Este trabalho foi financiado em parte pelo NIH (N01 HHSN272201100019C, U19 AI 089992, e do Programa NCRR / GCRC M01-RR00125). Os autores declaram qualquer conflito de interesse financeiros e agradecer ao Dr. Mark Shlomchik, diretor do Núcleo Facilidade Yale celular Sorter.

1. Isolamento e Estimulação de células imunes <ol><li> Obter 10-50 ml de sangue heparinizado de voluntários saudáveis ​​após consentimento informado por escrito sob as diretrizes do Conselho de Revisão Institucional locais. Para estudos de envelhecimento ou a doença de exclusão, patogênese e os critérios de inclusão para cada voluntário ou paciente deve ser explicitamente determinada. </li><li> Isolar células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), utilizando tubos de CPT ou Ficoll-Paque Plus acordo com as instruções do fabricante (GE Healthcare, NJ) e as experiências de conduta no dia do isolamento 7 (Reagentes, Tabela 1). </li><li> Incubar PBMCs (3 x 10 6 / tubo) em tubos de 1,5 ml em 0,6 ml de meio por si só ou estimuladas com ligandos TLR ou outros agentes de activação, por exemplo, o ligando TLR7 / 8 R848 (0,6 ml de meio mais 0,6 uL de 10 mM TLR7 / 8 ligando R848 concentração final, 10 uM) a 37 ° C durante 10-60 min (InvivoGen, CA) 9. </li></ol> 2. LabEling de Células <ol><li> Linhagem celular rótulo e outros marcadores de superfície sobre a suspensão de células vivas utilizando anticorpos fluorescente-conjugados. Etiqueta 3 x 10 6 PBMCs de 20 min a 4 ° C em 100 ul de PBS / 2% de FBS em um tubo Eppendorf de 1,5 ml com um cocktail de anticorpos específicos da superfície para linhagens de monócitos ou DC (Tabela 2). Diluições de anticorpos óptimo pode ser determinado em experiências preliminares e as amostras devem ser processado em lotes para minimizar de lote para lote-variação. Para o estoque fornecedor de anticorpo de 0,1 mg / ml utilizar 5 uL de anticorpo (diluição 1:20). Use um tubo separado de células marcadas com apenas um conjugado de cor única para definir os canais fluorescentes no instrumento. </li><li> Após a marcação de superfície, fixar as células em 4% PFA / PBS durante 10 min à TA. Para armazenamento até ao momento da análise, as células de centrifugação a 500 xg e Ressuspender as células em tampão de congelação (90% de FBS contendo DMSO a 10%) a -80 ° C até que o dia do ensaio. </li><li> Para avaliação, processo de lotes of células não tratadas e estimuladas a partir de um grupo de dadores em conjunto para minimizar a variabilidade. No dia da análise, as células descongelamento rapidamente em 37 ° C banho de água, de centrifugação a 500 xg para remover o tampão de congelação. </li><li> Para permeabilizar as células para a detecção de citocinas intracelulares ou outros marcadores, suspensões de células Ressuspenda em 100 uL de tampão BD Perm / Wash (BD Biosciences, NJ). Rótulo para intracelulares componentes de sinalização com, por exemplo, diluição 1:20 de coelho anti-NF-kB anticorpo (p65) (concentração final 10 ug / ml, Santacruz Biotechnology, CA) durante 20 min a RT, de centrifugação a 500 xg, o sobrenadante aspirado e Ressuspender as células em 100 uL Perm BD / Tampão de lavagem contendo 1:250 de diluição de cabra anti-IgG de coelho-Alexa647 (Invitrogen, CA) e incubar durante 20 min à TA. </li><li> Imediatamente antes de imagiologia, contracoloração núcleos com DAPI (0,2 ug / ml, Invitrogen, CA) ou iodeto de propídio (PI; 20 ng / ml, Invitrogen, CA). </li></ol> 3. Análise ImageStream <ol><li>Conduzir imagem por ImageStream em amostras de lote para reduzir a variabilidade entre amostras humanas. As definições do aparelho para alimentação dos lasers eram como se segue: 200 mW para 488 nm, 10 mW para 658 nm e 250 mW para 405 nm. </li><li> Para analisar os arquivos de dados (Fig. 1), em