وأيد هذا العمل من قبل المعهد الكندي للبحوث الصحية. وقد تم تمويل CSC زمالة ما بعد الدكتوراه من من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا. FD هو المستوى الثاني للبحوث كندا الرئاسة.

<html> وعموما عملية إعادة إعماره عملية إعادة خلط يبدأ الغشاء سقالة البروتين (MSP) مع مجمع تنقية 2 MalFGK في وجود المنظفات الفوسفاتية-solubilized. ويتبع الخطوة عن طريق إزالة البطيء للالمنظفات من مادة البوليسترين الممتزات دعا بيو الخرز أو Amberlite (الشكل 1). عملية التجميع التلقائي يحدث على الأرجح بسبب التفاعلات بين عديم الأقطاب الفوسفورية مسعور، 2 MalFGK معقدة وسطح البروتين ومتقابلة الزمر MSP. المنتج النهائي هو الجسيمات القرصية المصنوعة من اثنين من جزيئات التفاف حول المجمع MSP 2 MalFGK. يتم فصل الجزيئات من adducts والمجاميع المتطرفة بواسطة الطرد المركزي والتحليلية اللوني الحجم الاستبعاد. وتتميز الجزيئات التي كتبها الأصلي هلام الكهربائي ودينامية تشتت الضوء الطيفي. عنوان &quot;&gt; 1. إعداد الغشاء سقالة البروتين، MSP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> THE-MSP له الموسومة (الإصدار MSP1D1 1) وينتج من pMSP1D1 البلازميد في E. القولونية BL21 (DE3) التي يسببها في OD 600 ~ 0،5 مع 0.5 مم الآيزوبروبيل β-D-thiogalactopyranoside-1 لمدة 3 ساعة عند 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي عند 5000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية ومعلق في TSG10 العازلة التي تحتوي على 100 فلوريد phenylmethanesulfonyl ميكرومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> والخلايا هي lysed مع الصحافة الفرنسية (3X) عند 8،000 رطل وتتم إزالة المواد غير القابلة للذوبان بواسطة الطرد المركزي عند 5000 x ج لمدة 10 دقيقة في C. ° 4 يتم عزل جزء القابلة للذوبان التي تحتوي على MSP بواسطة الطرد المركزي المتطرفة في 125،000 x ج لمدة 45 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تنقيته من MSP من النيكل مخلبية اللوني باستخدام ~ 1.5 مل ني sepharose و HP في TSG10 العازلة. تغسل مع الملوثات بعيدا TSG10 العازلة التي تحتوي على 50 ملي الاميدازول. ومزال في MSP مع TSG10 العازلة التي تحتوي على 600 ممالاميدازول. ومدال البروتين النقي في TSG10 العازلة وتخزينها في -70 ° C عند تركيز بروتين 10-15 ملغ من ~ / مل. </li></ol> 2. إعداد مجمع 2 MalFGK <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ال 2 MalFGK المعقدة، له الموسومة في محطة سي من ذالك، ويعبر عن البلازميد من pBAD22-FGK في E. القولونية BL21 (DE3) والتي يسببها في OD 600 ~ 0،5 مع 0.2٪ L-أرابينوز لمدة 3 ساعة عند 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تحلل الخلايا والطرد المركزي كما في الخطوة 1.3، وبيليه معلق في الغشاء TSG20 العازلة عند تركيز النهائي من 5 ملغ / مل. وsolubilized المواد مع 1٪ ث / ت ن دوديسيل-β-maltopyranoside (DDM) لمدة 3 ساعة في 4 درجات مئوية مع الهز لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتم إزالة المواد غير القابلة للذوبان بواسطة الطرد المركزي المتطرفة كما في الخطوة 1.3 و طاف يحتوي على solubilized يتم جمع 2 MalFGK معقدة وتنقيته كما في الخطوة 1.4، ولكن من دون غسيل الكلى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ابعد من ذلكويتحقق عن طريق تنقية ص الكروماتوغرافيا الترشيح في المخزن المؤقت TSGD على HR 200 Superdex 10/300 في العمود معدل تدفق 0.5 مل / دقيقة. </li></ol> 3. إعداد من الدهون الفوسفاتية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وE. القولونية الليبيدات الكلية الذائبة في استخراج كلوروفورم يتم فصل إلى 1000 نانومول مأخوذة في أنابيب المسمار microfuge الغطاء. يبخر المذيب تحت تيار لطيف من النيتروجين وتجفيفها في ليلة وضحاها مزيد من فراغ مجفف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يذوب الدهون في الفيلم TS العازلة في تركيز نانومتر 5 انتهاء الوقت وvortexed بقوة وsonicated. سوف تظهر الدهون المذابة مبهمة قليلا بسبب الذوبان بهم في العام العازلة TS المائي، ولكنها ينبغي أن تظل في التعليق. يضاف إلى DDM تركيز النهائي من 0.5٪ (~ 10 ملم)، حيث يصبح الحل واضح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم وضع الخليط الدهون في حمام مائي والنبض sonicated لمدة 5 ثوانى مرات عن 5 ~. يتم تخزين الدهون في الخليط C ° 4 لأقصى 1 ويك. </li></ol> 4. إعداد الحيوية الخرز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حوالي 10-15 مل (حجم الجافة) يتم وضع الخرز الحيوية في أنبوب 50 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل حبات تباعا مع 50 مل من الميثانول بنسبة 100٪، والإيثانول 95٪، milliQ H O 2، وأخيرا TS العازلة (مرتين لكل منهما). