اننا مدينون لGaughan أليس وانغ جينغ جياو-المعلقة التي الدعم التقني والمدخلات الفكرية، والدعم المعنوي كان لهم دور فعال في تحريك هذه الدراسات في المستقبل. وقدم الدعم لهذه الدراسات من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح AI036532 لجاه.

1. قاتلة تشعيع <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع ما يصل إلى 10 في الفئران المتلقية قفص microisolator متوافق مع irradiator لاستخدامه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أشرق في 2 جرعات متساوية تلخيص الجرعة الإجمالية (الجرعة الإجمالية = 9 CGY للمستلمين BALB.B). يجب أن يكون تشعيع الثانية بعد 3 ساعة الأولى. ينبغي حقن تحدث بين 4-6 ساعة بعد التشعيع النهائي. أشرق في الفئران إما المصدر أو خدمات العملاء 137 RS2، 000 irradiator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الجرعة الإشعاعية 2 الفئران المتجر، في قفص بالماء المحمض microisolator حتى وقت الزرع. </li></ol> 2. خلية طحالية إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الماوس واحد المانحة وفقا لمبادئ توجيهية المؤسسية. كل جهة مانحة تعطي عموما 75x10 6 - 6 splenocytes 125x10. باستخدام مجموعات تنقية CD8، كل الماوس ينتج عادة 6x10 6 - 6 CD8 الخلايا 12x10 T. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الطحال من خلال جعل شق عمودي أولا سم 2 2 سم من خط الوسط الحق مباشرةتحت القفص الصدري. قطع طريق الفراء والجلد والأغشية والحشوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الطحال وخلق واحدة عن طريق وضع تعليق خلية الطحال في 40 شاشة شبكة ميكرولتر في طبق بتري مع RPMI 1640 بنسبة 5٪ FBS. استخدام المكبس حقنة لتحطيم الطحال حتى يتم تمرير الطحال بأكمله من خلال شاشة شبكة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر هذه العملية لكل وWT المانحة L2G85.B6. جمع كل WT تعليق خلية واحدة في أنبوب مخروطي الشكل 1-50 مل، وجمع كل L2G85.B6 تعليق خلية واحدة في أنبوب مخروطي 50 مل منفصلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 1200 دورة في الدقيقة الخلايا لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. إعادة تعليق الكريات في 1640 RPMI مع FBS 5٪ والخلايا العد. </li></ol> 3. نخاع العظم إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الجلد من أحد أطرافه الخلفية للماوس المانحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع بعناية بعيدا عن الأنسجة العضلية أكبر قدر ممكن من عظم الفخذ والساق / الشظية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أطرافهم هند عن طريق قطع عظم الفخذ بعيدا في مفصل الورك. قطع مخلب الخلفية أسفل الساق / الشظية تقاطع. وينبغي بذل كل التخفيضات العظام باستخدام مقص قوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية أي نوع من الأنسجة العضلية المتبقية. قطع الساق، وجدت قليلا نسبيا نخاع العظم في الساق ولا يستحق كل هذا الجهد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أطرافهم هند في عملية الباردة RPMI 1640 FBS وتكرار 5٪ مع أطرافهم هند الثانية. ينبغي لكل الماوس العائد بين 20x10 6 - 40x10 6 خلايا نخاع العظام. </li></ol> 4. إزالة نخاع العظم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أحد أطرافه الخلفية من وسائل الاعلام ومكان في صحن بيتري كبيرة مع كمية صغيرة من وسائل الاعلام الباردة (~ 1 مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع بعيدا مفصل الركبة. باستخدام حقنة (المجلد&gt; 5 مل)، إدراج إبرة تحت الجلد في الساق وخفض حقنة حتى تتم إزالة جميع المواد الحمراء من الداخل من الساق. كرر العملية مع عظم الفخذ. تجاهل العظام المتبقية خالية من نخاع العظام. كرر العملية مع الطرف هند الثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء خلية واحدة تعليق وسائل الاعلام pipetting تحتوي على نخاع العظم في طبق بتري كبير واستخدام المكبس حقنة و 40 ميكرولتر<html> شبكة الشاشة. ماصة تعليق خلية واحدة في أنبوب 50 مل المخروطية والحفاظ على الجليد. </li></ol> 5. CD3 استنفاد وهناك مجموعة متنوعة من الطرق لاستنزاف خلايا + CD3 من نخاع العظام. مختبرنا يستخدم عدة أدلى بها بيوتيك Miltenyi (CD3-البيوتين - 130-093-021). تستنفد خلايا + CD3 من نخاع العظام بعد بروتوكول الشركة المصنعة. من الآن فصاعدا سوف المخزن المؤقت لمجموعات Miltenyi أن يسمى MACS العازلة (2 ملم EDTA، 0.5٪ BSA في برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا بواسطة الطرد المركزي splenocytes وخلايا نخاع العظام في 1200 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية وعدد الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف ALL. إعادة تعليق خلايا نخاع العظم في 100 ميكرولتر من 10 ملايين الخلايا في نخاع العظم الاحتياطي MACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تواصل مع نضوب باستخدام CD3 بتصنيع &#39;البروتوكول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل CD3 نخاع العظام والخلايا المنضب 3 مرات في برنامج تلفزيوني العقيمة. عدد CD3 المنضب خلايا نخاع العظم و resuspend في حجم مناسب لحقن الخلايا 10 7. </li></ol>الحمار = &quot;jove_title&quot;&gt; 6. L2G85.B6 CD8 + T خلية تنقية وهناك مجموعة متنوعة من الطرق لتنقية الخلايا CD8 T من L2G85.B6 الفئران. أيضا، هناك عدة طرق لاستنزاف خلايا CD8 T من الجهات المانحة خلية طحالية WT. مختبرنا يستخدم مجموعات من بيوتيك Miltenyi (CD8 استنفاد - 130-049-401، CD8 تنقية - 130-095-236). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق بيليه WT في 90 ميكرولتر العازلة MACS في الخلايا 7 10. تواصل مع الخلية CD8 T استنزاف وفقا لتصنيع &quot;البروتوكول (CD8 استنفاد - 130-049-401). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق بيليه L2G85.B6 في 40 ميكرولتر العازلة MACS في الخلايا 7 10. تواصل مع الخلية CD8 T تنقية وفقا لتصنيع &quot;البروتوكول (CD8 تنقية - 130-095-236). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد كل خلية السكان ويغسل كل السكان 3 مرات مع برنامج تلفزيوني العقيمة. إعادة تعليق كل السكان في حجم مناسب لحقن 18x10 6 WT (CD8 المنضب) و 6 splenocytes 2X10 L2G85.B6 تنقية الخلايا CD8 T. </li></ol>7. حقن إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين 10 7 CD3 نخاع العظم الخلايا المنضب، 18x10 6 splenocytes WT (CD8 المنضب)، و2X10 L2G85.B6 6 خلايا CD8 T تنقيته في أنبوب microcentrifuge. يغسل مع PBS العقيمة و resuspend في 300 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن الخلايا في إعداد الوريد ذيل الفئران المتلقية. وينبغي أن يتم الحقن باستخدام الإبر قياس 28. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفئران في قفص متجر بالماء المحمض microisolator. الفئران باستخدام نقاط يوميا نظام التسجيل التسجيل GVHD التي وضعها كوك وآخرون 1. </li></ol> 8. Bioluminescent التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ستة أيام زرع آخر، وضخ الفئران المتلقية مع 4 ملغ D-وسيفيرين. السماح لوسيفيرين 5 دقائق لتتفاعل مع وسيفيراز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الماوس في غرفة isoflurane من تصوير تلألؤ بيولوجي والمتلقين الصورة لمدة 5 دقائق مع binning الصغيرة. وهذا خلق على صورة عالية الدقة في حين جمع كأحداث أكبر عدد ممكن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل البيانات باستخدام المعيشةصورة البرنامج. يمكن تغيير حجم الصورة الزائفة لونا لتحقيق أفضل النتائج. ومع ذلك، لا بد من أن يتم استخدام نفس النطاق عبر التجارب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن إنشاء مناطق السكن الفائدة باستخدام برامج الصور والابتعاثية ضوء يمكن كميا عن طريق حساب تدفق (الفوتونات / ثانية) المنبعثة من كل منطقة من الفائدة. </li></ol> 9. ممثل النتائج حوالي 7-10 يوما زرع آخر، يبدأ الفئران تظهر عليها علامات سريرية لGVHD. الفئران غذر تظهر بسبب عدم وجود الاستمالة. وسوف تبدأ أيضا المتلقين لانقاص وزنه بين 7-10 أيام آخر زرع. والنشاط والموقف من الفئران المتلقية تبقى عادية نسبيا حتى اليوم ما يقرب من زرع آخر 12-14. سوف عشرات GVHD التراكمي زيادة مطردة خلال أول 2-3 أسابيع زرع آخر (الشكل 1A). مسار المرض متغير جدا بين الفئران، ولكن يجب أن نستسلم المستفيدين بشكل موحد على GVHD بواسطة د 30-40AYS آخر زرع (1B الشكل). ويبين الشكل 2 الفئران التي تم تصويرها المتلقي 6 أيام آخر زرع. شبه الملونة النطاق معارض مختلفة الابتعاثية ضوء في جميع أنحاء الجسم مع شدة الضوء المنبعثة أعلى في الطحال والأمعاء و. CD8 T تراكم الخلايا في الأمعاء يتسق مع النتائج السابقة 6. يمكن وضع الفئران في قفص المتلقي العودة إلى microisolator يمكن تصوير عند نقطة وقت لاحق أو الموت الرحيم لتصوير الجسم الحي السابقين. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> معايير </td><td> الصف 0 </td><td> الصف 1 </td><td> الصف 2 </td></tr><tr><td> فقدان الوزن (wkly.) </td><td> &lt;10٪ </td><td> &gt; 10٪ - &lt;25٪ </td><td> &gt; 25٪ </td></tr><tr><td> وضع </td><td> طبيعي </td><td> Hunching فقط في بقية </td><td> hunching عدة؛ يضعف movemeNT </td></tr><tr><td> نشاط </td><td> طبيعي </td><td> خفيفة الى معتدلة الانخفاض في النشاط </td><td> ثابتة ما لم حفز </td></tr><tr><td> الفراء نسيج </td><td> طبيعي </td><td> خفيفة الى معتدلة الإزعاج </td><td> شديدة الإزعاج / الاستمالة الفقراء </td></tr><tr><td> الجلد الملمس </td><td> طبيعي </td><td> تقشر الكفوف / الذيل </td><td> واضحة في مناطق الجلد المعري </td></tr></tbody></table> الجدول 1. تطوير كوك وآخرون هذا النظام التسجيل في 1996 1. وينبغي أن سجل الفئران يوميا على كل معيار من المعايير على اليمين. يتم إعطاء كل الماوس على درجة من 0-2 لكل المعايير والدرجة الكلية هي مجموع درجات كل فرد. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3697/3697fig1.jpg" /> الشكل 1. تم زرع قاتل BALB.B المشع مع العظام 7 10خلايا نخاع وحدها أو مع 18x10 6 splenocytes CD8 T الخلية WT المنضب و 6 2X10 تنقية الخلايا CD8 T L2G85.B6. A) البيانات السريرية نقاط من المستفيدين من نخاع العظام وحدها أو مع خلية T CD8 المنضب splenocytes WT وتنقيته L2G85.B6 CD8 خلايا T. ب) بيانات المستفيدين من بقاء نخاع العظام وحدها أو مع CD8 T الخلية المنضب splenocytes WT وتنقيته L2G85.B6 CD8 خلايا T. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3697/3697fig1large.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية</a> . <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3697/3697fig2.jpg" /> تم زرع الشكل 2. الفئران المعرضة للإشعاع قاتل مع BALB.B 10 7 خلايا نخاع العظام وحدها أو مع 18x10 6 splenocytes CD8 T الخلية WT المنضب و 6 2X10 تنقية الخلايا CD8 T L2G85.B6. تم حقن المتلقين مع 4 ملغ D-وسيفيرين عن طريق الحقن داخل الصفاق وتم تصويرها باستخدام IVIS Xenogen لمدة 5 دقائق في binning الصغيرة. PSوتظهر الصور الملونة eudo حيث يمثل الأرجواني والأحمر كثافة منخفضة يمثل ووضعت الأقاليم كثافة عالية من الاهتمام في جميع أنحاء كامل الماوس وتدفق الإجمالي (الفوتونات / ثانية) وكميا. <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/3697/3697fig3.jpg" /> تم زرع الشكل 3. الفئران المعرضة للإشعاع قاتل مع BALB.B 10 7 خلايا نخاع العظام وحدها أو مع 18x10 6 splenocytes CD8 T الخلية WT المنضب و 6 2X10 تنقية الخلايا CD8 T L2G85.B6. تم حقن المتلقين مع 4 ملغ D-وسيفيرين عن طريق الحقن داخل الصفاق وتم تصويرها باستخدام IVIS Xenogen لمدة 5 دقائق في binning الصغيرة. وتظهر الصور الملونة الزائفة حيث يمثل الأرجواني والأحمر كثافة منخفضة يمثل كثافة عالية. تم تصوير في يوم المتلقين) 4، B) يوم 6، وC) نقل يوم آخر 8.

