עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי NIH (N01 HHSN272201100019C, U19 AI 089992, והתכנית NCRR / GCRC M01-RR00125). החוקרים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים ותודה ד&quot;ר מארק Shlomchik, מנהל מתקן סדרן נייד Core ייל.

1. בידוד וגירוי של תאים חיסוניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג 10-50 מ&quot;ל דם heparinized ממתנדבים בריאים לאחר הסכמה מדעת בכתב לפי הנחיות הדירקטוריון סקירה מקומית המוסדי. ללימודים של הזדקנות או מחלות, הפתוגנזה הדרה קריטריוני ההכללה של כל מתנדב או המטופל חייב להיקבע במפורש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את האדם כדוריות דם היקפיים (mononuclear PBMCs) באמצעות צינורות או CPT-Ficoll Paque פלוס על פי הוראות היצרן (GE Healthcare, ניו ג&#39;רזי) וניסויים התנהגות ביום בידוד 7 (ריאגנטים, טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה PBMCs (3 x 10 6 / גליל) ב 1.5 צינורות מ&quot;ל בינוני 0.6 מ&quot;ל לבד או מגורה עם ligands TLR או סוכנים ההפעלה של אחרים, למשל ליגנד TLR7 / 8 R848 (0.6 מ&quot;ל בינוני פלוס 0.6 μl של 10 mM TLR7 / 8 ליגנד R848, הריכוז הסופי 10 מיקרומטר) על 37 מעלות צלזיוס במשך 10-60 דקות (InvivoGen, CA) 9. </li></ol> 2. מעבדהeling של תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא תווית שושלת וטושים פני אחרים השעיות תא חי באמצעות נוגדנים fluorescently-מצומדות. לייבל 3 x 10 6 PBMCs של 20 דקות על 4 מעלות צלזיוס ב 100 μl של PBS / 2% FBS של צינור 1.5 Eppendorf מ&quot;ל עם קוקטייל של נוגדנים ספציפיים על פני השטח שושלות מונוציטים או DC (טבלה 2). דילולים נוגדנים אופטימליים ניתן לקבוע בניסויים דגימות ראשוניות אמורה להתבצע בקבוצות כדי למזער הרבה-to-הרבה וריאציה. עבור המניות הספק נוגדנים של 0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​להשתמש 5 μl של נוגדנים (01:20 דילול). השתמש בצינור נפרד של תאים תווית עם הצמוד רק צבע אחד יחיד כדי להגדיר את ערוצי ניאון על המכשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תיוג פני השטח, לתקן תאים 4% PFA / PBS 10 דקות ב RT. לאחסון עד למועד הניתוח, תאים צנטריפוגות ב XG 500 ותאי resuspend במאגר קפוא (90% FBS המכיל 10% DMSO) ב -80 ° C עד היום של assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך התהליך, הערכת קבוצות oפריץ בתאים שלא טופלו ועורר מתוך קבוצה של תורמים יחד כדי לצמצם את השונות. ביום של הניתוח, תאים ההפשרה במהירות 37 ° C אמבט מים, צנטריפוגה ב g 500X להסיר חיץ ההקפאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי permeabilize התאים לצורך זיהוי של ציטוקינים תאיים או סמנים אחרים, השעיות סלולריים resuspend ב 100 חיץ μl BD פרם / Wash (BD Biosciences, NJ). תווית עבור רכיבים איתות תאיים עם למשל, 1:20 דילול של נוגדן ארנבת (p65) נגד NF-κB (הריכוז הסופי 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל, SantaCruz ביוטכנולוגיה, קליפורניה) במשך 20 דקות ב RT, צנטריפוגות ב XG 500, aspirate supernatant ו תאים resuspend פרם ב 100 BD μl / לשטוף מאגר המכיל דילול של 1:250 נגד ארנב עז IgG-Alexa647 (Invitrogen, CA) ואת דגירה של 20 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסמוך לפני הדמיה, counterstain גרעינים עם DAPI (0.2 מיקרוגרם / מ&quot;ל, Invitrogen, CA) או יודיד propidium (לצרכן: 20 ng / ml, Invitrogen, CA). </li></ol> 3. ImageStream ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl">לבצע הדמיה של ImageStream על דגימות ליכלכה להפחית