وأيد هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة (N01 HHSN272201100019C، U19 089992 لمنظمة العفو الدولية، وبرنامج NCRR / GCRC M01-RR00125). الكتاب تعلن أي تضارب المصالح المالية واشكر الدكتور مارك Shlomchik، مدير مرفق خلية ييل الأساسية فارز.

1. العزلة وتنشيط الخلايا المناعية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على 10-50 مل من الدم heparinized متطوعين أصحاء بعد الموافقة المسبقة عن كتابي في إطار المبادئ التوجيهية للمجلس مراجعة المؤسسية المحلية. يجب أن لدراسات الشيخوخة أو المرض يمكن المرضية والاستبعاد ومعايير الاشتمال لكل متطوع أو المريض تحدد بشكل واضح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (PBMCs) باستخدام أنابيب لجنة مناهضة التعذيب أو Ficoll Paque زائد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (شركة جنرال الكتريك للرعاية الصحية، ونيو جيرسي) وإجراء التجارب في يوم من العزلة 7 (الكواشف، الجدول 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان PBMCs (3 × 10 6 / أنبوب) في 1.5 مل أنابيب في المتوسط ​​0.6 لتر وحده أو مع حفز يغاندس TLR أو وكلاء تفعيل أخرى، مثل يجند TLR7 / 8 R848 (0.6 مل المتوسط ​​زائد 0،6 ميكرولتر من 10 ملي TLR7 / 8 يجند R848، تركيز نهائي 10 ميكرومتر) في 37 درجة مئوية ل10-60 دقيقة (InvivoGen، كاليفورنيا) 9. </li></ol> 2. مختبرنحمل من خلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمية نسب الخلية وعلامات أخرى على سطح الخلية الحية الايقاف باستخدام الاجسام المضادة fluorescently مترافق. ملصق 3 × 10 6 PBMCs لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية في 100 ميكروليتر من PBS FBS 2٪ / في أنبوب 1،5 مل إيبندورف مع مزيج من الاجسام المضادة المحددة لسطح الأنساب الوحيدات أو العاصمة (الجدول 2). ويمكن تحديد التخفيفات الضد الأمثل في التجارب الأولية والعينات وينبغي أن تتم معالجتها على دفعات لتقليل الكثير إلى الكثير الاختلاف. بالنسبة لمخزون الجسم المضاد بائع من 0.1 ملغ / مل استخدام 5 ميكرولتر من الأجسام المضادة (1:20 تخفيف). استخدام أنبوب منفصل من الخلايا المسمى مع واحد فقط المتقارن لون واحد لإعداد القنوات فلوري على الصك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد وضع العلامات السطحية، وإصلاح الخلايا في 4٪ PFA / برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة في RT. لتخزين حتى وقت التحليل، وخلايا للطرد المركزي في 500 XG والخلايا resuspend في تجميد عازلة (90٪ FBS التي تحتوي على 10٪ DMSO) في -80 درجة مئوية حتى يوم الفحص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتقييم عملية دفعات، سو الخلايا غير المعالجة، وحفزت من مجموعة من المانحين معا للحد من التقلبات. في يوم من التحليل، وذوبان الخلايا بسرعة في درجة حرارة 37 م حمام الماء، الطرد المركزي في ز 500x لإزالة تجميد عازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى permeabilize الخلايا للكشف عن السيتوكينات داخل الخلايا أو علامات أخرى، تعليق خلية resuspend في 100 ميكروليتر العازلة بيرم / غسيل دينار بحريني دينار بحريني (العلوم الحيوية، ونيو جيرسي). تسمية الخلايا المكونات مع الإشارة على سبيل المثال، 1:20 التخفيف من الأجسام المضادة أرنب (P65) المضادة للNF-κB (تركيز نهائي 10 ميكروغرام / مل، وسانتا كروز التكنولوجيا الحيوية، كاليفورنيا) لمدة 20 دقيقة على RT، الطرد المركزي في 500 XG، وطاف نضح خلايا resuspend في 100 دينار بحريني بيرم ميكروليتر / غسل العازلة التي تحتوي على 1:250 تخفيف المضادة للأرنب الماعز مفتش-Alexa647 (إينفيتروجن، كاليفورنيا)، واحتضان لمدة 20 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة قبل التصوير، ملون مباين نوى مع دابي (0.2 ميكروغرام / لتر، إينفيتروجن، CA) أو propidium يوديد (PI، و 20 نانوغرام / مل، إينفيتروجن، كاليفورنيا). </li></ol> 3. ImageStream