<ol>
	<li>Cooke, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+model+of+idiopathic+pneumonia+syndrome+after+bone+marrow+transplantation:+The+roles+of+minor+H+antigens+and+endotoxin.">An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88, 3230-3239 (1996).</li><li>Berger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+subsets+involved+in+lethal+graft-versus-host+disease+directed+to+immunodominant+minor+histocompatibility+antigens.">T cell subsets involved in lethal graft-versus-host disease directed to immunodominant minor histocompatibility antigens.</a> Transplantation. 57, 1095-1102 (1994).</li><li>Nimer, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+depletion+of+CD8++cells+for+prevention+of+graft-versus-host+disease+after+bone+marrowtransplantation.+A+randomized+controlled+trial.">Selective depletion of CD8+ cells for prevention of graft-versus-host disease after bone marrowtransplantation. A randomized controlled trial.</a> Transplantation. 57, 82-87 (1994).</li><li>Korngold, R., Sprent, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+markers+of+T+cells+causing+lethal+graft-vs-host+disease+to+class+I+vs+class+II+H-2+differences.">Surface markers of T cells causing lethal graft-vs-host disease to class I vs class II H-2 differences.</a> Journal of Immunology. 135, 3004-3010 (1985).</li><li>Cao, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+using+labeled+donor+tissues+reveals+patterns+of+engraftment,+rejection,+and+survival+in+transplantation.">Molecular imaging using labeled donor tissues reveals patterns of engraftment, rejection, and survival in transplantation.</a> Transplantation. 80, 134-139 (2005).</li><li>Asady, R. E. l. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-{beta}-dependent+CD103+expression+by+CD8(+)+T+cells+promotes+selective+destruction+of+the+host+intestinal+epithelium+during+graft-versus-host+disease.">TGF-{beta}-dependent CD103 expression by CD8(+) T cells promotes selective destruction of the host intestinal epithelium during graft-versus-host disease.</a> J. Exp. Med. 201, 1647-1657 (2005).</li><li>Larson, R. S., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+leukocyte+integrins.">Structure and function of leukocyte integrins.</a> Immunol Rev. 114, 181-217 (1990).</li><li>Karecla, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+E-cadherin+on+epithelial+cells+by+the+mucosal+T+cell+integrin+alpha+M290+beta+7+(alpha+E+beta+7).">Recognition of E-cadherin on epithelial cells by the mucosal T cell integrin alpha M290 beta 7 (alpha E beta 7).</a> Eur. J. Immunol. 25, 852-856 (1995).</li><li>Cepek, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+between+epithelial+cells+and+T+lymphocytes+mediated+by+E-cadherin+and+the+alpha+E+beta+7+integrin.">Adhesion between epithelial cells and T lymphocytes mediated by E-cadherin and the alpha E beta 7 integrin.</a> Nature. 372, 190-193 (1994).</li><li>Malarkannan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+and+functional+characterization+of+a+dominant+minor+H+antigen,+H60.">The molecular and functional characterization of a dominant minor H antigen, H60.</a> J. Immunol. 161, 3501-3509 (1998).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