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تخزين حبات غسلها عند 4 ° C ~ 10 في المخزن المؤقت TS مل. </li></ol> 5. Nanodisc إعادة إعماره <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتضعف MSP في المخزن المؤقت TSGD في تركيز النهائي من ملغ 7 ~ / مل (~ 0.3 مم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم خلط ~ 2 نانومول مجمع تنقية 2 MalFGK في البروتين: MSP: نسبة الدهون من 1:3:60 أو 1:3:400 في المخزن المؤقت TSGD. تركيز النهائي هو 6 ميكرومتر MalFGK 2 و 18 ميكرومتر والدهون MSP ميكرومتر 360 (1:3:60) أو 2.4 ملي الدهون (1:3:400). الحجم النهائي هو 300 ميكرولتر. تركيز DDM النهائي هو 0.08٪ (~ 1.6 مم). تركيز النهائي من الجلسرين يعتمد على مقدار من الدهون المضافة ولكن لا يزال حوالي 5-10٪ V / V. </lط&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> ~ تم إضافة 50 ميكرولتر من الحيوية حبة التعليق على أنبوب وحضنت الخليط بين عشية وضحاها على طاولة هزاز في C. ° 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وsedimented حبات عن طريق الجاذبية وpipetted الحل من خلال معلومات سرية لتجنب ضيق بقدر الحيوية الخرز ممكن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم إزالة رواسب كبيرة بواسطة الطرد المركزي المتطرفة في 100،000 x ج لمدة 20 دقيقة. وتنقيته من الأقراص الكروماتوغرافيا الترشيح كما في الخطوة 2.4 في TSG10 العازلة. يتم تجميع الكسور التي تحتوي على أقراص وينبغي أن يكون قسامة إعادة حقن على عمود هلام نفس الترشيح لاختبار استقرار الإعداد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن للأقراص تنقية تخزينها في -70 ° C لفترة طويلة من الزمن. بعد ذوبان الجليد على ذلك، ينبغي إخضاع أقراص لالطرد المركزي المتطرفة كما في الخطوة 5.5 إلى إزالة رواسب المحتملة. ينبغي تحليل وقسامة من الترشيح هلام اللوني لضمان تجميع كبيرة أو هطول الأمطار لم يحدث خلال الذوبانالعملية. </li></ol> 6. الأم جل الكهربائي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم تحليل من 1 ميكرومتر nanodiscs (حوالي 0.2 ملغ / مل) في الصفحة الأصلية 6، 7 (تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.8، 4-12٪) لتقييم جودة إعادة (الشكل 3A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كما يتم تقييم الربط من الذكور (1 ميكرومتر) إلى MalFGK 2-معقدة تشكيلها في nanodiscs من قبل الناطقين PAGE (الشكل 3A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الكهربائي، اتسخت لهلام مع الأزرق لمدة 10 دقيقة Coomassie، وdestained للساعة 1 ~. </li></ol> 7. ديناميكية تشتت الضوء (DLS) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتنقيته من Nanodiscs الكروماتوغرافيا الترشيح كما في الخطوة 2.4 في TSG10 العازلة باستخدام إلي 200 Superdex HR 10/300 في العمود معدل تدفق 0.1 مل / دقيقة. يتم تجميع الكسور التي تحتوي على nanodiscs وركزوا على 10 ملغ ~ / مل مع مرشح Amicon الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تصفية العينة مرتين (0.22 ميكرون فلتر) قبل التحليل باستخدام DLSوnanostar DynaPro صك (وايت التكنولوجيا) في (أ) 1 ميكرولتر حجم كوفيت الكوارتز الداخلية. تم تجهيز البيانات باستخدام برنامج DYNAMICS (وايت التكنولوجيا) لتقدير القطر والوزن الجزيئي للجزيئات. </li></ol> 8. قياسات أتباز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تحديد النشاط أتباز من MalFGK 2-المعاد nanodiscs باستخدام مقايسة اللونية 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم خلط 1 ميكرومتر من الأقراص تنقية و 1 ملي ATP مع كميات متزايدة من C ذكر وحضنت عند 37 درجة لمدة 20 دقيقة. يتم قياس الافراج عن الفوسفات غير العضوي في 660 نيوتن متر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتم مقارنة كمية الفوسفات المفرج عنهم إلى منحنى القياسية ولدت مع الفوسفور حل قياسي. </li></ol> 9. ممثل النتائج وتنقيته من nanodiscs بواسطة الكروماتوغرافيا الترشيح (الشكل 2A، اليسار). وكروماتوغرام يدل على أن الغالبية العظمى من د المعادISCS (أسود التتبع) أزل باعتبارها ذروة واحدة، في حين أن الأقراص المصنوعة من الدهون الزائدة (أحمر التتبع) أزل في حجم الفراغ ونتيجة لسلسلة من القمم واسعة. ويتم تحليل مزيد من نوعية nanodiscs من الأم الكهربائي للهلام وديناميكية تشتت الضوء الطيفي (DLS). أقراص المعاد بشكل صحيح كما ترحيل فرقة حادة على هلام في حين أن أعيد تشكيلها في وجود فائض من الدهون وترحيل مسحة (2A الشكل، والحق). تحليل DLS يدل على أن السكان القرص متجانسة ذات قطر متوسط ​​قدره 11.4 نانومتر (الشكل 2B). الأقراص المعاد يكون لها الوزن الجزيئي واضح من 215 كيلو دالتون على أساس تقريب DLS. عرض على نطاق واسع في تشكيل العينات وجود الدهون الزائدة حول كعبرة 100 نانومتر، والتي هي نموذجية لغير متجانسة العينات. ويتم تقييم نوعية معقدة من 2 MalFGK الأصلية جل الكهربائي ونشاطها من خلال أتبازقياسات (الشكل 3). والمالتوز ذكر بروتين ملزمة يتحد مع تقارب عالية لنقل 2 MalFGK 9 و 10. استخدام غير يبدل طبيعة الكهربائي للهلام، فمن الممكن الكشف عن مجمع بين الذكر وMalFGK 2 (الشكل 3A). يظهر تحفيز النشاط أتباز ذالك 2 من الذكور في الشكل 3B. <img src="/files/ftp_upload/3910/3910fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1. مخطط نموذجي لبروتوكول إعادة. <img src="/files/ftp_upload/3910/3910fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2. مراقبة جودة إعداد nanodisc. A. تشكيل هلام تحليل الترشيح (200 Superdex HR 10 / عمود 300) من نسبة الدهون في nanodiscs منخفضة (1/3/60؛ التتبع أسود) أو ارتفاع نسبة الدهون (1/3/400؛ التتبع الحمراء). الأم الكهربائي للهلام لإعداد القرص نفسه. موليشار إلى علامات الوزن ecular في كيلو دالتون. B. تشتت الضوء الحيوي تحليل إعداد القرص نفسه. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3910/3910fig2large.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية</a> . <img src="/files/ftp_upload/3910/3910fig3.jpg" alt="الشكل 3"/> الشكل 3. تحليل MalFGK 2-nanodisc الجسيمات. A. هلام تحليل التحول من ذكر حضنت مع كميات متزايدة من الجزيئات 2-nanodisc MalFGK. B. ATPase النشاط من MalFGK 2-nanodisc جزيئات بوصفها وظيفة من تركيز ذكر.

