولتر.
يجب أن ترتفع المادة الموجودة في الطرف وتترك حجما فارغا. اضغط ببطء على زر المكبس حتى يصل السائل إلى فتحة الطرف ، ولكن لا يتسرب. عقد المكبس في هذا الموقف ووضع غيض في واحدة من أنابيب الطرد الدقيق التي تحتوي على الخلايا في تعليق الثرومبين، والتأكد من طرف على اتصال مع السائل.
حرر زر المكبس برفق وارسم تعليق الخلية في الطرف. مزيج تماما كل من المواد، وتجنب تشكيل فقاعة. الاستغناء بسرعة المواد المختلطة على رأس سقالة البطانية.
كرر الخطوات السابقة لكل سقالة، مع التأكد من تغيير النصائح بين الاستخدامات لتجنب تشكيل هلام الفيبرين غير متوقع داخل الطرف. استبدل غطاء اللوحة واحتضن السقالات عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون ورطوبة 100٪ لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة، املأ كل بئر بميليلتر واحد من DPSC و EC المتوسطة.
الثقافة لمدة أسبوع واحد، وتغيير المتوسطة كل يومين. في نقاط زمنية مختلفة أثناء الثقافة، وإزالة المتوسطة من البئر وصورة يبني باستخدام المجهر confocal لدراسة تطور الأوعية الدموية أو أي معلمة أخرى من الفائدة. يسمح هذا البروتوكول لتصنيع السقالات تيسلاتيد مصنوعة من SU-8 الضوئية.
تم الحصول على سقالات مع هندسات مقصورة متميزة وميزات دقيقة للغاية وقابلة للتكرار. مع البذر التقليدي المتزامن لكل من الخلايا البطانية وخلايا الدعم ، تم توزيع الخلايا بشكل متجانس على السقالة مما أدى إلى شبكات الأوعية الدموية غير المتوقعة وغير المنظمة. وعلى العكس من ذلك، أدى بذر الخلايا التدريجي إلى شبكات وعائية منظمة تنظيما عاليا.
عند استخدام الخلايا البطانية الفلورية ، يمكن تصوير الأوعية في الوقت الحقيقي. تم استزراع البروتين الفلوري الأحمر الذي يعبر عن الخلايا البطانية على سقالات سداسية وصورت. تمت إضافة خلايا الدعم في اليوم الأول وتم تصوير شبكات الأوعية الدموية كل يومين لتحديد تطور الأوعية.
لكل نقطة زمنية ، تم التقاط صور واسعة للسقالة بأكملها. وتم قياس نمو السفن كميا على أنه إجمالي طول السفينة ومنطقتها. تم إجراء الفاصل الزمني للتصوير البؤري للسماح بتتبع سفينة واحدة باستخدام خلايا البطانية متعددة الألوان.
وقد تم توليد مسار السفينة من الفاصل الزمني، مما مكن من مراقبة هجرة السفن. لوحظ نضوج الأوعية من خلال وجود أكتين العضلات الملساء وخلايا الدعم. بالنسبة للمقصورات الدائرية والهيكسانة والمربعة، تتكاثر الخلايا وتنظم في هياكل.
بحلول اليوم السابع، أظهرت جميع الأشكال شبكة الأوعية الدموية الغنية والمعقدة. كشفت صور التكبير العالية عن أكتين عضلي سلس أكثر كثافة ووجود خلايا دعم مشترك مع الأوعية المشكله ، مما يدل على تجنيد خلايا الدعم والتمايز المحيط بهياكل الأوعية الدموية. يمكن استخدام هذه التقنية لدراسة سلوك شبكات الأوعية الدموية ثلاثية الأبعاد عند تعرضها لظروف مختلفة، مثل مثبطات الخلايا المحددة أو في وجود أنواع خلايا إضافية.