بروتوكول لإحداث GVHD في الفئران المقدمة هنا يمثل نموذجا ذات الصلة سريريا من GVHD الفئران. أنشئت أصلا من قبل بيرغر وآخرون في عام 1994، وC57BL / 6 إلى مزيج سلالة BALB.B هو MHC-المتطابقة، مع معدل وفيات GVHD بوساطة CD4 التابعة، CD8 T المستجيبات 2، تتشابه بشكل كبير مع السيناريو السر...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> إينفيتروجن </td><td> 12633-012 </td><td></td></tr><tr><td> الجنين مصل العجل </td><td> إينفيتروجن </td><td> 10439016 </td><td></td></tr><tr><td> 40 ميكرومتر مصفاة الخلية </td><td> BD العلوم البيولوجية </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> CD3e-البيوتين </td><td> Miltenyi التكنولوجيا الحيوية </td><td> 130-093-021 </td><td></td></tr><tr><td> مكافحة البيوتين Microbeads </td><td> Miltenyi التكنولوجيا الحيوية </td><td> 130-091-147 </td><td></td></tr><tr><td> CD8a Microbeads </td><td> Miltenyi التكنولوجيا الحيوية </td><td> 130-049-401 </td><td> تستخدم الخلايا CD8 في استنزاف T من الطحال. </td></tr><tr><td> CD8a كوكتيل تنقية الجسم المضاد </td><td> Miltenyi التكنولوجيا الحيوية </td><td> 130-095-236 </td><td> تستخدم في تنقيةCD8 خلايا T من الطحال. </td></tr><tr><td> D-وسيفيرين </td><td> الفرجار العلوم الحياتية </td><td> 122796 </td><td></td></tr></tbody></table>

