Somos gratos a Alice Gaughan e Jiao Wang Jing-cujo saldo suporte técnico, contribuição intelectual, e apoio moral foram fundamentais para mover esses estudos à frente. Estes estudos foram apoiados pela concessão NIH AI036532 para GAH.

1. A irradiação letal <ol><li> Colocar-se a 10 ratinhos receptores em uma gaiola microisolator compatível com o irradiador de ser usado. </li><li> Irradiar em 2 doses iguais somando dose total (dose total = 9 cGy para receptores BALB.B). Irradiação segundo deve ser de 3 horas após a primeira. A injecção deve ocorrer entre 4-6 horas após a irradiação final. Irradiar ratos em qualquer fonte de 137 Cs ou RS2, 000 irradiador,. </li><li> Após a segunda dose de radiação ratos, armazenar em gaiola microisolator com água acidificada até o momento do transplante. </li></ol> 2. Preparação esplenócitos <ol><li> Euthanize um camundongo doador acordo com as diretrizes institucionais. Cada dador geralmente produz 75x10 6 - 125x10 6 esplenócitos. Utilizando kits de purificação de CD8, cada rato geralmente produz 6x10 6 - 12x10 6 células T CD8. </li><li> Remover o baço fazendo primeiro um verticais 2 centímetros de incisão direita 2 centímetros da linha mediana directamentesob a caixa torácica. Cortar através da pele, pele, membrana e visceral. </li><li> Remover o baço e criar suspensão de células individuais através da colocação do baço em 40 ul de tela de malha em uma placa de Petri com meio RPMI 1640 com FBS a 5%. Usar um êmbolo da seringa para quebrar o baço até ao baço inteiro foi passado através de peneiro de malha. </li><li> Repita esse processo para cada WT e L2G85.B6 doador. Recolher todos os WT suspensões de células individuais em tubo 1-50 ml, e recolher todos os L2G85.B6 suspensões de células individuais em um tubo separado 50 ml. </li><li> Centrifugar as células a 1.200 rpm durante 10 min a 4 ° C. Pelotas Ressuspender em 1640 RPMI com 5% de FBS e contagem de células. </li></ol> 3. Preparação de Medula Óssea <ol><li> Remover a pele de um membro posterior de um rato dador. </li><li> Cortar cuidadosamente como tecido muscular máximo possível de fêmur e tíbia / fíbula. </li><li> Remover membro posterior cortando fêmur afastado na articulação do quadril. Cortar pata traseira, logo abaixo da tíbia / fíbula intersecção. Todos os cortes ósseos, deve ser feita com uma tesoura resistente. </li><li> Remova cuidadosamente qualquer tecido do músculo restante. Corte-fíbula relativamente pouco medula óssea é encontrada na fíbula e não vale a pena o esforço. </li><li> Coloque membro posterior no frio 1640 RPMI processo FBS e repita 5% com a segunda parte traseira. Cada rato deve render entre 6 20x10 - 40x10 6 células da medula óssea. </li></ol> 4. Remoção de Medula Óssea <ol><li> Remover um membro posterior da mídia e coloque em placa de Petri grande com uma pequena quantidade de meios frios (~ 1 ml). </li><li> Cortar a articulação do joelho. Utilizando uma seringa (volume de ml&gt; 5), a inserção da agulha subcutâneo na tíbia e deprimir seringa até que todo o material é removido do vermelho interior da tíbia. Repita o processo com o fêmur. Descartar ossos restantes desprovidos de medula óssea. Repita o processo com o segundo membro posterior. </li><li> Criar suspensão de células individuais por meio de pipetagem contendo medula óssea em placas de Petri e grande utilização êmbolo da seringa e 40 ulmalha da tela. Pipetar única suspensão de células em 50 ml de tubo cónico e manter em gelo. </li></ol> 5. CD3 Esgotamento Há uma variedade de maneiras para empobrecem células CD3 + a partir de medula óssea. O nosso laboratório utiliza um kit fabricado por Miltenyi Biotec (CD3-biotina - 