שונות בין דגימות אנושיות. הגדרות מכשיר הכוח של לייזרים היו כדלקמן: 200 mW של 488 nm, 10 mW של 658 ננומטר ו 250 מגוואט עבור 405 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח את קבצי הנתונים (איור 1), השער הראשון, על אירועים בעוצמה לצרכן רגיל יחס גבוה לצרכן היבט (רוחב: היחס בין גובה) כדי להבחין בין תאים בודדים (R1) מתוך פסולת (נמוך עוצמה PI) או רב תאיים אירועים ( בעוצמה גבוהה לצרכן ואת יחס גובה נמוך). מונוציטים הם בתוך השער של CD14 בתאים חיוביים. mDCs הם בתוך השער של תאים הנמצאים גבוה CD11c נמוך עבור CD4 (R2) נמוך גם לין -1 סמנים (R3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש ברעיונות תוכנה (Amnis, וושינגטון) כדי לספק מדד כמותי יעיל של מידת ההפעלה של כל תא. לקבוע דמיון (או שיתוף לוקליזציה) של גורם השעתוק NF-κB cytoplasmic עם הגרעין צבע לצרכן לציון טרנסלוקציה לתוך הגרעין (R4). מתאם גבוה של יישובים NF-κB/PIלאספקת בא לידי ביטוי הדמיון ציון גבוה מעיד על מידת ההפעלה 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השווה את יחס הדמיון בין קבוצות הטיפול השונות או אוכלוסיות חולים כדי להצביע על יעילות תפקודית יחסית של התאים. לכמת נתונים בין דגימות באמצעות השוואה סטטיסטית של ערכים מוחלטים או ההבדלים לקפל. השתמש בתוכנה רעיונות כדי להציג תמונות של תאים חלקים מרכזיים של היסטוגרמות האוכלוסייה (איור 2). </li></ol> 4. נציג תוצאות יש לנו לכמת במעברי האותות בתגובה ליגנד מודל ויראלי ידי גירוי PBMCs עם ליגנד TLR7 / 8, R848 (איור 1). אספנו את שתי התמונות לוקליזציה הסלולר וסטטיסטיקות האוכלוסייה בקבוצות של הדוגמה שלנו (איור 2). ImageStream מאפשר לנו תת סלולריים השער ישירות PBMCs תא תגובות תמונה אוכלוסיות תאים סגורות, אבל הרגיל. כאן אנו לכמת את ההשפעה של TLR שלignaling על לוקליזציה הגרעין של NF-κB (p65) ב-Lin1, CD4 עמום, CD11c + מיאלואידית DCS (mDCs). בתחילת המחקר, צפינו אחוז גבוה של תאים unstimulated עם גורם השעתוק NF-κB (p65) בציטופלסמה. לאחר גירוי, תאים שטופלו יש ציון גבוה משמעותית הדמיון של NF-B (p65) עם PI כתם גרעינית, המציין כי NF-κB (p65) translocated לתוך הגרעין לאחר גירוי (עשרות דמיון החציוני הם 1.52 ו 3.01, בהתאמה, איור. 2). תוצאות דומות ציין TLR5 למוצרי מגורה מונוציטים 9. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3741/3741fig1.jpg" /> באיור 1. מכתים ואסטרטגיה gating לכמת תופעות של גירוי על mDCs אדם. גורם השעתוק NF-κB מסדיר הביטוי של גנים רבים של המערכת החיסונית. המחקר מודד את הלוקליזציה הגרעין של NF-κB (p65) ב mDCs מנושא לנושא נציג לאחר TLR7 / 8 ליגה<html> ND גירוי. ב-להתמקד תאים בודדים זוהו על ידי gating על אירועים חיוביים לצרכן גבוהה היבט ratios גרעיני (R1). mDCs (Lin1-, CD4dim, CD11c +) היו מגודרת ב R3. לוקליזציה הגרעין של NF-κB (p65) הוא להתוות R4. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3741/3741fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה</a> . <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3741/3741fig2.jpg" /> איור 2. . טרנסלוקציה של NF-κB ב mDCs לאחר גירוי טרנסלוקציה של NF-κB (p65) לתוך הגרעין לאחר גירוי (R4) מתואר אוכלוסיות של mDCs שלא טופלו ולא מגורה, ציון הדמיון החציוני הוא 1.52 במדגם מטופלים ו 3.01 ב מדגם מגורה (א &#39;). תמונות דיגיטליות שנאספו בו זמנית של אוכלוסיות תאים שלא טופלו או R848-מגורה להראות תאים מייצגים ואת עוצמת NF-B translocated לתוך גרעין התא (ב &#39;)._upload/3741/3741fig2large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