induction of graft-versus-host disease and in vivo t cell monitoring using an mhc-matched murine model

الطعم ضد المضيف المرض (GVHD) هو الحد الحاجز لاستخدام واسعة من زرع نخاع العظم كعلاج العلاجية لمجموعة متنوعة من أوجه القصور الدم. ويتسبب GVHD بواسطة الخلايا T الناضجة alloreactive موجودة في العظام الكسب غير المشروع نخاع التي غرست في المتلقي وتسبب تلفا للأعضاء المضيف. ومع ذلك، في الفئران، يجب إضافة خلايا T حتى العظم نخاع أن يسبب اللقاح GVHD. على الرغم من القيام بأعمال مكثفة لوصف T اضافة رد زرع الخلايا، bioluminescent تكنولوجيا التصوير هو وسيلة غير عدوانية لرصد أنماط الاتجار T خلية في الجسم الحي. بعد التشعيع قاتلة، تزرع الفئران المتلقية مع خلايا نخاع العظام وsplenocytes الفئران من الجهات المانحة. يتم تضمين مجموعات فرعية من الخلايا T L2G85.B6 (الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن وسيفيراز جوهري) في عملية الزرع. عن طريق زرع الخلايا مجموعات فرعية معينة فقط T، واحد قادر على تتبع مجموعات فرعية محددة الخلايا T في الجسم الحي،واستنادا إلى موقعها وتطوير الفرضيات فيما يتعلق بدور مجموعات فرعية محددة الخلايا T في تعزيز GVHD في نقاط زمنية مختلفة. في فترات محددة سلفا زرع آخر، وتصوير الفئران المتلقية باستخدام كاميرا CCD Xenogen IVIS. يمكن كميا شدة الضوء باستخدام برنامج السكن لتوليد صورة صورة زائفة الألوان يعتمد على كثافة الفوتون (أحمر = كثافة عالية، البنفسجي = منخفض الكثافة). بين 4-7 أيام آخر زرع والفئران المتلقية تبدأ تظهر علامات سريرية للGVHD. وضعت كوك وآخرون. 1 (أ) لنظام التسجيل quantitate تطور المرض استنادا إلى الفراء نسيج المتلقي الفئران وسلامة الجلد، والنشاط، وفقدان الوزن، والموقف. وسجل الفئران يوميا، والموت الرحيم عندما تصبح المحتضرة. الفئران المتلقية أصبحت تحتضر عموما 20-30 زرع آخر أيام. نماذج الفئران هي أدوات قيمة لدراسة علم المناعة من GVHD. زرع الخلايا بشكل انتقائي خاص T مجموعات فرعية آلأدنى مستوى لتحديد دقيق لأدوار كل مجموعة فرعية يلعب. غير جراحية تتبع استجابات الخلايا T في الجسم الحي يضيف طبقة أخرى ذات قيمة للنماذج GVHD الفئران.