130-093-021). Empobrecem células CD3 + a partir de medula óssea após o protocolo do fabricante. O tampão para os kits de Miltenyi será daqui em diante chamado de buffer MACS (2 mM de EDTA, 0,5% de BSA em PBS, pH 7,2). <ol><li> Lave as células por centrifugação esplenócitos e células da medula óssea a 1200 rpm durante 10 min a 4 ° C as células e contagem. </li><li> Remover ALL sobrenadante. Ressuspender as células ósseas medula em 100 ul por 10 milhões de células de medula óssea em tampão MACS. </li><li> Continue com CD3 esgotamento usando fabrica protocolo &quot;. </li><li> Lavar CD3 depletados de células da medula óssea 3 vezes em PBS estéril. Contagem de CD3 empobrecido células da medula óssea e ressuspender em um volume apropriado de injectar 10 7 células. </li></ol> Há uma variedade de maneiras de purificar a partir de células T CD8 L2G85.B6 ratos. Além disso, existem várias maneiras de destroem as células T CD8 a partir de doadores de esplenócitos WT. Nosso laboratório utiliza kits de Miltenyi Biotec (CD8 exaustão - 130-049-401, CD8 purificação - 130-095-236). <ol><li> Ressuspender o sedimento em 90 WT Tampão MACS ul por 10 7 células. Continue com depleção de células T CD8 de acordo com a fabrica &quot;protocolo (CD8 exaustão - 130-049-401). </li><li> Ressuspender o sedimento em 40 L2G85.B6 Tampão MACS ul por 10 7 células. Continue com CD8 purificação de células T de acordo com a fabrica &quot;protocolo (CD8 purificação - 130-095-236). </li><li> Contar cada população de células e lava-se cada população 3 vezes com PBS estéril. Ressuspender cada população em volume adequado para injectar 18x10 6 WT (CD8 empobrecido) e esplenócitos de 2x10 6 L2G85.B6 purificado células T CD8. </li></ol>7. Preparação de injecção <ol><li> Combinar 10 7 células CD3 ósseas empobrecido medulas, 18x10 6 WT (CD8 empobrecido) e esplenócitos de 2x10 6 L2G85.B6 células T CD8 purificadas num tubo de microcentrífuga. Lavar com PBS estéril e ressuspender em 300 ul. </li><li> Injectar preparação de células para dentro da veia da cauda dos ratos receptores. As injeções devem ser feitas usando agulhas de calibre 28. </li><li> Loja ratos na gaiola microisolator com água acidificada. Camundongos pontuação diária usando pontuação sistema de pontuação GVHD desenvolvido por Cooke et al 1. </li></ol> 8. Bioluminescent imagem <ol><li> Seis dias após o transplante, injectar ratinhos receptores com 4 mg de D-luciferina. 5 min para permitir que a luciferina a reagir com a luciferase. </li><li> Anestesiar mouse na câmara de isoflurano de imageador bioluminescência e receptores de imagem por 5 minutos com binning pequeno. Isto irá criar uma imagem de alta resolução durante a coleta de tantos eventos quanto possível. </li><li> Analisar dados usando VivoSoftware de imagem. A escala da imagem pseudo-cor pode ser alterado para se obter os melhores resultados. No entanto, é imperativo que a mesma escala ser usados ​​em experimentos. </li><li> As regiões de interesse podem ser criados utilizando o software de imagem e de estar emitância luminosa pode ser quantificada por cálculo do fluxo (fotões / sec) a ser emitida a partir de cada região de interesse. </li></ol> 9. Resultados representativos Cerca de 7-10 dias após o transplante, os ratos começam a mostrar sinais clínicos da GVHD. Ratos aparecer desalinhado devido à falta de higiene. Os destinatários também vai começar a perder peso entre 7-10 dias após o transplante. Atividade e postura de ratos receptores permanecerão relativamente normal até pós-transplante aproximadamente 12-14 dias. Cumulativos pontuações GVHD irá aumentar gradualmente através do primeiro transplante pós 2-3 semanas (Figura 1A). Curso