<ol>
	<li>Denisov, I. G., Ginkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+self-assembly+of+monodisperse+phospholipid+bilayer+Nanodiscs+with+controlled+size.">Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 3477-3487 (2004).</li><li>Boldog, T., Grimme, S., Li, M., Sligar, S. G., Hazelbauer, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+separate+chemoreceptor+oligomeric+states+and+reveal+their+signaling+properties.">Nanodiscs separate chemoreceptor oligomeric states and reveal their signaling properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 11509-11514 (2006).</li><li>Bass, B. J., Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homotropic+cooperativity+of+monomeric+cytochrome+P450+3A4+in+a+nanoscale+native+bilayer+environment.">Homotropic cooperativity of monomeric cytochrome P450 3A4 in a nanoscale native bilayer environment.</a> J. Biol. Chem. 282, 7066-7076 (2007).</li><li>Alami, M., Dalal, K., Lelj-Garolla, B., Sligar, S. G., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+unravel+the+interaction+between+the+SecYEG+channel+and+its+cytosolic+partner+SecA.">Nanodiscs unravel the interaction between the SecYEG channel and its cytosolic partner SecA.</a> EMBO J. 26, 1995-2004 (2007).</li><li>Mi, L. -. Z., Grey, M. J., Nishida, N., Walz, T., Lu, C., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+structural+stability+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+in+detergent+micelles+and+phospholipid+nanodiscs.">Functional and structural stability of the epidermal growth factor receptor in detergent micelles and phospholipid nanodiscs.</a> Biochemistry. 47, 10314-10323 (2008).</li><li>Sch&#228;gger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis.">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal. Biochem. 217, 220-230 (1994).</li><li>Dalal, K., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+SecY+translocon+in+Nanodiscs.">Reconstitution of the SecY translocon in Nanodiscs.</a> Methods Mol. Biol. 619, 145-156 (2010).</li><li>Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+assay+for+nanomole+amounts+of+inorganic+phosphate.">An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate.</a> Anal. Biochem. 100, 95-97 (1979).</li><li>Davidson, A. L., Dassa, E., Orelle, C., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+evolution+of+bacterial+ATP-binding+cassette+systems.">Structure, function and evolution of bacterial ATP-binding cassette systems.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 72, 317-364 (2008).</li><li>Bordignon, E., Grote, M., Schneider, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maltose+ATP-binding+cassette+transporter+in+the+21st+century-towards+a+structural+dynamic+perspective+on+its+mode+of+action.">The maltose ATP-binding cassette transporter in the 21st century-towards a structural dynamic perspective on its mode of action.</a> Mol. Microbiol. 77, 1354-1366 (2010).</li><li>Alvarez, F. J., Orelle, C., Davidson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+reconstitution+of+an+ABC+transporter+for+use+in+electron+paramagnetic+resonance+spectroscopy.">Functional reconstitution of an ABC transporter for use in electron paramagnetic resonance spectroscopy.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 9513-9515 (2010).</li><li>Ritchie, T. K., Grinkova, Y. V., Bayburt, T. H., Denisov, I. G., Zolnerciks, J. K., Atkins, W. M., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+in+phospholipid+bilayer+Nanodiscs.">Reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayer Nanodiscs.</a> Methods Enzymol. 464, 211-231 (2009).</li><li>Gl&#252;ck, J. M., Koenig, B. W., Willbold, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+allow+the+use+of+integral+membrane+proteins+as+analytes+in+surface+plasmon+resonance+studies.">Nanodiscs allow the use of integral membrane proteins as analytes in surface plasmon resonance studies.</a> Anal. Biochem. 408, 46-52 (2011).