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model at JoVE.com

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

الفئران زرع نخاع العظام هو أسلوب يستخدم على نطاق واسع لدراسة آليات المناعية التي تحكم الطعم ضد المضيف المرض لدى البشر. القدرة على رصد أنماط الاتجار خلية T<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; يسمح لتحليل مفصل للوضع وإدامة استجابات الخلايا T خلال الطعم ضد المضيف المرض.

تحريض الطعم ضد المضيف المرض و<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; مراقبة الخلايا T باستخدام نموذج MHC المطابقة الفئران

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

induction-graft-versus-host-disease-vivo-t-cell-monitoring-using-an

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

15.6K Views.  The Ohio State University Medical Center. الفئران زرع نخاع العظام هو أسلوب يستخدم على نطاق واسع لدراسة آليات المناعية التي تحكم الطعم ضد المضيف المرض لدى البشر. القدرة على رصد أنماط الاتجار خلية T في الجسم الحي يسمح لتحليل مفصل للوضع وإدامة استجابات الخلايا T خلال الطعم ضد المضيف المرض.

Video: Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

تنبيغ من فيروسات تي خلية المستقبلات في الخلايا التائية ماوس

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

ل<em&gt; السابقين فيفو</em&gt; نموذج لهجوم T-خلية الموجه دبقية قليلة التغصن في الدماغ الحادة شرائح

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

تحريض الفئران المعوية التهاب عن طريق نقل بالتبني من المستجيب CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; عالية</sup&gt; خلايا T في الفئران العوز المناعي

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

عظم الفخذ نافذة الغرفة نموذج ل<em&gt; في فيفو</em&gt; تتبع الخلايا في الفئران نخاع العظام

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

ل<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج من حاجز الدم في الدماغ عن طريق التحليل الطيفي المعاوقة: التركيز على التفاعل خلية تي خلية البطانية

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

في فيفو الفحص للكشف عن وظيفة محددة مستضد تي خلية عن استخدام نموذج التطعيم

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model offers accessibility to rare populations of antigen-specific T-cells representative of the cellular memory response as well as the cytokine microenvironment in situ.
This report describes the practical procedure of a cutaneous recall, an SB induction, and a harvest of antigen-specific T-cells. To exemplify the method, the tuberculin skin test is used for antigenic recall in individuals who, prior to this study, underwent a Bacillus Calmette-Gu&#233;rin vaccination against an infection with Mycobacterium tuberculosis. Finally, examples of multiplex and flow cytometric analyses of SB specimens are provided, illustrating high fractions of antigen-specific polyfunctional CD4+ T-cells available by this sampling method compared with cells isolated from the blood.
The method described here is safe and minimally invasive, provides a unique opportunity to study both innate and adaptive immune responses in vivo, and may be beneficial to a broad community of researchers working with cell-mediated immunity and human memory responses, in the context of vaccine development.