da doença é bastante variável entre os ratos, no entanto, os destinatários devem uniformemente sucumbir a DECH por d 30-40ays após o transplante (Figura 1B). A Figura 2 mostra que os ratinhos receptores foram fotografados 6 após o transplante dias. Pseudo-colorida escala mostra variando emitância luz em todo o corpo, com a maior intensidade de luz a ser emitida no baço e no intestino. CD8 acumulação de células T no intestino é consistente com descobertas anteriores 6. Ratinhos receptores podem ser colocados de volta na gaiola microisolator a ser trabalhada em um ponto de tempo posterior, ou sacrificados por ex imagiologia in vivo. <table border="1"><tbody><tr><td> Critérios </td><td> Grau 0 </td><td> Grau 1 </td><td> Grau 2 </td></tr><tr><td> Perda de peso (wkly.) </td><td> &lt;10% </td><td> &gt; 10% - &lt;25% </td><td> &gt; 25% </td></tr><tr><td> Postura </td><td> Normal </td><td> Hunching apenas em repouso </td><td> Hunching várias; prejudica movement </td></tr><tr><td> Atividade </td><td> Normal </td><td> Ligeira a moderada diminuição de actividade </td><td> Estacionário, a menos que estimulou </td></tr><tr><td> Textura da pele </td><td> Normal </td><td> Leve a moderada despenteando </td><td> Ruffling grave / preparação pobres </td></tr><tr><td> A textura da pele </td><td> Normal </td><td> Escala de patas / cauda </td><td> Áreas óbvias de pele desnudada </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Cooke et al desenvolveram esse sistema de pontuação em 1996 1. Mice deve ser marcado diário em cada um dos critérios sobre a esquerda. Cada mouse é atribuída uma pontuação de 0-2 para cada critério ea pontuação total é a soma de todas as pontuações individuais. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3697/3697fig1.jpg" /> Figura 1. Letalmente irradiados foram transplantados BALB.B com 10 7 ossoAs células da medula sozinho ou com 18x10 6 células T CD8 esgotadas esplenócitos WT e 2x10 6 purificadas L2G85.B6 células T CD8. A) Os dados clínicos de pontuação receptores de medula óssea, isoladamente ou com células T CD8 esgotadas esplenócitos WT e purificado L2G85.B6 células T CD8. B) Os dados da sobrevivência de receptores de medula óssea sozinho ou com células T CD8 esgotado esplenócitos WT e purificado L2G85.B6 células T CD8. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3697/3697fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3697/3697fig2.jpg" /> Figura 2. Ratinhos BALB.B letalmente irradiados foram transplantados com 10 7 células de medula óssea por si só ou com 18x10 6 células T CD8 esgotadas esplenócitos WT e 2x10 6 purificadas L2G85.B6 células T CD8. Os receptores foram injectados com 4 mg de D-luciferina, por injecção intraperitoneal e foram fotografadas usando IVIS Xenogen durante 5 min a binning pequena. Pseudo cor-de-imagens são mostradas em roxo representa baixa intensidade e vermelha representa Regiões de alta intensidade de interesse foram desenhada ao redor do rato inteiro e fluxo total (fótons / s) foram quantificadas. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3697/3697fig3.jpg" /> Figura 3. Ratinhos BALB.B letalmente irradiados foram transplantados com 10 7 células de medula óssea por si só ou com 18x10 6 células T CD8 esgotadas esplenócitos WT e 2x10 6 purificadas L2G85.B6 células T CD8. Os receptores foram injectados com 4 mg de D-luciferina, por injecção intraperitoneal e foram fotografadas usando IVIS Xenogen durante 5 min a binning pequena. Pseudo-coloridas imagens são mostradas em roxo representa baixa intensidade e vermelha representa alta intensidade. Os destinatários foram fotografadas em um dia) 4, B) dia 6, e C) dias após transferência 8.