</li><li>Wan, C. -. P. L., Chiu, M. H., Wu, X., Lee, S. K., Prenner, E. J., Weers, P. M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein-induced+conversion+of+phosphatidylcholine+bilayer+vesicles+into+nanodisks.">Apolipoprotein-induced conversion of phosphatidylcholine bilayer vesicles into nanodisks.</a> Biochim. Biophys. Acta (BBA). 1808, 606-613 (2011).</li><li>Nath, A., Trexler, A. J., Koo, P. K., Miranker, A. D., Atkins, W. M., Rhoades, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+fluorescence+spectroscopy+using+phospholipid+bilayer+Nanodiscs.">Single-molecule fluorescence spectroscopy using phospholipid bilayer Nanodiscs.</a> Methods Enzymol. 472, 89-117 (2010).</li><li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochromes+P450+in+Nanodiscs.">Cytochromes P450 in Nanodiscs.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1814, 223-229 (2011).</li><li>Zhang, X. X., Chan, C. S., Bao, H., Fang, Y., Foster, L. J., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+and+SILAC-based+mass+spectrometry+to+identify+a+membrane+protein+interactome.">Nanodiscs and SILAC-based mass spectrometry to identify a membrane protein interactome.</a> J. Proteome Res. , (2011).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وصفنا إجراء بسيط لإعادة تشكيل المالتوز في نقل nanodiscs. الناقل هو أتباز نشطة ويمكن أن يعاد التفاعل مع شريك ذكر ملزمة للذوبان (الشكل 3). إعادة تشكيل ناجحة للنقل في nanodiscs فتح الطريق لتحليل إضافية البيوفيزيائية والكيميائية الحيوية. سوف تكون ذات أهمية خاصة في التحلي?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> Amicon الترا-4 50K تصفية الطرد المركزي </td><td> ميليبور </td><td> UFC805008 </td><td> اتبع بروتوكول الشركة المصنعة للاستخدام السليم </td></tr><tr><td> الحيوي الخرز SM-2 الممتزات </td><td> بيو راد </td><td> 152-3920 </td><td></td></tr><tr><td> كولاي E. الدهون الكلية </td><td> افانتي الدهون القطبية </td><td> 100500C </td><td> المذاب في الكلوروفورم، والتعامل مع يتناسب مع مذيب عضوي </td></tr><tr><td> ني sepharose و HP الراتنج </td><td> GE للرعاية الصحية </td><td> 17-5268-01 </td><td></td></tr><tr><td> الفوسفور القياسية الحل </td><td>سيغما الدريخ </td><td> P3869 </td><td></td></tr><tr><td> pMSP1D1 </td><td> Addgene </td><td> 20061 </td><td></td></tr><tr><td> Superdex 200 HR 10/300 </td><td> GE للرعاية الصحية </td><td> 17-5172-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> الجدول الكواشف I. محددة. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم </td><td> تركيب </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> DDM الأسهم </td><td> 10٪ ث / ت DDM </td><td> resuspend في المياه وتخزينها في milliQ -20 ° C </td></tr><tr><td> 2 MalFGK الأسهم </td><td> 1-2 مغ / مل 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، pH7.9 100 ملي مول كلوريد الصوديوم 10٪ ت / ت الجلسرين 0.03٪ W / V DDM </td><td> المحل في -70 درجة مئوية بعد تنقيتها </td></tr><tr><td> MSP الأسهم </td><td> 10-15 ملغ / مل 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، pH7.9 100 ملي مول كلوريد الصوديوم 10٪ ت / ت الجلسرين </td><td> المحل في -70 درجة مئوية بعد تنقيتها في مأخوذة &lt;1 مل وتجنب الإفراط في تجميد / الذوبان دورات </td></tr><tr><td> فسفوليبيد الأسهم </td><td> 5 نانومتر E. القولونية مجموع الدهون 0.5٪ وزن / حجم (10 ملم) DDM 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.9 50 ملي كلوريد الصوديوم </td><td> متجر في C ° 4 ل 1 الاسبوع </td></tr><tr><td> TS العازلة </td><td> 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.9 50 ملي كلوريد الصوديوم </td><td> تخزين عند 4 ° C </td></tr><tr><td> TSG10 العازلة </td><td> 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، pH7.9 100 ملي مول كلوريد الصوديوم 10٪ ت / ت الجلسرين </td><td> تخزين عند 4 ° C </td></tr><tr><td> TSG20 العازلة </td><td> 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، pH8 100 ملي مول كلوريد الصوديوم 20٪ ت / ت الجلسرين </td><td> تخزين عند 4 ° C </td></tr><tr><td> TSGD العازلة </td><td> 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، pH7.9 100 ملي مول كلوريد الصوديوم 10٪ ت / ت الجلسرين 0.03٪ W / V DDM </td><td> متجر في C ° 4 و إضافة DDM قبل استخدام </td></tr><tr><td colspan="3"> الجدول الثاني. الحل صفات. </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