<ol>
	<li>Linton, P. J., Dorshkind, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+lymphocyte+development+and+function.">Age-related changes in lymphocyte development and function.</a> Nat. Immunol. 5, 133-139 (2004).</li><li>Shaw, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+Human+Toll-like+Receptor+Function+in+Aging.">Dysregulation of Human Toll-like Receptor Function in Aging.</a> Ageing Research Reviews. 10, 346-353 (2011).</li><li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors+and+innate+immunity.">Toll-like receptors and innate immunity.</a> Nature Rev. Immunol. 1, 135-145 (2001).</li><li>van Duin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+Defect+in+Human+TLR1+Function+and+Expression.">Age-associated Defect in Human TLR1 Function and Expression.</a> J. Immunol. 178, 970-975 (2007).</li><li>Panda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+decrease+in+TLR+function+in+primary+human+dendritic+cells+predicts+influenza+vaccine+response.">Age-associated decrease in TLR function in primary human dendritic cells predicts influenza vaccine response.</a> J. Immunol. 184, 2518-2527 (2010).</li><li>Kong, K. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+TLR3+impairs+the+innate+immune+response+to+West+Nile+virus+in+the+elderly.">Dysregulation of TLR3 impairs the innate immune response to West Nile virus in the elderly.</a> J. Virol. 82, 7613-7623 (2008).</li><li>Qian, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+interferon+signaling+in+dendritic+cells+from+older+donors+infected+in+vitro+with+West+Nile+virus.">Impaired interferon signaling in dendritic cells from older donors infected in vitro with West Nile virus.</a> J. Infect. Dis. 203, 1415-1424 (2011).</li><li>Hayden, M. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+in+immunobiology.">NF-kappaB in immunobiology.</a> Cell research. 21, 223-244 (2011).</li><li>Qian, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+elevation+in+TLR5+leads+to+increased+inflammatory+responses+in+the+elderly.">Age-associated elevation in TLR5 leads to increased inflammatory responses in the elderly.</a> Aging Cell. 11, 104-110 (2011).</li><li>George, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+nuclear+translocation+events+using+similarity+analysis+of+multispectral+cellular+images+obtained+in+flow.">Quantitative measurement of nuclear translocation events using similarity analysis of multispectral cellular images obtained in flow.</a> Journal of immunological. 311, 117-129 (2006).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

השלבים הקריטיים השימוש ImageStream ללימודים של תרגום הם הבחירה של קבוצות השוואה רלוונטיות אופטימיזציה ואימות של סגוליות נוגדנים. הבדלים בין קבוצות נושא היעד שכותרתו תהיה ברורה ממבט ראשון באמצעות היסטוגרמות ותמונות סלולריים. בשילוב עם ניתוח מעמיק של שינויים הקולטנים רל?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> Ficoll-Paque פלוס </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1440-03 </td></tr><tr><td> R848 </td><td> Invivogen </td><td> tlrl-r848 </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde (16%) </td><td> מיקרוסקופית אלקטרונים למדעים </td><td> 15710 </td></tr><tr><td> BD פן / לשטוף </td><td> BD Biosciences </td><td> 554723 </td></tr><tr><td> CD14-PE </td><td> eBioscience </td><td> 12-0149-41 </td></tr><tr><td> CD4-PacBlue </td><td> BD Pharmingen </td><td> 68436 </td></tr><tr><td> קוקטייל השושלת 1 (לין 1), FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 340546 </td></tr><tr><td> CD11c-PE </td><td> BD Biosciences </td><td> 347637 </td></tr><tr><td> CD123-PE </td><td> BD Biosciences </td><td> 340545 </td></tr><tr><td> הארנב נגד NF-κB (p65) </td><td> SantaCruz </td><td> SC-372 </td></tr><tr><td> Alexa647 F (&#39;א.ב.) 2 עז נגד ארנב IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A21246 </td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> D21490 </td></tr><tr><td> ImageStream X </td><td> Amnis </td><td></td></tr></tbody></table> טבלה 1. ריאגנטים ספציפיים וציוד. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> סוג התא </td><td> FITC </td><td> PE </td><td> Alexa 647 </td><td> PacBlue </td></tr><tr><td> מונוציטים </td><td></td><td> CD14 </td><td> NF-κB (p65) </td><td></td></tr><tr><td> MDC </td><td> Lin1 </td><td> CD11c </td><td> NF-κB (p65) </td><td> CD4 </td></tr><tr><td> PDC </td><td> Lin1</td><td> CD123 </td><td> NF-κB (p65) </td><td> CD4 </td></tr></tbody></table> 2. לוח נוגדן פאנל עבור מכתים תא השושלת של מסלולי איתות מונוציטים: CD14 + MDC: Lin1-, CD4dim, CD11c + PDC: Lin1-, CD4dim, CD123 + Lin1 (שושלת) סמן כולל CD3, CD14, CD19, CD20, CD56 סמנים עבור מונוציטים, תאים NK, תאים T &amp; B.