<ol>
	<li>Cooke, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+model+of+idiopathic+pneumonia+syndrome+after+bone+marrow+transplantation:+The+roles+of+minor+H+antigens+and+endotoxin.">An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88, 3230-3239 (1996).</li><li>Berger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+subsets+involved+in+lethal+graft-versus-host+disease+directed+to+immunodominant+minor+histocompatibility+antigens.">T cell subsets involved in lethal graft-versus-host disease directed to immunodominant minor histocompatibility antigens.</a> Transplantation. 57, 1095-1102 (1994).</li><li>Nimer, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+depletion+of+CD8++cells+for+prevention+of+graft-versus-host+disease+after+bone+marrowtransplantation.+A+randomized+controlled+trial.">Selective depletion of CD8+ cells for prevention of graft-versus-host disease after bone marrowtransplantation. A randomized controlled trial.</a> Transplantation. 57, 82-87 (1994).</li><li>Korngold, R., Sprent, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+markers+of+T+cells+causing+lethal+graft-vs-host+disease+to+class+I+vs+class+II+H-2+differences.">Surface markers of T cells causing lethal graft-vs-host disease to class I vs class II H-2 differences.</a> Journal of Immunology. 135, 3004-3010 (1985).</li><li>Cao, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+using+labeled+donor+tissues+reveals+patterns+of+engraftment,+rejection,+and+survival+in+transplantation.">Molecular imaging using labeled donor tissues reveals patterns of engraftment, rejection, and survival in transplantation.</a> Transplantation. 80, 134-139 (2005).</li><li>Asady, R. E. l. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-{beta}-dependent+CD103+expression+by+CD8(+)+T+cells+promotes+selective+destruction+of+the+host+intestinal+epithelium+during+graft-versus-host+disease.">TGF-{beta}-dependent CD103 expression by CD8(+) T cells promotes selective destruction of the host intestinal epithelium during graft-versus-host disease.</a> J. Exp. Med. 201, 1647-1657 (2005).</li><li>Larson, R. S., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+leukocyte+integrins.">Structure and function of leukocyte integrins.</a> Immunol Rev. 114, 181-217 (1990).</li><li>Karecla, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+E-cadherin+on+epithelial+cells+by+the+mucosal+T+cell+integrin+alpha+M290+beta+7+(alpha+E+beta+7).">Recognition of E-cadherin on epithelial cells by the mucosal T cell integrin alpha M290 beta 7 (alpha E beta 7).</a> Eur. J. Immunol. 25, 852-856 (1995).</li><li>Cepek, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+between+epithelial+cells+and+T+lymphocytes+mediated+by+E-cadherin+and+the+alpha+E+beta+7+integrin.">Adhesion between epithelial cells and T lymphocytes mediated by E-cadherin and the alpha E beta 7 integrin.</a> Nature. 372, 190-193 (1994).</li><li>Malarkannan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+and+functional+characterization+of+a+dominant+minor+H+antigen,+H60.">The molecular and functional characterization of a dominant minor H antigen, H60.</a> J. Immunol. 161, 3501-3509 (1998).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O protocolo para a indução de GVHD em ratinhos apresentados aqui representa um modelo clinicamente relevante da GVHD de murino. Originalmente criado por Berger et al., Em 1994, o C57Bl / 6 em BALB.B combinação estirpe é MHC-combinado, com mortalidade DECH mediada por CD4, CD8 dependentes efetores T 2, altamente semelhantes ao cenário clínico mais comum 3. Sabe-se que o transplante de células T CD8 sozinho não causar GVHD neste modelo, no entanto, a progressão da doença é signif...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 12633-012 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal Calf Serum </td><td> Invitrogen </td><td> 10439016 </td><td></td></tr><tr><td> 40 Filtro celular mM </td><td> BD Biosciences </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> CD3e-Biotina </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-093-021 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-biotina de micropérolas </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-091-147 </td><td></td></tr><tr><td> CD8a micropérolas </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-049-401 </td><td> Usado para esgotar as células T CD8 de baço. </td></tr><tr><td> CD8a Cocktail Antibody Purification </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-095-236 </td><td> Usado para purificarCélulas T CD8 de baço. </td></tr><tr><td> D-luciferina </td><td> Caliper Life Sciences </td><td> 122796 </td><td></td></tr></tbody></table>