a step-by-step method for the reconstitution of an abc transporter into nanodisc lipid particles

وnanodisc هو الجسيمات قريصي (~ 10-12 نانومتر الكبيرة) أن البروتينات الغشاء فخ في قطعة صغيرة من طبقة ثنائية فسفوليبيد. وnanodisc هو خيارا جذابا بشكل خاص لدراسة البروتينات الغشاء، وخاصة في سياق يجند مستقبلات التفاعلات. رائدا في الطريقة التي Sligar ويقوم الزملاء على خصائص متقابلة الزمر من المهندسة عالية A-حلزونية سقالة البروتين المستمد من A1 ئي. وجوه مسعور من البروتين سقالة التفاعل مع سلاسل جانبية أسيل الدهنية من طبقة ثنائية المادة الدهنية في حين أن المناطق القطبية تواجه البيئة المائية. تحليل البروتينات الغشاء في nanodiscs لها مزايا هامة على الحويصلية لأن جزيئات صغيرة، متجانسة وللذوبان في الماء. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تطبيق أساليب الكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية التي عادة ما تحجز للبروتينات قابلة للذوبان، ومن جانبي الغشاء. في هذا البروتوكول البصرية، فإننا نقدم إعادة خطوة بخطوة من charac جيداterized نقل ABC البكتيرية، والذكور 2 MalFGK المعقدة. تشكيل القرص هو عملية التجميع الذاتي التي تعتمد على التفاعلات التي تحدث أثناء مسعور في الإزالة التدريجية للمواد التنظيف. نحن وصف الخطوات الأساسية ونسلط الضوء على أهمية اختيار الصحيح البروتين إلى الدهون نسبة للحد تشكيل المجاميع والجسيمات الأكبر حجما polydisperse الحويصلية مثل. نوعية بسيطة مثل اللوني يتحكم الترشيح هلام، هلام الكهربائي الأصلي وديناميكية تشتت الضوء الطيفي ضمان أنه تم تشكيل الأقراص بشكل صحيح.