التحليل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl">إجراء التصوير بواسطة ImageStream على عينات مجمعة في حزم للحد من التباين بين العينات البشرية. وكانت وسيلة لضبط قوة الليزر على النحو التالي: 200 ميغاواط عن 488 نانومتر، 10 ميغاواط عن 658 نانومتر و 250 ميغاواط ل405 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليل ملفات البيانات (الشكل 1)، أولا، بوابة على الأحداث مع كثافة PI طبيعية وارتفاع نسبة الارتفاع PI (عرض: نسبة الارتفاع) للتمييز بين الخلايا واحد (R1) من الحطام (الأقل كثافة PI) أو أحداث متعددة الخلايا ( ارتفاع وانخفاض كثافة PI نسبة الارتفاع). حيدات هي ضمن بوابة لخلايا CD14 إيجابي. mDCs من خلال بوابة للخلايا التي هي عالية ومنخفضة لCD11c لCD4 (R2)، وانخفاض أيضا عن علامات-1 لين (R3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام أفكار البرامج (Amnis، WA) لتوفير تدبيرا فعالا الكمي لدرجة من تفعيل كل خلية. تحديد التشابه (أو شارك في التعريب) من عامل النسخ حشوية NF-κB النووية مع صبغ PI للإشارة إلى إزفاء داخل النواة (R4). وهناك ارتباط كبير من locali NF-κB/PIوينعكس الأسلحة سواء في درجة تشابه عالية ويدل على درجة من التنشيط 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مقارنة نسب التشابه بين الجماعات المختلفة أو علاج المريض السكان تشير إلى كفاءة وظيفية النسبي للخلايا. تحديد البيانات من خلال مقارنة بين عينات إحصائية من القيم المطلقة أو الاختلافات أضعاف. استخدام أفكار البرامج لعرض الصور من الخلايا من قطاعات رئيسية من المدرج الاحصائي عدد السكان (الشكل 2). </li></ol> 4. ممثل النتائج وكميا نحن مسارات إشارات استجابة ليجند نموذج الفيروسية من خلال تحفيز PBMCs مع يجند TLR7 / 8، R848 (الشكل 1). جمعنا كل الصور توطين الخلوية والإحصاءات السكانية في مجموعات لدينا عينة (الشكل 2). ImageStream يسمح لنا فرعية خلية بوابة مباشرة من PBMCs والاستجابات الخلية صورة من سكان الخلية المغلقة، ولكن لم يتم فرزها. هنا نحن كميا تأثير TLR قignaling على توطين النووية من NF-κB (P65) في Lin1، CD4 خافت، CD11c + النخاعي البلدان النامية (mDCs). في الأساس، لاحظنا على نسبة عالية من الخلايا unstimulated مع عامل النسخ NF-κB (P65) في السيتوبلازم. بعد التحفيز، الخلايا المعالجة يكون على درجة التشابه أعلى بكثير من NF-B (P65) مع PI صمة عار النووية، مشيرا إلى أن NF-κB (P65) translocated الى نواة بعد التحفيز (درجات التشابه وسيطة هي 1.52 و 3.01، على التوالي، الشكل. 2). وأشارت نتائج مماثلة في حيدات، TLR5 حفز 9. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3741/3741fig1.jpg" /> الشكل 1. تلطيخ والاستراتيجية المحاصرة لتحديد الآثار المترتبة على التحفيز على mDCs الإنسان. عامل النسخ NF-κB ينظم التعبير عن العديد من الجينات جهاز المناعة. هذه الدراسة تقيس توطين النووية من NF-κB (P65) في موضوع mDCs من ممثل واحد بعد TLR7 / 8 ليغا<html> الثانية والتحفيز. في تركيز وقد تم تحديد الخلايا واحد من قبل المعزولة في الأحداث الإيجابية PI مع ارتفاع نسب النووية (R1). وكانت mDCs (Lin1، CD4dim، CD11c +) بوابات في R3. يتم رسم توطين النووية من NF-κB (P65) في R4. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3741/3741fig1large.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض أكبر شخصية</a> . <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3741/3741fig2.jpg" /> الشكل 2. . إزفاء من NF-κB في mDCs بعد التحفيز ويظهر إزفاء من NF-κB (P65) في نواة بعد التحفيز (R4) في السكان من mDCs غير المعالجة، وحفزت، ودرجة التشابه وسيطة 1.52 في العينة غير المعالجة و 3،01 في العينة حفز (A). الصور الرقمية التي تم جمعها في وقت واحد من السكان خلية غير المعالجة أو حفز R848-إظهار الخلايا ممثل وشدة NF-B translocated إلى نواة الخلية (B)._upload/3741/3741fig2large.jpg &quot;الهدف =&quot; _blank &quot;&gt; اضغط هنا لعرض أكبر شخصية.