induction of graft-versus-host disease and in vivo t cell monitoring using an mhc-matched murine model

Enxerto-versus-hospedeiro (GVHD) é a barreira limitante à ampla utilização de transplante de medula óssea como uma terapia curativa para uma variedade de deficiências hematológicas. GVHD é causada por células T maduras alorreactivas presentes no enxerto de medula óssea que são infundidas no receptor e causar danos aos órgãos de acolhimento. No entanto, em ratinhos, as células T deve ser adicionado ao inoculo de medula óssea para causar GVHD. Apesar de extenso trabalho tem sido feito para caracterizar células T após o transplante respostas, bioluminescente tecnologia de imagem é um método não-invasivo para monitorar padrões de tráfico de células T in vivo. Após irradiação letal, ratinhos receptores foram transplantados com células de medula óssea e de esplenócitos de ratinhos dadores. Subconjuntos de células T a partir de L2G85.B6 (ratinhos transgénicos que expressam constitutivamente luciferase) estão incluídos no transplante. Por apenas transplantar certos subgrupos de células T, um é capaz de rastrear específicas subpopulações de células T in vivo,e com base na sua localização, desenvolver hipóteses sobre o papel das subpopulações de células T específicas para a promoção GVHD em vários pontos temporais. No transplante predeterminado intervalos post, ratos receptores são fotografada usando um Xenogen IVIS câmera CCD. A intensidade da luz pode ser quantificado usando software imagem viva para gerar uma imagem pseudo-cor com base na intensidade de fótons (vermelho = intensidade alta, violeta = intensidade baixa). Entre 4-7 dias após o transplante, os ratos receptores começam a apresentar sinais clínicos da GVHD. Cooke et al. 1 desenvolveu um sistema de pontuação para quantificar a progressão da doença com base na textura da pele destinatário ratos, a integridade da pele, atividade, perda de peso e postura. Os ratinhos são marcados diariamente, e sacrificados quando se tornam moribundo. Ratinhos receptores tornam-se geralmente moribundo 20-30 pós-transplante dias. Modelos murinos são ferramentas valiosas para o estudo da imunologia da GVHD. Seletivamente transplante especial de células T subconjuntos almínimos para identificação cuidadosa dos papéis de cada subconjunto joga. De forma não invasiva de rastreamento respostas de células T in vivo adiciona outra camada de valor para modelos murinos de GVHD.

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Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

O transplante de medula óssea murina é uma técnica amplamente utilizada para estudar os mecanismos imunológicos que regem enxerto-versus-hospedeiro da doença em seres humanos. A capacidade de monitorar padrões de tráfico de células T<em&gt; In vivo</em&gt; Permite a análise detalhada do desenvolvimento e perpetuação da resposta das células T durante a reacção do enxerto contra o hospedeiro da doença.

Indução de enxerto-versus-hospedeiro de Doenças e<em&gt; Em Vivo</em&gt; Monitoramento celular T Usando um modelo murino de MHC de correspondência

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

induction-graft-versus-host-disease-vivo-t-cell-monitoring-using-an

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

15.6K visualizações.  The Ohio State University Medical Center. O transplante de medula óssea murina é uma técnica amplamente utilizada para estudar os mecanismos imunológicos que regem enxerto-versus-hospedeiro da doença em seres humanos. A capacidade de monitorar padrões de tráfico de células T In vivo Permite a análise detalhada do desenvolvimento e perpetuação da resposta das células T durante a reacção do enxerto contra o hospedeiro da doença.