Watch this Scientific Journal Video about A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles at JoVE.com

A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles

Nanodiscs هي جسيمات صغيرة القرصية التي تتضمن البروتينات الغشاء في قطعة صغيرة من طبقة ثنائية فسفوليبيد. نحن نقدم بروتوكول البصرية التي تظهر إدماج خطوة بخطوة من نقل MalFGK2 إلى القرص.

A أسلوب الخطوة بخطوة لإعادة تشكيل ناقلة الى جزيئات الدهون ABC Nanodisc

The nanodisc is a discoidal particle (~ 10-12 nm large) that trap membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. The nanodisc is a ...

a-step-step-method-for-reconstitution-an-abc-transporter-into

Research

JoVE Journal

Biology

25.3K Views.  University of British Columbia. Nanodiscs هي جسيمات صغيرة القرصية التي تتضمن البروتينات الغشاء في قطعة صغيرة من طبقة ثنائية فسفوليبيد. نحن نقدم بروتوكول البصرية التي تظهر إدماج خطوة بخطوة من نقل MalFGK2 إلى القرص.

Video: A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles

Expression, Detergent Solubilization, and Purification of a Membrane Transporter, the MexB Multidrug Resistance Protein

Multidrug resistance (MDR), the ability of a cancer cell or pathogen to be resistant to a wide range of structurally and functionally unrelated anti-cancer drugs or antibiotics, is a current serious problem in public health. This multidrug resistance is largely due to energy-dependent drug efflux pumps. The pumps expel anti-cancer drugs or antibiotics into the external medium, lowering their intracellular concentration below a toxic threshold. We are studying multidrug resistance in Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic bacterial pathogen that causes infections in patients with many types of injuries or illness, for example, burns or cystic fibrosis, and also in immuno-compromised cancer, dialysis, and transplantation patients. The major MDR efflux pumps in P. aeruginosa are tripartite complexes comprised of an inner membrane proton-drug antiporter (RND), an outer membrane channel (OMF), and a periplasmic linker protein (MFP) 1-8. The RND and OMF proteins are transmembrane proteins. Transmembrane proteins make up more than 30% of all proteins and are 65% of current drug targets. The hydrophobic transmembrane domains make the proteins insoluble in aqueous buffer. Before a transmembrane protein can be purified, it is necessary to find buffer conditions containing a mild detergent that enable the protein to be solubilized as a protein detergent complex (PDC) 9-11. In this example, we use an RND protein, the P. aeruginosa MexB transmembrane transporter, to demonstrate how to express a recombinant form of a transmembrane protein, solubilize it using detergents, and then purify the protein detergent complexes. This general method can be applied to the expression, purification, and solubilization of many other recombinantly expressed membrane proteins. The protein detergent complexes can later be used for biochemical or biophysical characterization including X-ray crystal structure determination or crosslinking studies.

In this protocol we demonstrate the expression, solubilization, and purification of a recombinantly expressed membrane protein, MexB, as a soluble protein detergent complex. MexB is a multidrug resistance membrane transporter from the opportunistic bacterial pathogen Pseudomonas aeruginosa.

التعبير ، Solubilization منظفات ، وتنقية من الناقل الأغشية ، ومقاومة الأدوية المتعددة MexB البروتين

Multidrug resistance (MDR), the ability of a cancer cell or pathogen to be resistant to a wide range of structurally and functionally unrelated ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

الكروماتوجراف الدهون تقارب الحويصلة بوساطة الفرز المغناطيسي باستخدام خلية المنشط (LIMACS) : طريقة جديدة لتحليل البروتين الدهني التفاعل