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Here, we provide a demonstration of the suction blister cutaneous recall model. The model allows a simple access to study human in vivo adaptive immune responses, for instance in the context of vaccine development.

بروتوكول نفطة شفط لدراسة الخلية تي البشرية استدعاء الاستجابات في فيفو

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, mortality, and immunosuppression in infected birds. In this study, we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with IBDV, and the quantification of viral replication. The addition of chicken CD40 ligand significantly increased cell proliferation fourfold over six days of culture and significantly enhanced cell viability. Two strains of IBDV, a cell-culture adapted strain, D78, and a very virulent strain, UK661, replicated well in the ex vivo cell cultures. This model will be of use in determining how cells respond to IBDV infection and will permit a reduction in the number of infected birds used in IBDV pathogenesis studies. The model can also be expanded to include other viruses and could be applied to different species of birds.

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Here we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with infectious bursal disease virus, and the quantification of viral replication.

نموذج السابقين فيفو الابتدائي بورسال خلية ثقافة دجاج لدراسة الأمراض المعدية بورسال الفيروسات المرضية

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular components responsible for supplying cell energy; however, excess mitochondria also produce reactive oxygen species (ROS) that could cause cell death. Therefore, the number of mitochondria must constantly be adjusted to fit the needs of the cells. This dynamic regulation is achieved in part through the function of lysosomes that remove surplus/damaged organelles and macromolecules. Hence, cellular mitochondrial and lysosomal contents are key indicators to evaluate the metabolic adjustment of cells. With the development of probes for organelles, well-characterized lysosome or mitochondria-specific dyes have become available in various formats to label cellular lysosomes and mitochondria. Multicolor flow cytometry is a common tool to profile cell phenotypes, and has the capability to be integrated with other assays. Here, we present a detailed protocol of how to combine organelle-specific dyes with surface markers staining to measure the amount of lysosomes and mitochondria in different T cell populations on a flow cytometer.

This article illustrates a powerful method to quantify mitochondria or lysosomes in living cells. The combination of lysosome- or mitochondria-specific dyes with fluorescently conjugated antibodies against surface markers allows the quantification of these organelles in mixed cell populations, like primary cells harvested from tissue samples, by using multicolor flow cytometry.

التدفق متعدد الألوان المستندة إلى الخلوي الكمي الميتوكوندريا وليسوسوميس في خلايا تي

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, thymic derived Treg (tTreg) cells and peripherally induced Treg (pTreg) cells. They are present in different organs of our body and can be distinguished by specific markers, such as Helios and Neuropilin 1. It has been reported that tTreg cells are functionally more suppressive than pTreg cells. Therefore, it is important to determine the proportion of both tTreg and pTreg cells when investigating heterogeneous cell populations. Herein, we collected thymic glands, pancreatic draining lymph nodes and spleens from normoglycemic non-obese diabetic mice to distinguish tTreg cells from pTreg cells using flow cytometry. We manually prepared single cell suspensions from these organs. Fluorochrome conjugated surface CD4, CD8, CD25, and Neuropilin 1 antibodies were used to stain the cells. They were kept in the fridge overnight. On the next day, the cells were stained with fluorochrome conjugated intracellular Foxp3 and Helios antibodies. These markers were used to characterize the two subsets of Treg cells. This protocol demonstrates a simple but practical way to prepare single cells from murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen and use them for subsequent flow cytometric analysis.

Herein, we present a protocol to prepare single cells from murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen to further study these cells using flow cytometry. In addition, this protocol was used for determining the subsets of regulatory T cells using flow cytometry.

تحديد المجموعات الفرعية التنظيمية تي الخلية في الغدة الصعترية مورين، البنكرياس تصب العقدة الليمفاوية والطحال باستخدام التدفق الخلوي

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...