primeiro lugar, portão em eventos com intensidade PI normal e alta relação de aspecto PI (largura: relação da altura) para distinguir células individuais (R1) de detritos (PI intensidade baixa) ou multi-celulares (eventos PI intensidade alta e baixa relação de aspecto). Os monócitos são dentro de um portão de células CD14 positivas. mDCs estão dentro de uma porta para as células que são altos para CD11c e de baixo para CD4 (R2) e também para baixo Lin-1 marcadores (R3). </li><li> Use IDEAS software (Amnis, WA) para fornecer uma medida eficaz quantitativa do grau de activação de cada célula. Determinar semelhança (ou co-localização) do factor de transcrição NF-kB citoplasmática com corante nuclear PI para indicar translocação para o núcleo (R4). A alta correlação de NF-κB/PI localização reflecte-se numa pontuação de semelhança elevado e indica o grau de activação 10. </li><li> Comparar os índices de similaridade entre os grupos de tratamento diferentes ou populações de doentes para indicar a eficiência relativa funcional das células. Quantificar os dados entre as amostras através da comparação estatística dos valores absolutos ou diferenças de dobra. Use software IDEAS para exibir imagens de células a partir de segmentos de chaves de histogramas da população (Fig. 2). </li></ol> 4. Os resultados representativos Temos quantificada vias de sinalização em resposta a um ligando modelo viral, estimulando PBMC com o ligando TLR7 / 8, R848 (Fig. 1). Foram coletadas duas imagens de localização celular e estatísticas populacionais em grupos de nossa amostra (Fig. 2). ImageStream nos permite subpopulações de células porta diretamente de PBMCs e respostas celulares de imagem de populações de células fechadas, mas não classificado. Aqui nós quantificamos o efeito de TLR signaling na localização nuclear do NF-kB (p65) em Lin1, CD4 dim, CD11c + mielóide DCs (mDCs). Na linha de base, observou-se uma percentagem elevada de células não estimuladas com o factor de transcrição NF-kB (p65) no citoplasma. Após a estimulação, as células tratadas têm uma pontuação de semelhança significativamente maior de NF-B (p65) com PI mancha nuclear, indicando que o NF-kB (p65) translocado para o núcleo, após a estimulação (pontuações de similaridade mediana são 1,52 e 3,01, respectivamente, a fig. 2). Resultados semelhantes são observados nas TLR5 monócitos estimulados 9. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3741/3741fig1.jpg" /> Figura 1. Coloração e Estratégia Gating para quantificar os efeitos da estimulação em mDCs humanos. O factor de transcrição NF-kB regula a expressão de numerosos genes do sistema imunológico. Este estudo mede a localização nuclear de NF-kB (p65) em mDCs de um sujeito representativo após TLR7 / 8 liga<html> estimulação nd. Em foco células individuais foram identificados pela passagem no PI eventos positivos, com altas proporções nucleares (R1). mDCs (Lin1, CD4dim, CD11c +) foram fechado em R3. Localização nuclear do NF-kB (p65) é representada em R4. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3741/3741fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3741/3741fig2.jpg" /> Figura 2. . Translocação de NF-kB em mDCs após a estimulação A translocação de NF-kB (p65) para dentro do núcleo após a estimulação (R4) é descrito em populações de mDCs não tratadas e estimuladas; a pontuação de semelhança mediana é 1,52 na amostra não tratada e 3,01 em a amostra estimulado (A). As imagens digitais colhidas simultaneamente das populações de células não tratadas ou R848-estimulado mostram as células representativas e da intensidade do NF-B translocado para o núcleo da célula (B)._upload/3741/3741fig2large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clique aqui para ver maior figura.