quantitative imaging of lineage-specific toll-like receptor-mediated signaling in monocytes and dendritic cells from small samples of human blood

וריאציות אישיות במעמד החיסון לקבוע התגובות זיהום ולתרום חומרת המחלה ואת התוצאה. הזדקנות קשורה לרגישות מוגברת לזיהומים ויראליים וחיידקים וירידה ההיענות לחיסונים עם ירידה מתועד היטב על הלחות כמו גם התא בתיווך החיסונית 1,2 התגובות. יש לנו העריכו לאחרונה את השפעות ההזדקנות על חיוג כמו קולטנים (TLRs), רכיבים מרכזיים של מערכת החיסון המולדת, כי לזהות זיהום מיקרוביאלי ו מיקרוביאלית טריגר מארח הגנה התגובות 3. בכל קבוצה גדולה של תורמים אנושיים בריאים, הראינו כי מונוציטים בדם הפריפרי של הקשישים ירדו ביטוי ותפקוד של TLRs מסוימים דומים רמות 4 ו TLR מופחת ותגובות איתות תאים דנדריטים (DCS), אנטיגן, הצגת תאים שהם מרכזי הקשר בין חסינות מולד אדפטיבית 5. הראינו dysregulation של TLR3 ב מקרופאגיםד ייצור נמוך של אינטרפרון על ידי DCS מתורמים קשישים בתגובה לזיהום עם וירוס הנילוס המערבי 6,7. Paramount להבנת immunosenescence כדי התערבות טיפולית היא הבנה מפורטת של סוגי תאים מסוימים להגיב מנגנון (ים) של התמרה האות. מחקרים המסורתיים של התגובה החיסונית באמצעות הדמיה של תאים ראשוניים סמנים תא מדידות על ידי FACS או immunoblot קידמו את ההבנה שלנו באופן משמעותי, לעומת זאת, מחקרים אלה מוגבלים בדרך כלל טכנית, על פי היקף המדגם הקטן זמינים חולים וחוסר יכולת לבצע טכניקות מעבדה מורכבות על מספר רב של אדם דגימות. ImageStream משלב cytometry זרימת כמותית עם סימולטני ברזולוציה גבוהה הדמיה דיגיטלית, ובכך מקלה על החקירה אוכלוסיות תאים מרובים ההתרחשויות ללכוד יעיל של רגישות החולה. כאן אנו מדגימים את השימוש ImageStream ב DCS להעריך TLR7 / 8הפעלת בתיווך עליות זירחון ו טרנסלוקציה הגרעין של גורם שעתוק מפתח, NF-κB, אשר יוזם שעתוק של גנים רבים הם קריטיים עבור המערכת החיסונית 8. באמצעות טכנולוגיה זו, יש לנו גם הפגינו לאחרונה שינוי מוכרים קודם לכן של TLR5 איתות מסלול NF-κB ב מונוציטים מתורמים מבוגרים שעשוי לתרום התגובה החיסונית להשתנות ההזדקנות 9.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood at JoVE.com

Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

אנו מתארים שימוש בטכנולוגיה ImageStream (<a href="http://www.amnis.com/" target="_blank"&gt; Www.amnis.com</a&gt;), המשלבת cytometry זרימת כמותית עם סימולטני ברזולוציה גבוהה הדמיה דיגיטלית, לכמת המנגנונים התאיים של תאים חיסוניים ראשוניים של קבוצות מוגדרות היטב המטופל. המחקרים שלנו לספק תכנית לחקירות של תרגום לכמת ספציפיים השושלת התגובות הסלולר בדגימות קטנות מקבוצות הנושא.