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

إعادة إعماره في المختبر من أحدث T. castaneum تيلوميراز

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of plant leaves or vertebrate lungs further difficulties arise from multiple transitions in refractive index between cellular components, between cells and airspaces and between the biological tissue and the rest of the optical system. Moreover, refractive index mismatches lead to attenuation of fluorophore excitation and signal emission in fluorescence microscopy. We describe here the application of the perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), as an infiltrative imaging medium which optically improves laser scanning confocal microscopy (LSCM) sample imaging at depth, without resorting to damaging increases in laser power and has minimal physiological impact2. We describe the protocol for use of PFD with Arabidopsis thaliana leaf tissue, which is optically complex as a result of its structure (Figure 1). PFD has a number of attributes that make it suitable for this use3. The refractive index of PFD (1.313) is comparable with that of water (1.333) and is closer to that of cytosol (approx. 1.4) than air (1.000). In addition, PFD is readily available, non-fluorescent and is non-toxic. The low surface tension of PFD (19 dynes cm-1) is lower than that of water (72 dynes cm-1) and also below the limit (25 - 30 dyne cm-1) for stomatal penetration4, which allows it to flood the spongy mesophyll airspaces without the application of a potentially destructive vacuum or surfactant. Finally and crucially, PFD has a great capacity for dissolving CO2 and O2, which allows gas exchange to be maintained in the flooded tissue, thus minimizing the physiological impact on the sample. These properties have been used in various applications which include partial liquid breathing and lung inflation5,6, surgery7, artificial blood8, oxygenation of growth media9, and studies of ice crystal formation in plants10. Currently, it is common to mount tissue in water or aqueous buffer for live confocal imaging. We consider that the use of PFD as a mounting medium represents an improvement on existing practice and allows the simple preparation of live whole leaf samples for imaging.

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

We describe the use of perfluorodecalin as an infiltrative mounting medium. This is a simple method for improving depth of imaging in Arabidopsis thaliana leaf tissue with minimal physiological impact.

طريقة بسيطة للتصوير Arabidopsis يغادر طريق Perfluorodecalin كوسيط التصوير إختراقي

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined lipid composition. We are studying the lipid-dependent gating effects in a prototype voltage-gated potassium (Kv) channel, and have worked out detailed procedures to reconstitute the channels into different membrane systems. Our reconstitution procedures take consideration of both detergent-induced fusion of vesicles and the fusion of protein/detergent micelles with the lipid/detergent mixed micelles as well as the importance of reaching an equilibrium distribution of lipids among the protein/detergent/lipid and the detergent/lipid mixed micelles. Our data suggested that the insertion of the channels in the lipid vesicles is relatively random in orientations, and the reconstitution efficiency is so high that no detectable protein aggregates were seen in fractionation experiments. We have utilized the reconstituted channels to determine the conformational states of the channels in different lipids, record electrical activities of a small number of channels incorporated in planar lipid bilayers, screen for conformation-specific ligands from a phage-displayed peptide library, and support the growth of 2D crystals of the channels in membranes. The reconstitution procedures described here may be adapted for studying other membrane proteins in lipid bilayers, especially for the investigation of the lipid effects on the eukaryotic voltage-gated ion channels.

Procedures for complete reconstitution of a prototype voltage-gated potassium channel into lipid membranes are described. The reconstituted channels are suitable for biochemical assays, electrical recordings, ligand screening and electron crystallographic studies. These methods may have general applications to the structural and functional studies of other membrane proteins.

إعادة تشكيل قناة كيلو فولت في الأغشية الدهنية للدراسات الهيكلية والوظيفية

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow GUVs must be modified in order to form GUVs containing functional transmembrane proteins. This article describes two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation and gel-assisted swelling &#8212; to form GUVs containing the voltage-gated potassium channel, KvAP. In both methods, a solution of protein-containing small unilamellar vesicles is partially dehydrated to form a stack of membranes, which is then allowed to swell in a rehydration buffer. For the electroformation method, the film is deposited on platinum electrodes so that an AC field can be applied during film rehydration. In contrast, the gel-assisted swelling method uses an agarose gel substrate to enhance film rehydration. Both methods can produce GUVs in low (e.g., 5 mM) and physiological (e.g., 100 mM) salt concentrations. The resulting GUVs are characterized via fluorescence microscopy, and the function of reconstituted channels measured using the inside-out patch-clamp configuration. While swelling in the presence of an alternating electric field (electroformation) gives a high yield of defect-free GUVs, the gel-assisted swelling method produces a more homogeneous protein distribution and requires no special equipment.

The reconstitution of the transmembrane protein, KvAP, into giant unilamellar vesicles (GUVs) is demonstrated for two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation, and gel-assisted swelling. In both methods, small unilamellar vesicles containing the protein are fused together to form GUVs that can then be studied by fluorescence microscopy and patch-clamp electrophysiology.

إعادة تشكيل البروتين عبر الغشاء، وايون القناة بوابات الجهد، KvAP، إلى العملاق Unilamellar الحويصلات للفحص المجهري وتصحيح الدراسات المشبك

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used as manufacturing platforms for added-value products such as biopharmaceuticals. In both cases, liquid plant extracts may need to be clarified to remove particulates. Optimal clarification reduces the costs of filtration and centrifugation by increasing capacity and longevity. This can be achieved by introducing charged polymers known as flocculants, which cross-link dispersed particles to facilitate solid-liquid separation. There are no mechanistic flocculation models for complex mixtures such as plant extracts so empirical models are used instead. Here a design-of-experiments procedure is described that allows the rapid screening of different flocculants, optimizing the clarification of plant extracts and significantly reducing turbidity. The resulting predictive models allow the identification of robust process conditions and sets of polymers with complementary properties, e.g. effective flocculation in extracts with specific conductivities. The results presented for tobacco leaf extracts can easily be adapted to other plant species or tissues and will thus facilitate the development of more cost-effective downstream processes for commodities and plant-derived pharmaceuticals.