<ol>
	<li>Linton, P. J., Dorshkind, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+lymphocyte+development+and+function.">Age-related changes in lymphocyte development and function.</a> Nat. Immunol. 5, 133-139 (2004).</li><li>Shaw, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+Human+Toll-like+Receptor+Function+in+Aging.">Dysregulation of Human Toll-like Receptor Function in Aging.</a> Ageing Research Reviews. 10, 346-353 (2011).</li><li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors+and+innate+immunity.">Toll-like receptors and innate immunity.</a> Nature Rev. Immunol. 1, 135-145 (2001).</li><li>van Duin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+Defect+in+Human+TLR1+Function+and+Expression.">Age-associated Defect in Human TLR1 Function and Expression.</a> J. Immunol. 178, 970-975 (2007).</li><li>Panda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+decrease+in+TLR+function+in+primary+human+dendritic+cells+predicts+influenza+vaccine+response.">Age-associated decrease in TLR function in primary human dendritic cells predicts influenza vaccine response.</a> J. Immunol. 184, 2518-2527 (2010).</li><li>Kong, K. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+TLR3+impairs+the+innate+immune+response+to+West+Nile+virus+in+the+elderly.">Dysregulation of TLR3 impairs the innate immune response to West Nile virus in the elderly.</a> J. Virol. 82, 7613-7623 (2008).</li><li>Qian, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+interferon+signaling+in+dendritic+cells+from+older+donors+infected+in+vitro+with+West+Nile+virus.">Impaired interferon signaling in dendritic cells from older donors infected in vitro with West Nile virus.</a> J. Infect. Dis. 203, 1415-1424 (2011).</li><li>Hayden, M. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+in+immunobiology.">NF-kappaB in immunobiology.</a> Cell research. 21, 223-244 (2011).</li><li>Qian, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+elevation+in+TLR5+leads+to+increased+inflammatory+responses+in+the+elderly.">Age-associated elevation in TLR5 leads to increased inflammatory responses in the elderly.</a> Aging Cell. 11, 104-110 (2011).</li><li>George, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+nuclear+translocation+events+using+similarity+analysis+of+multispectral+cellular+images+obtained+in+flow.">Quantitative measurement of nuclear translocation events using similarity analysis of multispectral cellular images obtained in flow.</a> Journal of immunological. 311, 117-129 (2006).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Os passos críticos no uso de ImageStream para estudos translacionais são a seleção de grupos de comparação relevantes e otimização e validação da especificidade do anticorpo. As diferenças entre os grupos de indivíduos no alvo marcada serão facilmente aparentes através de histogramas e imagens de células. Em combinação com uma análise aprofundada das alterações nos receptores e vias de sinalização relevantes, estes dados fornecerá informações valiosas sobre os mecanismos que estão subjacentes a...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Ficoll-Paque Plus </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1440-03 </td></tr><tr><td> R848 </td><td> Invivogen </td><td> tlrl-r848 </td></tr><tr><td> Paraformaldeído (16%) </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 15710 </td></tr><tr><td> BD Perm / Wash </td><td> BD Biosciences </td><td> 554723 </td></tr><tr><td> CD14-PE </td><td> eBioscience </td><td> 12-0149-41 </td></tr><tr><td> CD4-PacBlue </td><td> BD Pharmingen </td><td> 68436 </td></tr><tr><td> Cocktail Lineage 1 (lin 1)-FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 340546 </td></tr><tr><td> CD11c-PE </td><td> BD Biosciences </td><td> 347637 </td></tr><tr><td> CD123-PE </td><td> BD Biosciences </td><td> 340545 </td></tr><tr><td> de coelho anti-NF-kB (p65) </td><td> Santacruz </td><td> SC-372 </td></tr><tr><td> Alexa647 F (ab &#39;) 2 de cabra anti-IgG de coelho </td><td> Invitrogen </td><td> A21246 </td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> D21490 </td></tr><tr><td> ImageStream X </td><td> Amnis </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 1. Reagentes específicos e equipamentos. <table border="1"><tbody><tr><td> Tipo de célula </td><td> FITC </td><td> PE </td><td> Alexa 647 </td><td> PacBlue </td></tr><tr><td> Monócitos </td><td></td><td> CD14 </td><td> NF-kB (p65) </td><td></td></tr><tr><td> MDC </td><td> Lin1 </td><td> CD11c </td><td> NF-kB (p65) </td><td> CD4 </td></tr><tr><td> pDC </td><td> Lin1</td><td> CD123 </td><td> NF-kB (p65) </td><td> CD4 </td></tr></tbody></table> Tabela 2 painel de anticorpos. Para a coloração de células de linhagem de vias de sinalização Monócitos: CD14 + MDC: Lin1, CD4dim, CD11c + PDC: Lin1, CD4dim, CD123 + Lin1 marcador (linhagem) inclui CD3, CD14, CD19, CD20, CD56 marcadores para monócitos, células NK, células T e B.