הדמיה כמותי של שושלת ספציפית חיוג כמו קולטן בתיווך איתות מונוציטים ותאים דנדריטים של דגימות קטנות של דם אנושי

Individual variations in immune status determine responses to infection and contribute to disease severity and outcome.  Aging is associated with an ...

quantitative-imaging-lineage-specific-toll-like-receptor-mediated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

35.0K Views.  Yale University School of Medicine. אנו מתארים שימוש בטכנולוגיה ImageStream ( Www.amnis.com), המשלבת cytometry זרימת כמותית עם סימולטני ברזולוציה גבוהה הדמיה דיגיטלית, לכמת המנגנונים התאיים של תאים חיסוניים ראשוניים של קבוצות מוגדרות היטב המטופל. המחקרים שלנו לספק תכנית לחקירות של...

Video: Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

Detection of  Neu1 Sialidase Activity in Regulating TOLL-like Receptor Activation

Mammalian Toll-like receptors (TLRs) are a family of receptors that recognize pathogen-associated molecular patterns. Not only are TLRs crucial sensors of microbial (e.g., viruses, bacteria and parasite) infections, they also play an important role in the pathophysiology of infectious diseases, inflammatory diseases, and possibly in autoimmune diseases. Thus, the intensity and duration of TLR responses against infectious diseases must be tightly controlled. It follows that understanding the structural integrity of sensor receptors, their ligand interactions and signaling components is essential for subsequent immunological protection. It would also provide important opportunities for disease modification through sensor manipulation. Although the signaling pathways of TLR sensors are well characterized, the parameters controlling interactions between the sensors and their ligands still remain poorly defined. We have recently identified a novel mechanism of TLR activation by its natural ligand, which has not been previously observed 1,2. It suggests that ligand-induced TLR activation is tightly controlled by Neu1 sialidase activation. We have also reported that Neu1 tightly regulates neurotrophin receptors like TrkA and TrkB 3, which involve Neu1 and matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) cross-talk in complex with the receptors 4. The sialidase assay has been initially use to find a novel ligand, thymoquinone, in the activation of Neu4 sialidase on the cell surface of macrophages, dendritic cells and fibroblast cells via GPCR G&alpha;i proteins and MMP-9 5. For TLR receptors, our data indicate that Neu1 sialidase is already in complex with TLR-2, -3 and -4 receptors, and is induced upon ligand binding to either receptor. Activated Neu1 sialidase hydrolyzes sialyl &alpha;-2,3-linked &beta;-galactosyl residues distant from ligand binding to remove steric hinderance to TLR-4 dimerization, MyD88/TLR4 complex recruitment, NFkB activation and pro-inflammatory cell responses. In a collaborative report, Neu1 sialidase has been shown to regulate phagocytosis in macrophage cells 6. Taken together, the sialidase assay has provided us with powerful insights to the molecular mechanisms of ligand-induced receptor activation. Although the precise relationship between Neu1 sialidase and the activation of TLR, Trk receptors has yet to be fully elucidated, it would represent a new or pioneering approach to cell regulation pathways.

The sialidase assay is a simple technical approach that will elucidate novel molecular mechanism(s) of TLR sensors of microbial infections and involvement in inflammatory diseases at the receptor level on the cell surface of live macrophages.