<ol>
	<li>Linton, P. J., Dorshkind, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+lymphocyte+development+and+function.">Age-related changes in lymphocyte development and function.</a> Nat. Immunol. 5, 133-139 (2004).</li><li>Shaw, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+Human+Toll-like+Receptor+Function+in+Aging.">Dysregulation of Human Toll-like Receptor Function in Aging.</a> Ageing Research Reviews. 10, 346-353 (2011).</li><li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors+and+innate+immunity.">Toll-like receptors and innate immunity.</a> Nature Rev. Immunol. 1, 135-145 (2001).</li><li>van Duin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+Defect+in+Human+TLR1+Function+and+Expression.">Age-associated Defect in Human TLR1 Function and Expression.</a> J. Immunol. 178, 970-975 (2007).</li><li>Panda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+decrease+in+TLR+function+in+primary+human+dendritic+cells+predicts+influenza+vaccine+response.">Age-associated decrease in TLR function in primary human dendritic cells predicts influenza vaccine response.</a> J. Immunol. 184, 2518-2527 (2010).</li><li>Kong, K. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+TLR3+impairs+the+innate+immune+response+to+West+Nile+virus+in+the+elderly.">Dysregulation of TLR3 impairs the innate immune response to West Nile virus in the elderly.</a> J. Virol. 82, 7613-7623 (2008).</li><li>Qian, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+interferon+signaling+in+dendritic+cells+from+older+donors+infected+in+vitro+with+West+Nile+virus.">Impaired interferon signaling in dendritic cells from older donors infected in vitro with West Nile virus.</a> J. Infect. Dis. 203, 1415-1424 (2011).</li><li>Hayden, M. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+in+immunobiology.">NF-kappaB in immunobiology.</a> Cell research. 21, 223-244 (2011).</li><li>Qian, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+elevation+in+TLR5+leads+to+increased+inflammatory+responses+in+the+elderly.">Age-associated elevation in TLR5 leads to increased inflammatory responses in the elderly.</a> Aging Cell. 11, 104-110 (2011).</li><li>George, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+nuclear+translocation+events+using+similarity+analysis+of+multispectral+cellular+images+obtained+in+flow.">Quantitative measurement of nuclear translocation events using similarity analysis of multispectral cellular images obtained in flow.</a> Journal of immunological. 311, 117-129 (2006).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

الخطوات الحاسمة في استخدام ImageStream للدراسات متعدية هي اختيار مجموعات المقارنة ذات الصلة، والتحسين والتحقق من نوعية الأجسام المضادة. والفروق بين الجماعات موضوع في الهدف المسمى يكون واضحا من خلال رسوم بيانية وصور الخلية. بالاشتراك مع تحليل دقيق للتغيرات في مستقبلات ذ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td> Ficoll-Paque زائد </td><td> جنرال إلكتريك للرعاية الصحية </td><td> 17-1440-03 </td></tr><tr><td> R848 </td><td> Invivogen </td><td> tlrl-r848 </td></tr><tr><td> لامتصاص العرق (16٪) </td><td> علوم المجهر الإلكتروني </td><td> 15710 </td></tr><tr><td> دينار بحريني بيرم / اغسل </td><td> العلوم البيولوجية دينار بحريني </td><td> 554723 </td></tr><tr><td> CD14-PE </td><td> eBioscience </td><td> 12-0149-41 </td></tr><tr><td> CD4-PacBlue </td><td> دينار بحريني Pharmingen </td><td> 68436 </td></tr><tr><td> كوكتيل النسب 1 (لين 1)، FITC </td><td> العلوم البيولوجية دينار بحريني </td><td> 340546 </td></tr><tr><td> CD11c-PE </td><td> العلوم البيولوجية دينار بحريني </td><td> 347637 </td></tr><tr><td> CD123-PE </td><td> العلوم البيولوجية دينار بحريني </td><td> 340545 </td></tr><tr><td> أرنب المضادة للNF-κB (P65) </td><td> سانتا كروز </td><td> SC-372 </td></tr><tr><td> Alexa647 F (&#39;أ ب) 2 الماعز المضادة للأرنب مفتش </td><td> إينفيتروجن </td><td> A21246 </td></tr><tr><td> دابي </td><td> إينفيتروجن </td><td> D21490 </td></tr><tr><td> ImageStream X </td><td> Amnis </td><td></td></tr></tbody></table> الجدول رقم 1. كواشف ومعدات معينة. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> خلية نوع </td><td> FITC </td><td> PE </td><td> اليكسا 647 </td><td> PacBlue </td></tr><tr><td> الوحيدات </td><td></td><td> CD14 </td><td> NF-κB (P65) </td><td></td></tr><tr><td> حركة التغيير الديمقراطي </td><td> Lin1 </td><td> CD11c </td><td> NF-κB (P65) </td><td> CD4 </td></tr><tr><td> PDC </td><td> Lin1</td><td> CD123 </td><td> NF-κB (P65) </td><td> CD4 </td></tr></tbody></table> لوحة جدول جسم 2. لتلطيخ نسب خلية من مسارات الإشارات الوحيدات: CD14 + حركة التغيير الديمقراطي: Lin1، CD4dim، CD11c + PDC: Lin1، CD4dim، CD123 + Lin1 (النسب) علامة يتضمن CD3، CD14، CD19، CD20، CD56 علامات للحيدات، الخلايا القاتلة الطبيعية، T &amp; B الخلايا.

quantitative imaging of lineage-specific toll-like receptor-mediated signaling in monocytes and dendritic cells from small samples of human blood

الاختلافات الفردية في الحالة المناعية تحديد الردود على العدوى والمساهمة في شدة المرض والنتيجة. ويرتبط الشيخوخة مع زيادة الحساسية للالتهابات الفيروسية والبكتيرية وانخفاض القدرة على الاستجابة للقاحات مع انخفاض الموثقة توثيقا جيدا في الخلطية فضلا عن الخلية التي تتوسط فيها 1،2 الاستجابات المناعية. لقد قمنا بتقييم مؤخرا من آثار الشيخوخة على الرقم مثل مستقبلات (TLRs)، والمكونات الرئيسية للنظام المناعة الفطرية التي تكشف عن العدوى الميكروبية والزناد دفاع المضيف مضادات الميكروبات ردود 3. في لفيف كبير من الجهات المانحة البشرية الصحية، ونحن أظهرت أن حيدات الدم المحيطي من كبار السن قد انخفضت التعبير وظيفة TLRs معينة (4) ومستويات مماثلة TLR انخفاض والاستجابات يشير في الخلايا الجذعية (DCS)، مستضد تقديم الخلايا التي تقوم بدور محوري في الربط بين الحصانة الفطرية والتكيفية 5. لقد أظهرنا dysregulation من TLR3 في الضامة 1د انخفاض إنتاج الإنترفيرون من قبل البلدان النامية من الجهات المانحة المسنين في استجابة للإصابة بعدوى فيروس غرب النيل 6،7. قصوى في فهمنا للتشيخ مناعي والتدخل العلاجي هو فهم مفصل لأنواع معينة من الخلايا الاستجابة وآلية (ق) من نقل الإشارة. لقد تقدمت الدراسات التقليدية من الاستجابات المناعية من خلال التصوير من الخلايا الأولية وعلامات الخلية المسح من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية أو طخة مناعية فهمنا بشكل كبير، ومع ذلك، وتقتصر هذه الدراسات بشكل عام من الناحية الفنية من خلال حجم عينة صغيرة المتاحة من المرضى وعدم القدرة على إجراء تقنيات مختبرية معقدة على عدة الإنسان العينات. ImageStream يجمع كمية التدفق الخلوي في وقت واحد مع عالية الدقة التصوير الرقمي، وبالتالي يسهل تحقيق في السكان الخلية متعددة متزامنة لالتقاط كفاءة قابلية المريض. نحن هنا لشرح استخدام ImageStream في البلدان النامية لتقييم TLR7 / 8تفعيل بوساطة الزيادات في الفسفرة وإزفاء النووية عامل النسخ مفتاح، NF-κB، الذي يبدأ النسخ من الجينات العديدة التي تعتبر بالغة الأهمية بالنسبة الاستجابات المناعية 8. باستخدام هذه التكنولوجيا، ونحن كما أظهرت مؤخرا تغيير غير المعترف بها من قبل من TLR5 إشارات والمسار NF-κB في حيدات من أقدم الجهات المانحة التي قد تسهم في الاستجابة المناعية المعدلة في الشيخوخة 9.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood at JoVE.com

Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

وصفنا استخدام التكنولوجيا ImageStream (<a href="http://www.amnis.com/" target="_blank"&gt; www.amnis.com</a&gt;)، والذي يجمع بين كمية التدفق الخلوي في وقت واحد مع عالية الدقة التصوير الرقمي، لتحديد الآليات الخلوية لخلايا المناعة الأولية من الأفواج المريض واضحة المعالم. دراستنا توفر نموذجا للتحقيقات لتحديد نسب متعدية الاستجابات الخلوية محددة في عينات صغيرة من الأفواج الموضوع.

الكمية التصوير من النسب المحددة اشارة مستقبلات بوساطة الرقم تشبه في وحيدات والخلايا الجذعية من عينات صغيرة من دم الإنسان

Individual variations in immune status determine responses to infection and contribute to disease severity and outcome.  Aging is associated with an ...

quantitative-imaging-lineage-specific-toll-like-receptor-mediated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

35.0K Views.  Yale University School of Medicine. وصفنا استخدام التكنولوجيا ImageStream ( www.amnis.com)، والذي يجمع بين كمية التدفق الخلوي في وقت واحد مع عالية الدقة التصوير الرقمي، لتحديد الآليات الخلوية لخلايا المناعة الأولية من الأفواج المريض واضحة المعالم. دراستنا توفر نموذجا للتحقيق?...

Video: Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

Detection of  Neu1 Sialidase Activity in Regulating TOLL-like Receptor Activation

Mammalian Toll-like receptors (TLRs) are a family of receptors that recognize pathogen-associated molecular patterns. Not only are TLRs crucial sensors of microbial (e.g., viruses, bacteria and parasite) infections, they also play an important role in the pathophysiology of infectious diseases, inflammatory diseases, and possibly in autoimmune diseases. Thus, the intensity and duration of TLR responses against infectious diseases must be tightly controlled. It follows that understanding the structural integrity of sensor receptors, their ligand interactions and signaling components is essential for subsequent immunological protection. It would also provide important opportunities for disease modification through sensor manipulation. Although the signaling pathways of TLR sensors are well characterized, the parameters controlling interactions between the sensors and their ligands still remain poorly defined. We have recently identified a novel mechanism of TLR activation by its natural ligand, which has not been previously observed 1,2. It suggests that ligand-induced TLR activation is tightly controlled by Neu1 sialidase activation. We have also reported that Neu1 tightly regulates neurotrophin receptors like TrkA and TrkB 3, which involve Neu1 and matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) cross-talk in complex with the receptors 4. The sialidase assay has been initially use to find a novel ligand, thymoquinone, in the activation of Neu4 sialidase on the cell surface of macrophages, dendritic cells and fibroblast cells via GPCR G&alpha;i proteins and MMP-9 5. For TLR receptors, our data indicate that Neu1 sialidase is already in complex with TLR-2, -3 and -4 receptors, and is induced upon ligand binding to either receptor. Activated Neu1 sialidase hydrolyzes sialyl &alpha;-2,3-linked &beta;-galactosyl residues distant from ligand binding to remove steric hinderance to TLR-4 dimerization, MyD88/TLR4 complex recruitment, NFkB activation and pro-inflammatory cell responses. In a collaborative report, Neu1 sialidase has been shown to regulate phagocytosis in macrophage cells 6. Taken together, the sialidase assay has provided us with powerful insights to the molecular mechanisms of ligand-induced receptor activation. Although the precise relationship between Neu1 sialidase and the activation of TLR, Trk receptors has yet to be fully elucidated, it would represent a new or pioneering approach to cell regulation pathways.

The sialidase assay is a simple technical approach that will elucidate novel molecular mechanism(s) of TLR sensors of microbial infections and involvement in inflammatory diseases at the receptor level on the cell surface of live macrophages.

الكشف عن نشاط تنظيم سياليداز Neu1 في اتصال مثل تنشيط مستقبلات

Mammalian Toll-like receptors (TLRs) are a family of receptors that recognize pathogen-associated molecular patterns. Not only are TLRs crucial sensors of ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

عزل الخلايا الجذعية متعلق بالنخاع الشوكي والخلايا الظهارية من الغدة الصعترية الإنسان

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

توليد خلايا T الإنسان مستضد خيفي محددة من الدم المحيطي

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. Macrophages express surface Toll-like receptors (TLRs), which recognize molecular patterns conserved through evolution in a wide range of microorganisms. TLRs play a central role in macrophage activation which is usually associated with gene expression alteration. Macrophages are critical in many diseases and have emerged as attractive targets for therapy. In the following protocol, we describe a procedure to isolate murine peritoneal macrophages using Brewer&#8217;s thioglycollate medium. The latter will boost monocyte migration into the peritoneum, accordingly this will raise macrophage yield by 10-fold. Several studies have been carried out using bone marrow, spleen or peritoneal derived macrophages. However, peritoneal macrophages were shown to be more mature upon isolation and are more stable in their functionality and phenotype. Thus, macrophages isolated from murine peritoneal cavity present an important cell population that can serve in different immunological and metabolic studies. Once isolated, macrophages were stimulated with different TLR ligands and consequently&#160;gene expression was evaluated.

We describe here a simple protocol to isolate murine peritoneal macrophages. This procedure is followed by RNA extraction to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.

عزل الفئران البريتوني الضامة لتنفيذ جين تحليل التعبير عند تول مثل مستقبلات تحفيز

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

جيل من الوحيدات المستمدة الخلايا الجذعية البشرية من الدم الكامل

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express Fc&#947;Rs (e.g., Fc&#947;RI, Fc&#947;RIIA, Fc&#947;RIIB, and Fc&#947;RIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of Fc&#947;R-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate Fc&#947;Rs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out Fc&#947;R-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo Fc&#947;R-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of Fc&#947;R-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&amp;#947; Receptor-mediated Phagocytosis

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis.

استخدام الوحيدات أحادي الطبقة الفحص لتقييم البلعمة بوساطة مستقبلات Fcγ

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

ديكستران يعزز كفاءة توصيل لينتيفيرال الخلايا ناغورني كاراباخ الابتدائي مورين والبشرية

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research investigating immunological responses against A. fumigatus has been limited by the lack of consistent and reliable assays for measuring the antifungal activity of specific immune cells in vitro. A new method is described to assess the antifungal activity of primary monocytes and neutrophils from human donors against A. fumigatus using FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE) conidia. These conidia contain a genetically encoded dsRed reporter, which is constitutively expressed by live FLARE conidia, and are externally labeled with Alexa Fluor 633, which is resistant to degradation within the phagolysosome, thus allowing a distinction between live and dead A. fumigatus conidia. Video microscopy and flow cytometry are subsequently used to visualize the interaction between conidia and innate immune cells, assessing fungicidal activity whilst also providing a wealth of information on phagocyte migration, phagocytosis and the inhibition of fungal growth. This novel technique has already provided exciting new insights into the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus. It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.
It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Here, we describe a protocol to assess antifungal activity of primary human immune cells in real-time using fluorescent Aspergillus reporter conidia in conjunction with live-cell video microscopy and flow cytometry. Generated data provide insight into host cell-Aspergillus interactions such as fungicidal activity, phagocytosis, cell migration and inhibition of fungal growth.

التصوير المباشر لآخر مضاد من قبل العدلات الإنسان الأساسية وحيدات في الاستجابة لل<em&gt; A. فوميجاتوس</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low numbers of DCs present per tissue. Yet, as the phenotype and function of DCs is modified by the tissue environment, it is necessary to analyze tissue resident DC populations, since blood derived DCs incompletely reflect the complexities of DCs in tissues. Here we present a protocol to isolate DCs from the human female reproductive tract (FRT) using hysterectomy specimens that allows both phenotypical and functional analyses. The protocol consists of tissue digestion to generate a single cell mixed cell suspension, followed by positive magnetic bead selection. Our tissue digestion protocol does not cleave surface markers, which allows phenotypical and functional analysis of DCs in the steady state, without overnight incubation or cell activation. This protocol can be adapted for the isolation of other immune cell types or isolation of DCs from other tissues.

We describe here a method to isolate and purify dendritic cells from different anatomical compartments in the human female reproductive tract for the evaluation of their phenotypical and functional characteristics. This method can be adapted to isolate other immune cells or dendritic cells from other mucosal tissues.

عزل الخلايا الجذعية من الإنسان الأنثى التناسلي للدراسات الشكلية والوظيفية

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&amp;#945;

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

التنمية والتحقق من جزيء واحد أولتراسينسيتيفي الصفيف الرقمي المرتبط بالانزيم مقايسة الممتز للبشرية انترفيرون-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...