The design-of-experiments procedure presented here allows the evaluation of different flocculants in terms of their ability to aggregate dispersed particles in plant extracts, thus reducing turbidity and the costs of downstream processing.

إجراءات لتقييم كفاءة المرسب لإزالة فرقت الجسيمات من المستخلصات النباتية

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used ...

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

The Sleeping Beauty (SB) transposon is a non-viral integrating system with proven efficacy for gene transfer and functional genomics. To optimize the SB transposon machinery, a transcriptionally regulated hyperactive transposase (SB100X) and T2-based transposon are employed. Typically, the transposase and transposon are provided transiently by plasmid transfection and SB100X expression is driven by a constitutive promoter. Here, we describe an efficient method to deliver the SB components to human cells that are resistant to several physical and chemical transfection methods, to control SB100X expression and stably integrate a gene of interest (GOI) through a &#34;cut and paste&#34; SB mechanism. The expression of hyperactive transposase is tightly controlled by the Tet-ON system, widely used to control gene expression since 1992. The gene of interest is flanked by inverted repeats (IR) of the T2 transposon. Both SB components are packaged in integration defective lentiviral vectors transiently produced in HEK293T cells. Human cells, either cell lines or primary cells from human tissue, are in vitro transiently transduced with viral vectors. Upon addition of doxycycline (dox, tetracycline analog) into the culture medium, a fine-tuning of transposase expression is measured and results in a long-lasting integration of the gene of interest in the genome of the treated cells. This method is efficient and applicable to the cell line (e.g., HeLa cells) and primary cells (e.g., human primary keratinocytes), and thus represents a valuable tool for genetic engineering and therapeutic gene transfer.

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

This protocol describes a method to achieve stable integration of a gene of interest into the human genome by the transcriptionally regulated Sleeping Beauty system. Preparation of the integration of defective lentiviral vectors, the in vitro transduction of human cells, and the molecular assay on transduced cells are reported.

أسلوب نقل تتسم بكفاءة في المختبر بنظام جمال النوم ترانسكريبتيونالي الخاضعة للتنظيم في متجه تكامل لينتيفيرال معيبة وتعبئتها

The Sleeping Beauty (SB) transposon is a non-viral integrating system with proven efficacy for gene transfer and functional genomics. To optimize the SB ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

أديبو--واضحة: منديل مسح طريقة لتصوير ثلاثي الأبعاد للأنسجة الدهنية

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

An Air-liquid Interface Bronchial Epithelial Model for Realistic, Repeated Inhalation Exposure to Airborne Particles for Toxicity Testing

For toxicity testing of airborne particles, air-liquid interface (ALI) exposure systems have been developed for in vitro tests in order to mimic realistic exposure conditions. This puts specific demands on the cell culture models. Many cell types are negatively affected by exposure to air (e.g., drying out) and only remain viable for a few days. This limits the exposure conditions that can be used in these models: usually relatively high concentrations are applied as a cloud (i.e., droplets containing particles, which settle down rapidly) within a short period of time. Such experimental conditions do not reflect realistic long-term exposure to low concentrations of particles. To overcome these limitations the use of a human bronchial epithelial cell line, Calu-3 was investigated. These cells can be cultured at ALI conditions for several weeks while retaining a healthy morphology and a stable monolayer with tight junctions. In addition, this bronchial model is suitable for testing the effects of repeated exposures to low, realistic concentrations of airborne particles using an ALI exposure system. This system uses a continuous airflow in contrast to other ALI exposure systems that use a single nebulization producing a cloud. Therefore, the continuous flow system is suitable for repeated and prolonged exposure to airborne particles while continuously monitoring the particle characteristics, exposure concentration, and delivered dose. Taken together, this bronchial model, in combination with the continuous flow exposure system, is able to mimic realistic, repeated inhalation exposure conditions that can be used for toxicity testing.

Described is the cell culture and exposure method of an in vitro bronchial model for realistic, repeated inhalation exposure to particles for toxicity testing.

نموذج ظهاري لواجهة هوائية-سائلة لتعرض واقعي ومكرر للاستنشاق للجسيمات المحمولة جواً لاختبار السمية

For toxicity testing of airborne particles, air-liquid interface (ALI) exposure systems have been developed for in vitro tests in order to mimic realistic ...