איתור פעילות Neu1 Sialidase בוויסות חיוג כמו הפעלת קולטן

Mammalian Toll-like receptors (TLRs) are a family of receptors that recognize pathogen-associated molecular patterns. Not only are TLRs crucial sensors of ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

בידוד של תאי מיאלואידית דנדריטים ותאי האפיתל מקורנית האדם

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

דור של תאי T האנושי Alloantigen ספציפיים מהדם היקפי

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. Macrophages express surface Toll-like receptors (TLRs), which recognize molecular patterns conserved through evolution in a wide range of microorganisms. TLRs play a central role in macrophage activation which is usually associated with gene expression alteration. Macrophages are critical in many diseases and have emerged as attractive targets for therapy. In the following protocol, we describe a procedure to isolate murine peritoneal macrophages using Brewer&#8217;s thioglycollate medium. The latter will boost monocyte migration into the peritoneum, accordingly this will raise macrophage yield by 10-fold. Several studies have been carried out using bone marrow, spleen or peritoneal derived macrophages. However, peritoneal macrophages were shown to be more mature upon isolation and are more stable in their functionality and phenotype. Thus, macrophages isolated from murine peritoneal cavity present an important cell population that can serve in different immunological and metabolic studies. Once isolated, macrophages were stimulated with different TLR ligands and consequently&#160;gene expression was evaluated.

We describe here a simple protocol to isolate murine peritoneal macrophages. This procedure is followed by RNA extraction to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.

בידוד של הצפק Murine המקרופאגים לבצע ניתוח ביטוי גנים בעת ביצוע כמו אגרה רצפטורים הגירוי

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

דור של תאי דנדריטים אדם נגזר מונוציטים מן הדם מלא

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express Fc&#947;Rs (e.g., Fc&#947;RI, Fc&#947;RIIA, Fc&#947;RIIB, and Fc&#947;RIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of Fc&#947;R-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate Fc&#947;Rs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out Fc&#947;R-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo Fc&#947;R-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of Fc&#947;R-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&amp;#947; Receptor-mediated Phagocytosis

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis.

שימוש Assay מונוציטים חד שכבתי להערכת Fcγ קולטן בתיווך Phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

לתוספי משפר את היעילות התמרה חושית Lentiviral של תאי NK העיקרי מאתר ואנושי

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research investigating immunological responses against A. fumigatus has been limited by the lack of consistent and reliable assays for measuring the antifungal activity of specific immune cells in vitro. A new method is described to assess the antifungal activity of primary monocytes and neutrophils from human donors against A. fumigatus using FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE) conidia. These conidia contain a genetically encoded dsRed reporter, which is constitutively expressed by live FLARE conidia, and are externally labeled with Alexa Fluor 633, which is resistant to degradation within the phagolysosome, thus allowing a distinction between live and dead A. fumigatus conidia. Video microscopy and flow cytometry are subsequently used to visualize the interaction between conidia and innate immune cells, assessing fungicidal activity whilst also providing a wealth of information on phagocyte migration, phagocytosis and the inhibition of fungal growth. This novel technique has already provided exciting new insights into the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus. It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.
It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Here, we describe a protocol to assess antifungal activity of primary human immune cells in real-time using fluorescent Aspergillus reporter conidia in conjunction with live-cell video microscopy and flow cytometry. Generated data provide insight into host cell-Aspergillus interactions such as fungicidal activity, phagocytosis, cell migration and inhibition of fungal growth.

הדמיה חיה של פעילות אנטי פטרייתי על ידי אדם מן המעלה הראשונה נויטרופילים ומונוציטים בתגובה<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low numbers of DCs present per tissue. Yet, as the phenotype and function of DCs is modified by the tissue environment, it is necessary to analyze tissue resident DC populations, since blood derived DCs incompletely reflect the complexities of DCs in tissues. Here we present a protocol to isolate DCs from the human female reproductive tract (FRT) using hysterectomy specimens that allows both phenotypical and functional analyses. The protocol consists of tissue digestion to generate a single cell mixed cell suspension, followed by positive magnetic bead selection. Our tissue digestion protocol does not cleave surface markers, which allows phenotypical and functional analysis of DCs in the steady state, without overnight incubation or cell activation. This protocol can be adapted for the isolation of other immune cell types or isolation of DCs from other tissues.

We describe here a method to isolate and purify dendritic cells from different anatomical compartments in the human female reproductive tract for the evaluation of their phenotypical and functional characteristics. This method can be adapted to isolate other immune cells or dendritic cells from other mucosal tissues.

בידוד של תאים דנדריטים האדם באיברי הרבייה הנקביים ללימודי פנוטיפיות שהיו קיימות בעבר ופונקציונלי

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&amp;#945;

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

פיתוח ובדיקת של מולקולה בודדת העדינה מערך דיגיטלי מקושרים-אנזים Immunosorbent Assay עבור אינטרפרון אנושי-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...