quantitative imaging of lineage-specific toll-like receptor-mediated signaling in monocytes and dendritic cells from small samples of human blood

As variações individuais no estado imunitário determinar as respostas à infecção e contribuir para a gravidade da doença eo resultado. O envelhecimento está associado com um aumento da susceptibilidade a infecções virais e bacterianas e diminuiu a capacidade de resposta para vacinas com um declínio bem documentado na humoral assim como mediada por células 1,2 respostas imunes. Recentemente, avaliou os efeitos do envelhecimento sobre receptores Toll-like (TLRs), os principais componentes do sistema imune inato que detectar a infecção microbiana e desencadear respostas de acolhimento de defesa antimicrobianos 3. Em uma grande coorte de doadores humanos saudáveis, nós mostramos que os monócitos do sangue periférico de idosos têm diminuição da expressão e função de determinados TLRs 4 e semelhantes níveis reduzidos TLR e respostas de sinalização em células dendríticas (DCs), células apresentadoras de antígeno que são fundamentais na a ligação entre a imunidade inata e adaptativa 5. Nós mostramos desregulação do TLR3 em macrófagos umad menor produção de IFN por DCs de doadores idosos em resposta à infecção com o vírus do Nilo Ocidental 6,7. Primordial para nossa compreensão da imunossenescência e à intervenção terapêutica é um entendimento detalhado dos tipos de células específicos em resposta e do mecanismo (s) de transdução de sinal. Estudos tradicionais de respostas imunes através de imagens de pilhas e marcadores de células de levantamento por FACS ou immunoblot têm avançado significativamente a nossa compreensão, no entanto, estes estudos são geralmente limitados tecnicamente pelo pequeno volume de amostra disponível a partir de pacientes e da incapacidade de realizar técnicas laboratoriais complexas em vários amostras humanas. ImageStream combina citometria de fluxo quantitativa simultânea com alta resolução de imagem digital e, assim, facilita investigação em populações de células múltiplas contemporaneamente para uma captura eficiente do susceptibilidade do paciente. Aqui temos demonstram o uso de ImageStream em DCs para avaliar TLR7 / 8activação mediada-aumentos na fosforilação e translocação nuclear de um factor de transcrição de chave, NF-kB, a qual inicia a transcrição de numerosos genes que são críticas para as respostas imunes 8. Usando esta tecnologia, temos também demonstrou recentemente uma alteração previamente não reconhecido de TLR5 sinalização e na via de NF-kB em monócitos de doadores mais velhos que possam contribuir para a resposta imune alterada no envelhecimento 9.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood at JoVE.com

Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

Descrevemos uso da tecnologia de ImageStream (<a href="http://www.amnis.com/" target="_blank"&gt; Www.amnis.com</a&gt;), Que combina a citometria de fluxo quantitativa simultânea com alta resolução de imagem digital, para quantificar os mecanismos celulares primárias de células imunes de coortes bem definidas do paciente. Nossos estudos fornecem um modelo para investigações de translação para quantificar linhagem específica respostas celulares em pequenas amostras de coortes de indivíduos.

Imagem quantitativa da linhagem específica Toll-like receptor-mediados sinalização em monócitos e células dendríticas a partir de pequenas amostras de sangue humano

Individual variations in immune status determine responses to infection and contribute to disease severity and outcome.  Aging is associated with an ...

quantitative-imaging-lineage-specific-toll-like-receptor-mediated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

35.0K visualizações.  Yale University School of Medicine. Descrevemos uso da tecnologia de ImageStream ( Www.amnis.com), Que combina a citometria de fluxo quantitativa simultânea com alta resolução de imagem digital, para quantificar os mecanismos celulares primárias de células imunes de coortes bem definidas do paciente. Nossos estudos fornecem um modelo para investigações de translação para quantificar linhagem específica respostas celulares em pequenas amostr...

Vídeo: Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood