نود أن نشكر التصوير نيكون المركز في كلية الطب بجامعة هارفارد، ووترز على وجه التحديد جينيفر، لارا Petrak والسلمون ويندي، لتدريب واستخدام المجاهر timelapse بهم. ونود أيضا أن نشكر روزا نج وبيسير أكيم لإجراء مناقشات ذات قيمة. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة جرانت 5695837 (إلى م. Iwanicki) وGM064346 إلى JSB، عن طريق منحة من ميريام والدكتور شيلدون اديلسون زاي للبحوث الطبية مؤسسة (لJSB).

1. المبيض خلية سرطان تشكيل الجسم الشبه الكروي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تستزرع طلب تقديم العروض في التعبير عن خلايا سرطان المبيض في قاعدة متوسطة 10٪ (ثقافة الخلية المخصصة المتوسطة التي تحتوي على خليط 50:50 من 199 وMCDB105، المعطل الجنين بنسبة 10٪ مصل بقري و 1٪ من ركلة جزاء، بكتيريا). للتعبير عن طلب تقديم العروض في غير المسماة خلايا سرطان المبيض، transfect الخلايا مع طلب تقديم العروض 1 تحتوي على البلازميد وحدد لخلايا معربا عن طلب تقديم العروض. بدلا من ذلك، يمكن استخدام النواقل الفيروسية للتعبير عن عابر البروتينات الفلورية، أو خلايا يمكن أن تكون مرحلة ما قبل احتضان مع أحمر فلوري خلية تعقب صبغ (إينفيتروجن). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل تشكيل الأجسام الشبه الكروية من سرطان المبيض، فمن الضروري أن تعد منخفضة التصاق 96 ثقافة أسفل جولة جيد أطباق. لإنتاج لوحات الثقافة المنخفضة التصاق، يضاف 30μl بولي HEMA (6mg هيدروكسي إيثيل ميثاكريليت في 1 95٪ EtOH مل) إلى حل كل بئر من 96 طبق كورنينج جيدا ثقافة الخلية. يتم تحضين لوحات 96 بشكل جيد في 37 درجة مئوية غير مرطب حاضنة لتتبخر والايثانول، لeaving فيلما من HEMA بولي في كل بئر. هذا الفيلم بولي HEMA يمنع الخلايا من الالتصاق على قاع البئر، مما اضطر الخلايا لتنمو في تعليق 18. [بدلا من ذلك، يمكن استخدام منخفضة للغاية لوحات ثقافة (موضوع متعدد الصفحات كورنينج) بدلا من بولي HEMA الأطباق المغلفة.] </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد مستعدون للثقافة التصاق منخفضة لوحات، ويعرض للتريبسين طبق من ذهب من خلايا سرطان المبيض، بيليه الخلايا في جهاز للطرد المركزي منضدية (هيراوس) عند 900 إطار التعاون الإقليمي لمدة 3 دقائق، ونضح وطاف في قاعدة متوسطة 10٪ إعادة تعليق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط تركيز مثل هذه الخلايا أن هناك 100 خلية لكل 50μl من قاعدة متوسطة 10٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50μl لتعليق الخلية المخففة علقت بشكل موحد على كل بئر من ال 96 جيدا بولي HEMA طبق ثقافة المغلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحة 96 بشكل جيد في 37 درجة مئوية خلية حاضنة الثقافة لمدة 16 ساعة (وينبغي زيادة هذه الكمية من الوقت أو ينقص تبعا لمقدار الوقت الذي يستغرقهخط خلية معينة لتشكيل الأجسام الشبه الكروية المتعددة الخلايا أو الظروف التجريبية المطلوبة) للسماح للخلايا سرطان المبيض إلى كتلة معا، وتشكيل كروي واحد متعددة الخلايا في كل بئر. يمكن لبعض الخلايا السرطانية الخضوع لموت الخلايا المبرمج خلال هذه الفترة، لذلك من المهم أن تختار وقتا قبل استحثاث موت الخلايا المبرمج. </li></ol> 2. تكوين خلايا الظهارية أحادي الطبقة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في خلية غطاء محرك السيارة والثقافة، وقبل معطف الآبار من 6 جيدا طبق ماتيك الزجاج أسفل مع فبرونيكتين بإضافة 2mL من فبرونيكتين 5μg / مل حل PBS إلى كل بئر من صحن وحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. جودة البصري للقيعان من الزجاج في أطباق ماتيك تسمح عالية الدقة التصوير المجهري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تستزرع GFP، معربا عن الخلايا الظهارية في قاعدة متوسطة 10٪. يعرض للتريبسين لوحة من الخلايا الظهارية، وتدور باستمرار في جهاز للطرد المركزي منضدية (هيراوس) في 900RPM لمدة 3 دقائق، نضح طاف، ومتوسطة في قاعدة 10٪ إعادة تعليق. ووالخلايا الظهارية استخدمت هنا تعبير بالفعل GFP عندما تم الحصول عليها، ولكن يمكن أن تنتج الخلايا الظهارية غير المسماة التي transfecting مع GFP 1 تحتوي على البلازميد [كدنا]، أو preincubating الخلايا في خلية أخضر فلوري تعقب صبغ (إينفيتروجن). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حضانة فبرونيكتين لمدة 30 دقيقة (في الخطوة 2.1)، وغسل الآبار الطبق ماتيك مع PBS 2mL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح في برنامج تلفزيوني وصفيحة 6 5 X10 الخلية الظهارية لكل بئر في كل بئر من صحن ماتيك 6 جيدا. احتضان الطبق ماتيك في 37 درجة مئوية خلية حاضنة الثقافة بين عشية وضحاها للسماح للخلايا الظهارية لتعلقها على طبق وتشكيل أحادي الطبقة. </li></ol> 3. الظهارية الفحص خلية التخليص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الماصة لجمع الأجسام الشبه الكروية بسرطان المبيض من 96 لوحة بولي HEMA جيد المغلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح في المتوسط ​​من بئر واحدة من طبق ماتيك 6 جيدا أحادي الطبقة التي تحتوي على الخلية الظهارية. يغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 2mL. إضافة كافة الأجسام الشبه الكروية من ص 96 جيدفي وقت متأخر لبئر واحدة من طبق ماتيك (~ 3X عدد الأجسام الشبه الكروية التي سوف يتم تصويرها لحساب هبوط الأجسام الشبه الكروية على جزء من الطبق الذي لا يمكن تصويرها). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع طبق ماتيك على مرحلة مجهر مضان مقلوب widefield قادرة على أداء الوقت الفاصل بين التصوير لمدة 8 ساعات على الأقل. استخدم مرحلة الآلية في مناصب متعددة في صورة طبق، مع العديد من الأحداث إقحام كروي، في تجربة واحدة. نستخدم TI-E نيكون مقلوب الميكانيكية Widefield الإسفار الوقت الفاصل بين مجهر المتكاملة مع نظام مثالي التركيز وانخفاض [20X-0.75 الفتحة العددية (NA)] التكبير الفرق NA / تدخل النقيض (DIC) علم البصريات، وtransilluminator الهالوجين نيكون مع 0،52 NA لمسافات طويلة العمل (LWD) مكثف، نيكون سريع (&lt;100 ميلي ثانية واحدة التبديل الوقت) الإثارة وانبعاث المرشحات (GFP تحويلة 480/40، إم 525/50، RFP-mCherry تحويلة 575/50 إم 640/50)، سوتر تنتقل بسرعة ومسار ضوء إيقاف الذكية epifluorescenceتبرد النسب، وخطي ترميز نيكون مرحلة الآلية، وهاماماتسو ORCA-AG المسؤول عن جهاز الديناميكي (اتفاقية مكافحة التصحر) وكاميرا، وحضانة مجهر مبنية خصيصا مع غرفة التحكم 2 درجة الحرارة وثاني أكسيد الكربون، ونيكون شيكل-AR عناصر برنامج الإصدار 3، و TMC طاولة الاهتزاز العزلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فإن الأجسام الشبه الكروية خلية سرطان المبيض تترسب في القاع من صحن ونعلق على أحادي الطبقة الخلية الظهارية. جمع GFP، طلب تقديم العروض والصور من المرحلة 20 + كروي / أحادي الطبقة التفاعلات، كل 10 دقائق، لمدة 8 ساعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فإن سرطان المبيض خلية الأجسام الشبه الكروية طلب تقديم العروض، معربا عن غزو في أحادي الطبقة GFP في التعبير عن الخلية الظهارية خلق ثقب في أحادي الطبقة. بعد 8 ساعات، قياس أحجام الثقوب عن طريق تتبع الثقوب السوداء في الصور GFP باستخدام عناصر البرنامج (أو برامج أخرى مناسبة مثل J الصورة). تطبيع حجم ثقب في حجم كروي الأولية من خلال تقسيم حجم ثقب في 8 ساعات بواسطة حجم كروي في الصورة المقابلة طلب تقديم العروض في الساعة صفر. في هذا السابقينوافرة، وقد تم قياس فقط في حجم ثقب مرة واحدة، ولكن يمكن قياسه عدة مرات في كافة مراحل التجربة ثماني ساعات لفهم أفضل للديناميات إقحام. </li></ol> 4. ممثل النتائج في هذا المثال، قارنا القدرة تخليص الظهارية من OVCA433 الأجسام الشبه الكروية المبيض خلية سرطان أن يكون التعبير الموهن من تالين-1 للسيطرة على OVCA433 الأجسام الشبه الكروية. وأضيفت OVCA433 الأجسام الشبه الكروية من كل مجموعة إلى صحن ماتيك التي تحتوي على ZT monolayers الخلية الظهارية. تم تصوير ستة الأجسام الشبه الكروية من كل مجموعة في كل 10 دقائق لمدة ثماني ساعات (الشكل 4، الفيلم 3، فيلم 4). وتم قياس الثقوب التي تنتج في أحادي الطبقة من الأجسام الشبه الكروية ونشر وبلغ متوسط ​​ست وظائف من كل مجموعة. الشكل 4 يوضح أن منطقة المتوسط ​​التي أنشأتها إزالة الأجسام الشبه الكروية تالين ضربة قاضية 1 هو أقل بكثير من متوسط ​​المساحة التي أوجدتها سيطرة الأجسام الشبه الكروية، مما يوحي بأن هناك حاجة لإزالة تالين الظهارية بواسطة OVCA433 الأجسام الشبه الكروية سرطان المبيض. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3888/3888fig1.jpg" /> الشكل 1. المبيض الإنبثاث السرطان. أورام المبيض الأساسي تطوير إما من المبيض الظهارة السطحية أو قناة فالوب. الخلايا السرطانية / مجموعات قطع من الورم الرئيسي، وجمع في التجويف البريتوني. ويمكن بعد ذلك الخلايا السرطانية تجميعها لتشكيل الأجسام الشبه الكروية المتعددة الخلايا. الأجسام الشبه الكروية نعلق بعد ذلك إلى الخلية الظهارية المبطنة monolayers التجويف البريتوني. وتستبعد الخلايا الظهارية من تحت كروي سرطان المبيض المرفقة، والسماح للالأجسام الشبه الكروية للوصول إلى الغشاء القاعدي الأساسي. فيلم سرطان المبيض 1. الإنبثاث. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3888/Movie_1_Lower_Quality.mp4">انقر هنا لعرض الفيلم</a> . <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3888/3888fig2.jpg" /> الشكل 2. </strأونج&gt; خط الخلايا الظهارية سطح النسيج البريتوني الإنسان ومستبعدون من عملية زرع المبيض تحت الخلايا السرطانية. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/3888/3888fig3.jpg" /> الشكل 3. الظهارية الفحص التخليص. وتتشكل الأجسام الشبه الكروية سرطان المبيض بواسطة احتضان 100 طلب تقديم العروض في التعبير عن خلايا سرطان المبيض لكل بئر في بولي HEMA مطلي 96 جولة جيدا قاع طبق ثقافة في 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة. بولي HEMA يمنع الخلايا من الالتصاق على طبق ثقافة، والسماح للخلايا البقاء في التعليق والالتزام بعضها البعض لتشكيل كتلة واحدة لكل بئر. وتعد الخلايا الظهارية monolayers بواسطة الطلاء 6x10 5 خلايا الظهارية لكل بئر في فبرونيكتين المغلفة 6 ماتيك طبق بشكل جيد واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة. ثم يتم نقل الأجسام الشبه الكروية على طبق ماتيك مع أحادي الطبقة الظهارية والتقط السكان الخلية 2 كل 10 دقائق لمدة 8 ساعات باستخدام TI-E نيكون أناnverted الميكانيكية Widefield الإسفار الوقت الفاصل بين المجهر والبرمجيات عناصر. فيلم 2. الظهارية الفحص التخليص. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3888/Movie_2_lower_quality.mp4">انقر هنا لعرض الفيلم</a> . <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/3888/3888fig4.jpg" /> الشكل 4. التوهين من التعبير 1 في تالين OVCA433 الأجسام الشبه الكروية الظهارية يقلل قدرة التطهير. وسمح OVCA433 الأجسام الشبه الكروية (الحمراء) مع وبدون التعبير الموهن من تالين 1 إلى نعلق على وغزو إلى أحادي الطبقة الظهارية 1 ZT (الخضراء). والتقط سكان الخلية 2 كل 10 دقائق لمدة 8 ساعات باستخدام TI-E نيكون مقلوب الميكانيكية Widefield الإسفار الوقت الفاصل بين المجهر والبرمجيات العناصر. ويبين الرسم البياني أن تالين 1 توهينانخفاضات كبيرة في تخليص الخلية الظهارية (مؤامرة Quantile مع أشرطة خضراء على وسائل). فيلم 3. التحكم OVCA433 الأجسام الشبه الكروية (الحمراء) في غزو أحادي الطبقة الظهارية (الخضراء). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3888/Movie_3.mov">انقر هنا لعرض الفيلم</a> . فيلم 4. التوهين من التعبير 1 في تالين OVCA433 الأجسام الشبه الكروية (الحمراء) يقلل الظهارية (الخضراء) قدرة التطهير. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3888/Movie_4.mov">انقر هنا لعرض الفيلم</a> .

<ol>
	<li>Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> CA Cancer J. Clin. 59, 225-249 (2009).</li><li>Ries, L. G., Melbert, D., Krapcho, M., Stinchcomb, D. G., Howlader, N., Horner, M. J., Mariotto, A., Miller, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SEER Cancer Statistics Review, 1975-2005. , (2007).</li><li>Burleson, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+carcinoma+ascites+spheroids+adhere+to+extracellular+matrix+components+and+mesothelial+cell+monolayers.">Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers.</a> Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).</li><li>Birbeck, M. S., Wheatley, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Electron+Microscopic+Study+of+the+Invasion+of+Ascites+Tumor+Cells+into+the+Abdominal+Wall.">An Electron Microscopic Study of the Invasion of Ascites Tumor Cells into the Abdominal Wall.</a> Cancer Res. 25, 490-497 (1965).</li><li>Witz, C. A., Monotoya-Rodriguez, I. A., Schenken, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+explants+of+peritoneum+and+endometrium:+a+novel+model+of+the+early+endometriosis+lesion.">Whole explants of peritoneum and endometrium: a novel model of the early endometriosis lesion.</a> Fertil. Steril. 71, 56-60 (1999).</li><li>Zhang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+and+growth+patterns+of+human+peritoneal+mesothelial+cells:+comparison+between+advanced+epithelial+ovarian+cancer+and+non-ovarian+cancer+sources.">Characteristics and growth patterns of human peritoneal mesothelial cells: comparison between advanced epithelial ovarian cancer and non-ovarian cancer sources.</a> J. Soc. Gynecol. Investig. 6, 333-340 (1999).</li><li>Kenny, H. A., Nieman, K. M., Mitra, A. K., Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+First+Line+of+Intra-abdominal+Metastatic+Attack:+Breaching+the+Mesothelial+Cell+Layer.">The First Line of Intra-abdominal Metastatic Attack: Breaching the Mesothelial Cell Layer.</a> Cancer Discovery. 1, 100-102 (2011).</li><li>Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+human+ovarian+tumor+cells+with+human+mesothelial+cells+grown+on+extracellular+matrix.+An+in+vitro+model+system+for+studying+tumor+cell+adhesion+and+invasion.">Interactions of human ovarian tumor cells with human mesothelial cells grown on extracellular matrix. An in vitro model system for studying tumor cell adhesion and invasion.</a> Exp. Cell. Res. 160, 499-513 (1985).</li><li>Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+novel+3D+culture+model+to+elucidate+the+role+of+mesothelial+cells,+fibroblasts+and+extra-cellular+matrices+on+adhesion+and+invasion+of+ovarian+cancer+cells+to+the+omentum.">Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells to the omentum.</a> Int. J. Cancer. 121, 1463-1472 (2007).</li><li>Ksiazek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescent+peritoneal+mesothelial+cells+promote+ovarian+cancer+cell+adhesion:+the+role+of+oxidative+stress-induced+fibronectin.">Senescent peritoneal mesothelial cells promote ovarian cancer cell adhesion: the role of oxidative stress-induced fibronectin.</a> Am. J. Pathol. 174, 1230-1240 (2009).</li><li>Burleson, K. M., Boente, M. P., Pambuccian, S. E., Skubitz, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disaggregation+and+invasion+of+ovarian+carcinoma+ascites+spheroids.">Disaggregation and invasion of ovarian carcinoma ascites spheroids.</a> J. Transl. Med. 4, 6-6 (2006).</li><li>Heyman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitronectin+and+its+receptors+partly+mediate+adhesion+of+ovarian+cancer+cells+to+peritoneal+mesothelium+in+vitro.">Vitronectin and its receptors partly mediate adhesion of ovarian cancer cells to peritoneal mesothelium in vitro.</a> Tumour. Biol. 29, 231-244 (2008).</li><li>Heyman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesothelial+vitronectin+stimulates+migration+of+ovarian+cancer+cells.">Mesothelial vitronectin stimulates migration of ovarian cancer cells.</a> Cell. Biol. Int. 34, 493-502 .</li><li>Lessan, K., Aguiar, D. J., Oegema, T., Siebenson, L., Skubitz, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44+and+beta1+integrin+mediate+ovarian+carcinoma+cell+adhesion+to+peritoneal+mesothelial+cells.">CD44 and beta1 integrin mediate ovarian carcinoma cell adhesion to peritoneal mesothelial cells.</a> Am. J. Pathol. 154, 1525-1537 (1999).</li><li>Leroy-Dudal, J., Heyman, L., Gauduchon, P., Carreiras, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+of+human+ovarian+adenocarcinoma+IGROV1+cells+to+endothelial+cells+is+partly+mediated+by+the+alphav+integrins-vitronectin+adhesive+system+and+induces+an+alteration+of+endothelial+integrity.">Adhesion of human ovarian adenocarcinoma IGROV1 cells to endothelial cells is partly mediated by the alphav integrins-vitronectin adhesive system and induces an alteration of endothelial integrity.</a> Cell. Biol. Int. 29, 482-488 (2005).</li><li>Leroy-Dudal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmigration+of+human+ovarian+adenocarcinoma+cells+through+endothelial+extracellular+matrix+involves+alphav+integrins+and+the+participation+of+MMP2.">Transmigration of human ovarian adenocarcinoma cells through endothelial extracellular matrix involves alphav integrins and the participation of MMP2.</a> Int. J. Cancer. 114, 531-543 (2005).</li><li>Iwanicki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+spheroids+use+myosin-generated+force+to+clear+the+mesothelium.">Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium.</a> Cancer Discovery. 1, 144-157 (2011).</li><li>Folkman, J., Moscona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cell+shape+in+growth+control.">Role of cell shape in growth control.</a> Nature. 273, 345-349 (1978).</li><li>Gregoire, L., Munkarah, A., Rabah, R., Morris, R. T., Lancaster, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+culture+of+human+ovarian+surface+epithelial+cells:+a+potential+model+for+ovarian+carcinogenesis.">Organotypic culture of human ovarian surface epithelial cells: a potential model for ovarian carcinogenesis.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 34, 636-639 (1998).</li><li>Roberts, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+molecular+and+cellular+events+during+neoplastic+progression:+a+mouse+syngeneic+ovarian+cancer+model.">Sequential molecular and cellular events during neoplastic progression: a mouse syngeneic ovarian cancer model.</a> Neoplasia. 7, 944-956 (2005).</li><li>Okada, T., Okuno, H., Mitsui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vitro+assay+system+for+transendothelial+tumor+cell+invasion:+significance+of+E-selectin+and+alpha+3+integrin+in+the+transendothelial+invasion+by+HT1080+fibrosarcoma+cells.">A novel in vitro assay system for transendothelial tumor cell invasion: significance of E-selectin and alpha 3 integrin in the transendothelial invasion by HT1080 fibrosarcoma cells.</a> Clin. Exp. Metastasis. 12, 305-314 (1994).</li><li>Zervantonakis, I. K., Kothapalli, C. R., Chung, S., Sudo, R., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+studying+heterotypic+cell-cell+interactions+and+tissue+specimen+cultures+under+controlled+microenvironments.">Microfluidic devices for studying heterotypic cell-cell interactions and tissue specimen cultures under controlled microenvironments.</a> Biomicrofluidics. 5, 13406-1310 (2011).</li><li>Brandt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D-extravasation+model+--+selection+of+highly+motile+and+metastatic+cancer+cells.">3D-extravasation model -- selection of highly motile and metastatic cancer cells.</a> Semin. Cancer Biol. 15, 387-395 (2005).</li><li>Condeelis, J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+cell+movement+in+tumours.">Intravital imaging of cell movement in tumours.</a> Nat. Rev. Cancer. 3, 921-930 (2003).</li><li>Dai, J., Ting-Beall, H. P., Hochmuth, R. M., Sheetz, M. P., Titus, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+I+contributes+to+the+generation+of+resting+cortical+tension.">Myosin I contributes to the generation of resting cortical tension.</a> Biophys. J. 77, 1168-1176 (1999).</li><li>Laferriere, J., Houle, F., Taher, M. M., Valerie, K., Huot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transendothelial+migration+of+colon+carcinoma+cells+requires+expression+of+E-selectin+by+endothelial+cells+and+activation+of+stress-activated+protein+kinase-2+(SAPK2/p38)+in+the+tumor+cells.">Transendothelial migration of colon carcinoma cells requires expression of E-selectin by endothelial cells and activation of stress-activated protein kinase-2 (SAPK2/p38) in the tumor cells.</a> J. Biol. Chem. 276, 33762-33772 (2001).</li><li>Dong, C., Slattery, M. J., Rank, B. M., You, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+characterization+and+micromechanics+of+tumor+cell+chemotactic+protrusion,+locomotion,+and+extravasation.">In vitro characterization and micromechanics of tumor cell chemotactic protrusion, locomotion, and extravasation.</a> Ann. Biomed. Eng. 30, 344-355 (2002).</li></ol>

ليس لدينا ما يكشف.

في &quot;الفحص التخليص الظهارية&quot; المعروضة هنا يستخدم الوقت الفاصل بين المجهري لرصد تفاعلات الأجسام الشبه الكروية سرطان المبيض المتعددة الخلايا والخلايا الظهارية monolayers، في رائعة من التفصيل المكاني والزماني. سابقا، كانت عدة مجموعات تستخدم 8-14 المقايسات نقطة ال...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> الكاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> OVCA433 خلايا سرطان المبيض </td><td></td><td></td><td> هدية من الدكتور دنيس سلامون </td></tr><tr><td> ZT الخلايا الظهارية </td><td></td><td></td><td> هدية من الدكتور تان اينس </td></tr><tr><td> متوسط ​​199 </td><td> Gibco </td><td> 19950 </td><td></td></tr><tr><td> MCDB105 </td><td> خلية تطبيقات شركة </td><td> 117-500 </td><td></td></tr><tr><td> FBS حرارة المعطل </td><td> Gibco </td><td> 10082 </td><td></td></tr><tr><td> القلم بكتيريا </td><td> Gibco </td><td> 15070 </td><td></td></tr><tr><td> 96 لوحات جيدة </td><td> كورنينج Costar </td><td> 3799 </td><td></td></tr><tص&gt; <td> هيدروكسي إيثيل ميثاكريليت (بولي HEMA) </td><td> سيجما ألدريتش </td><td> 192066-25G </td><td> لبولي HEMA حل حل 6mg بولي HEMA مسحوق في 1ml من EtOH 95٪ </td></tr><tr><td> EtOH </td><td> Pharmco-aaper </td><td> 111ACS200 </td><td> تمييع إلى 95٪ في DH 2 0 </td></tr><tr><td> خلية ثقافة غطاء محرك السيارة </td><td> Nuaire </td><td> NU-425-300 </td><td></td></tr><tr><td> نسيج الثقافة الحاضنة </td><td> الحرارية العلمية </td><td> 3110 </td><td></td></tr><tr><td> حاضنة للبولي HEMA لوحات </td><td> آلات Labline </td><td> الامبراطورية الثالث 305 </td><td></td></tr><tr><td> منضدية الطرد المركزي </td><td> هيراوس </td><td> 75003429/01 </td><td></td></tr><tr><td> 6 كذلك الزجاج قاع طبق </td><td> ماتيك كورب. </td><td> P06G-1.5-20-F </td><td></td></tr><tr><td> فبرونيكتين </td><td> سيغما </td><td> F1141-1MG </td><td></td></tr><tr><td> برنامج تلفزيوني </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Timelapse المجهر: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> مجهر </td><td> نيكون </td><td></td><td> TI-E بمحركات الإسفار معكوس الوقت الفاصل بين مجهر المتكاملة مع نظام التركيز مثالي </td></tr><tr><td> عدسة </td><td> نيكون </td><td></td><td> 20X-0.75 apeture العددية </td></tr><tr><td> الهالوجين transilluminator </td><td> نيكون </td><td></td><td> 0.52 NA مسافة العمل الطويلة مكثف </td></tr><tr><td> الإثارة وانبعاث مرشحات </td><td> صفاء مرشحات مرور واحد في السكن نيكون </td><td></td><td> GFP تحويلة 480/40، إم 525/50 RFP-mCherry تحويلة 575/50 إم 640/50 </td></tr><tr><td> أحال وEpifluoresce مسار الضوء </td><td> سوتر </tد&gt; <td></td><td> ذكي مصاريع </td></tr><tr><td> خطي ترميز مرحلة بمحركات </td><td> نيكون </td><td></td><td></td></tr><tr><td> كاميرا جهاز تبريد مشحونة، بالإضافة </td><td> هاماماتسو </td><td> ORCA-AG </td><td></td></tr><tr><td> مجهر غرفة حضانة مع تحكم في درجة الحرارة وثاني أكسيد الكربون 2 </td><td> مبنية خصيصا </td><td></td><td></td></tr><tr><td> اهتزاز العزلة طاولة </td><td> TMC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> شيكل، عناصر البرنامج </td><td> نيكون </td><td></td><td> الإصدار 3 </td></tr></tbody></table>

in vitro mesothelial clearance assay that models the early steps of ovarian cancer metastasis

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 percent of women with ovarian cancer develop new metastases, and the recurrence is often fatal2. It is, therefore, necessary to understand how secondary metastases arise in order to develop better treatments for intermediate and late stage ovarian cancer. Ovarian cancer metastasis occurs when malignant cells detach from the primary tumor site and disseminate throughout the peritoneal cavity. The disseminated cells can form multicellular clusters, or spheroids, that will either remain unattached, or implant onto organs within the peritoneal cavity3 (Figure 1, Movie 1). 
All of the organs within the peritoneal cavity are lined with a single, continuous, layer of mesothelial cells4-6 (Figure 2). However, mesothelial cells are absent from underneath peritoneal tumor masses, as revealed by electron micrograph studies of excised human tumor tissue sections3,5-7 (Figure 2). This suggests that mesothelial cells are excluded from underneath the tumor mass by an unknown process. 
Previous in vitro experiments demonstrated that primary ovarian cancer cells attach more efficiently to extracellular matrix than to mesothelial cells8, and more recent studies showed that primary peritoneal mesothelial cells actually provide a barrier to ovarian cancer cell adhesion and invasion (as compared to adhesion and invasion on substrates that were not covered with mesothelial cells)9,10. This would suggest that mesothelial cells act as a barrier against ovarian cancer metastasis. The cellular and molecular mechanisms by which ovarian cancer cells breach this barrier, and exclude the mesothelium have, until recently, remained unknown. 
Here we describe the methodology for an in vitro assay that models the interaction between ovarian cancer cell spheroids and mesothelial cells in vivo (Figure 3, Movie 2). Our protocol was adapted from previously described methods for analyzing ovarian tumor cell interactions with mesothelial monolayers8-16, and was first described in a report showing that ovarian tumor cells utilize an integrin &#x2013;dependent activation of myosin and traction force to promote the exclusion of the mesothelial cells from under a tumor spheroid17. This model takes advantage of time-lapse fluorescence microscopy to monitor the two cell populations in real time, providing spatial and temporal information on the interaction. The ovarian cancer cells express red fluorescent protein (RFP) while the mesothelial cells express green fluorescent protein (GFP). RFP-expressing ovarian cancer cell spheroids attach to the GFP-expressing mesothelial monolayer. The spheroids spread, invade, and force the mesothelial cells aside creating a hole in the monolayer. This hole is visualized as the negative space (black) in the GFP image. The area of the hole can then be measured to quantitatively analyze differences in clearance activity between control and experimental populations of ovarian cancer and/ or mesothelial cells. This assay requires only a small number of ovarian cancer cells (100 cells per spheroid X 20-30 spheroids per condition), so it is feasible to perform this assay using precious primary tumor cell samples. Furthermore, this assay can be easily adapted for high throughput screening.

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis at JoVE.com

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

الفحص تخليص الظهارية وصفها هنا يستفيد من خلايا fluorescently المسمى والوقت الفاصل بين الفحص المجهري لتصور فيديو وكميا قياس التفاعلات بين الأجسام الشبه الكروية سرطان المبيض المتعددة الخلايا الظهارية وmonolayers الخلية. طرازا هذا الفحص الخطوات في وقت مبكر من ورم خبيث سرطان المبيض.

في الفحص المختبري التخليص الظهارية النماذج أن الخطوات في وقت مبكر من الإنبثاث سرطان المبيض

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

in-vitro-mesothelial-clearance-assay-that-models-early-steps-ovarian

Research

JoVE Journal

Medicine

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

14.4K Views.  Harvard Medical School. الفحص تخليص الظهارية وصفها هنا يستفيد من خلايا fluorescently المسمى والوقت الفاصل بين الفحص المجهري لتصور فيديو وكميا قياس التفاعلات بين الأجسام الشبه الكروية سرطان المبيض المتعددة الخلايا الظهارية وmonolayers الخلية. طرازا هذا الفحص الخطوات في وقت مبكر من ورم خبيث سرطا?...

Video: In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Experimental Metastasis Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients. To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established using immunodeficient mice. This article delineates the procedures involved in this assay, including sample preparation, intravenous injection, and culturing cells from lung metastases. Briefly, a pre-determined number of human cancer cells were prepared in vitro and directly injected into the circulation of immunodeficient mice through their tail veins. A small number of cells survive the turbulence in the circulation and grow as metastases in internal organs, such as lung. The injected mice are dissected after a certain period. The tissue distribution of metastases is determined under a dissecting microscope. The number of metastases in a specific tissue is counted and it directly correlates with the metastatic ability of the injected cancer cells. The arisen metastases are isolated and cultured in vitro as cell lines, which often show enhanced metastatic abilities than the parental line when injected again into immunodeficient mice. These highly metastatic derivatives become useful tools for identifying genes or molecular pathways that regulate metastatic progression.

This article describes the procedures of an experimental metastasis assay that is used to determine the metastatic potential of human cancer cell lines.

الفحص التجريبي الإنبثاث

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients.  To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established ...

MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in real-time of cell:cell interactions. Our overall goal was to develop models that recapitulate the architecture of preinvasive breast lesions to study their progression to an invasive phenotype. Specifically, we developed models to analyze interactions among pre-malignant breast epithelial cell variants and other cell types of the tumor microenvironment that have been implicated in enhancing or reducing the progression of preinvasive breast epithelial cells to invasive ductal carcinomas. Other cell types studied to date are myoepithelial cells, fibroblasts, macrophages and blood and lymphatic microvascular endothelial cells. In addition to the MAME models, which are designed to recapitulate the cellular interactions within the breast during cancer progression, we have developed comparable models for the progression of prostate cancers. 
Here we illustrate the procedures for establishing the 3D cocultures along with the use of live-cell imaging and a functional proteolysis assay to follow the transition of cocultures of breast ductal carcinoma in situ (DCIS) cells and fibroblasts to an invasive phenotype over time, in this case over twenty-three days in culture. The MAME cocultures consist of multiple layers. Fibroblasts are embedded in the bottom layer of type I collagen. On that is placed a layer of reconstituted basement membrane (rBM) on which DCIS cells are seeded. A final top layer of 2% rBM is included and replenished with every change of media. To image proteolysis associated with the progression to an invasive phenotype, we use dye-quenched (DQ) fluorescent matrix proteins (DQ-collagen I mixed with the layer of collagen I and DQ-collagen IV mixed with the middle layer of rBM) and observe live cultures using confocal microscopy. Optical sections are captured, processed and reconstructed in 3D with Volocity visualization software. Over the course of 23 days in MAME cocultures, the DCIS cells proliferate and coalesce into large invasive structures. Fibroblasts migrate and become incorporated into these invasive structures. Fluorescent proteolytic fragments of the collagens are found in association with the surface of DCIS structures, intracellularly, and also dispersed throughout the surrounding matrix. Drugs that target proteolytic, chemokine/cytokine and kinase pathways or modifications in the cellular composition of the cocultures can reduce the invasiveness, suggesting that MAME models can be used as preclinical screens for novel therapeutic approaches.

We have developed 3D coculture models for live-cell imaging in real-time of interactions among breast tumor cells and other cells in their microenvironment that impact progression to an invasive phenotype. These models can serve as preclinical screens for drugs to target paracrine-induced proteolytic, chemokine/cytokine and kinase pathways implicated in invasiveness.

نماذج مامي لتصوير الخلايا الحية 4D من ورم: التفاعلات المكروية أن التقدم تأثير الخبيثة

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell proliferation in the bone marrow cavity as well as for interaction of tumor and bone cells resulting in local bone destruction. Our aim was to develop a model of experimental bone metastasis that allows in vivo assessment of angiogenesis in skeletal lesions using non-invasive imaging techniques.
For this purpose, we injected 105 MDA-MB-231 human breast cancer cells into the superficial epigastric artery, which precludes the growth of metastases in body areas other than the respective hind leg1. Following 25-30 days after tumor cell inoculation, site-specific bone metastases develop, restricted to the distal femur, proximal tibia and proximal fibula1. Morphological and functional aspects of angiogenesis can be investigated longitudinally in bone metastases using magnetic resonance imaging (MRI), volumetric computed tomography (VCT) and ultrasound (US).
MRI displays morphologic information on the soft tissue part of bone metastases that is initially confined to the bone marrow cavity and subsequently exceeds cortical bone while progressing. Using dynamic contrast-enhanced MRI (DCE-MRI) functional data including regional blood volume, perfusion and vessel permeability can be obtained and quantified2-4. Bone destruction is captured in high resolution using morphological VCT imaging. Complementary to MRI findings, osteolytic lesions can be located adjacent to sites of intramedullary tumor growth. After contrast agent application, VCT angiography reveals the macrovessel architecture in bone metastases in high resolution, and DCE-VCT enables insight in the microcirculation of these lesions5,6. US is applicable to assess morphological and functional features from skeletal lesions due to local osteolysis of cortical bone. Using B-mode and Doppler techniques, structure and perfusion of the soft tissue metastases can be evaluated, respectively. DCE-US allows for real-time imaging of vascularization in bone metastases after injection of microbubbles7.
In conclusion, in a model of site-specific breast cancer bone metastases multi-modal imaging techniques including MRI, VCT and US offer complementary information on morphology and functional parameters of angiogenesis in these skeletal lesions.

In the pathogenesis of bone metastasis, angiogenesis is a crucial process and therefore represents a target for imaging and therapy. Here, we present a rat model of site-specific breast cancer bone metastasis and describe strategies to non-invasively image angiogenesis in vivo using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound.

ومتعددة الوسائط التصوير من الأوعية الدموية في نموذج الفئران عاري من سرطان الثدي الإنبثاث العظام باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي، الحجمي التصوير المقطعي والموجات فوق الصوتية

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical treatments and improved platinum-based chemotherapies, there has been little improvement in EOC survival rates for more than four decades 1,2. Whilst stage I tumors have 5-year survival rates &gt;85%, survival rates for stage III/IV disease are &lt;40%. Thus, the high rates of mortality for EOC could be significantly decreased if tumors were detected at earlier, more treatable, stages 3-5. At present, the molecular genetic and biological basis of early stage disease development is poorly understood. More specifically, little is known about the role of the microenvironment during tumor initiation; but known risk factors for EOCs (e.g. age and parity) suggest that the microenvironment plays a key role in the early genesis of EOCs. We therefore developed three-dimensional heterotypic models of both the normal ovary and of early stage ovarian cancers. For the normal ovary, we co-cultured normal ovarian surface epithelial (IOSE) and normal stromal fibroblast (INOF)&nbsp;cells, immortalized by retrovrial transduction of the catalytic subunit of human telomerase holoenzyme (hTERT) to extend the lifespan of these cells in culture. To model the earliest stages of ovarian epithelial cell transformation, overexpression of the CMYC oncogene in IOSE cells, again co-cultured with INOF cells. These heterotypic models were used to investigate the effects of aging and senescence on the transformation and invasion of epithelial cells. Here we describe the methodological steps in development of these three-dimensional model; these methodologies aren't specific to the development of normal ovary and ovarian cancer tissues, and could be used to study other tissue types where stromal and epithelial cell interactions are a fundamental aspect of the tissue maintenance and disease development.

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

We describe methodologies for establishing in vitro heterotypic three-dimensional models comprising ovarian fibroblasts and normal ovarian surface or ovarian cancer epithelial cells. We discuss the use of these models to study stromal-epithelial interactions that occur during ovarian cancer development.

غيروي ثلاثي الأبعاد<em&gt; في المختبر</em&gt; نمذجة التفاعلات اللحمية-طلائي سرطان المبيض خلال بدء والتقدم

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical ...

Models of Bone Metastasis

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible for significant morbidity and mortality1. Thus, there is a significant need to understand the molecular mechanisms controlling the establishment, growth and activity of tumors in bone. Several in vivo models have been established to study these events and each has specific benefits and limitations. The most commonly used model utilizes intracardiac inoculation of tumor cells directly into the arterial blood supply of athymic (nude) BalbC mice. This procedure can be applied to many different tumor types (including PC-3 prostate cancer, lung carcinoma, and mouse mammary fat pad tumors); however, in this manuscript we will focus on the breast cancer model, MDA-MB-231. In this model we utilize a highly bone-selective clone, originally derived in Dr. Mundy's group in San Antonio2, that has since been transfected for GFP expression and re-cloned by our group3. This clone is a bone metastatic variant with a high rate of osteotropism and very little metastasis to lung, liver, or adrenal glands. While intracardiac injections are most commonly used for studies of bone metastasis2, in certain instances intratibial4 or mammary fat pad injections are more appropriate. Intracardiac injections are typically performed when using human tumor cells with the goal of monitoring later stages of metastasis, specifically the ability of cancer cells to arrest in bone, survive, proliferate, and establish tumors that develop into cancer-induced bone disease. Intratibial injections are performed if focusing on the relationship of cancer cells and bone after a tumor has metastasized to bone, which correlates roughly to established metastatic bone disease. Neither of these models recapitulates early steps in the metastatic process prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. If monitoring primary tumor growth or metastasis from the primary site to bone, then mammary fat pad inoculations are usually preferred; however, very few tumor cell lines will consistently metastasize to bone from the primary site, with 4T1 bone-preferential clones, a mouse mammary carcinoma, being the exception 5,6.
This manuscript details inoculation procedures and highlights key steps in post inoculation analyses. Specifically, it includes cell culture, tumor cell inoculation procedures for intracardiac and intratibial inoculations, as well as brief information regarding weekly monitoring by x-ray, fluorescence and histomorphometric analyses.

Animal models are frequently utilized to study cancer metastasis to bone. In this protocol we will describe two common methods of tumor inoculation for bone metastasis studies and briefly describe some of the analyses utilized to monitor and quantify these models.

نماذج من الانبثاث العظام

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

على الفئران نموذج مثلي من سرطان البروستاتا البشرية الانبثاث

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

تقييم سرطان المبيض كروي مرفق وغزو الخلايا الظهارية في الوقت الحقيقي

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent &#8216;floater&#8217; cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

في التخصيب في المختبر من خلايا سرطان المبيض-الشروع ورم

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor ...

Quantitation of Intra-peritoneal Ovarian Cancer Metastasis

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States. Mortality is due to diagnosis of 75% of women with late stage disease, when metastasis is already present. EOC is characterized by diffuse and widely disseminated intra-peritoneal metastasis. Cells shed from the primary tumor anchor in the mesothelium that lines the peritoneal cavity as well as in the omentum, resulting in multi-focal metastasis, often in the presence of peritoneal ascites. Efforts in our laboratory are directed at a more detailed understanding of factors that regulate EOC metastatic success. However, quantifying metastatic tumor burden represents a significant technical challenge due to the large number, small size and broad distribution of lesions throughout the peritoneum. Herein we describe a method for analysis of EOC metastasis using cells labeled with red fluorescent protein (RFP) coupled with in vivo multispectral imaging. Following intra-peritoneal injection of RFP-labelled tumor cells, mice are imaged weekly until time of sacrifice. At this time, the peritoneal cavity is surgically exposed and organs are imaged in situ. Dissected organs are then placed on a labeled transparent template and imaged ex vivo. Removal of tissue auto-fluorescence during image processing using multispectral unmixing enables accurate quantitation of relative tumor burden. This method has utility in a variety of applications including therapeutic studies to evaluate compounds that may inhibit metastasis and thereby improve overall survival.

Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.

الكميات من البينية البريتوني ورم خبيث سرطان المبيض

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States.  Mortality is due to diagnosis of 75% of ...

Modeling the Early Steps of Ovarian Cancer Dissemination in an Organotypic Culture of the Human Peritoneal Cavity

The pattern of ovarian cancer metastasis is markedly different from that of most other epithelial tumors, because it rarely spreads hematogenously. Instead, ovarian cancer cells exfoliated from the primary tumor are carried by peritoneal fluid to metastatic sites within the peritoneal cavity. These sites, most notably the abdominal peritoneum and omentum, are organs covered by a mesothelium-lined surface. To investigate the processes of ovarian cancer dissemination, we assembled a complex three-dimensional culture system that reconstructs the lining of the peritoneal cavity in vitro. Primary human fibroblasts and mesothelial cells were isolated from human omentum. The fibroblasts were then mixed with extracellular matrix and covered with a layer of the primary human mesothelial cells to mimic the peritoneal and omental surfaces encountered by metastasizing ovarian cancer cells. The resulting organotypic model is, as shown, used to examine the early steps of ovarian cancer dissemination, including cancer cell adhesion, invasion, and proliferation. This model has been used in a number of studies to investigate the role of the microenvironment (cellular and acellular) in early ovarian cancer dissemination. It has also been successfully adapted to high throughput screening and used to identify and test inhibitors of ovarian cancer metastasis.

Here, we present a protocol to construct a three-dimensional in vitro model of the lining of the peritoneal cavity, composed of primary human mesothelial cells and fibroblasts layered with extracellular matrix, as a tool to investigate ovarian cancer cell adhesion, invasion, and proliferation.

نمذجة خطوات المبكر عن سرطان المبيض نشر في الثقافة عضوي النمط من البريتوني تجويف الإنسان

The pattern of ovarian cancer metastasis is markedly different from that of most other epithelial tumors, because it rarely spreads hematogenously. ...