이 작품은 건강 연구의 캐나다 연구소에 의해 지원되었다. CSC는 자연 과학 및 캐나다의 공학 연구위원회에서 박사 친목의 지원을받는되었다. FD는 등급 II 캐나다 연구 의자입니다.

<html> 전체 Reconstitution 프로세스 reconstitution 과정은 세제 - solubilized phospholipids의 존재에 정화 MalFGK이 컴플렉스로 ​​막 비계 단백질 (MSP)를 혼합하여 시작합니다. 단계는 바이오 비즈 나 Amberlite (그림 1)라는 흡착제 폴리스티렌 소재로 세제의 느린 제거을합니다. 자동 조립 공정 때문에 소수성 phospholipids, MalFGK이 복잡하고 MSP amphipathic 단백질의 표면 사이의 apolar 상호 작용의 가능성이 가장 높은 발생합니다. 최종 제품은 MalFGK이 복잡한 주변 MSP 포장의 두 분자로 만든 원반 모양의 입자입니다. 입자는 초 원심 분리 및 분석 크기 배제 크로마토 그래피에 의한 알데히드 부가 물 및 집계에서 구분됩니다. 입자는 기본 - 겔 전기 영동 및 동적 광 산란 분광법을 특징으로하고 있습니다. 막의 제목 &quot;&gt; 1. 준비 비계 단백질, MSP <ol><li> 자신의 태그 MSP는 (버전 MSP1D1 1) E.의 플라스미드 pMSP1D1에서 생산됩니다 대장균 37 3 시간 0.5 MM 이소 프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside와 OD 600 ~ 0.5에서 유도 BL21 (DE3) ° C. </li><li> 셀은 4시 10 분 ° C에 5,000 XG에서 원심 분리하여 수확, 100 μM의 phenylmethanesulfonyl 불화를 포함하는 TSG10 버퍼에 resuspended 있습니다. </li><li> 세포는 8,000 PSI에 프랑스 프레스 (3 배)으로 lysed하고 불용성 물질은 4 ° C.에서 10 분 동안 5,000 XG에서 원심 분리에 의해 제거됩니다 MSP를 포함하는 수용성 분율은 45 분에 125,000 XG에 초 원심 분리에 의해 분리된다. </li><li> MSP는 니켈 - 상기 킬레이트 화 크로마토 그래피는 TSG10 버퍼에 ~ 1.5 ML 니켈 세 파로스 HP를 사용하여 정화되어 있습니다. 오염 물질은 50 MM 이미 다졸을 포함하는 TSG10 버퍼로 씻어 수 있습니다. MSP는 600 MM를 포함하는 TSG10 버퍼로 용출되어이미 다졸. 정화 단백질은 TSG10 버퍼에 dialyzed와 ~ 10-15 MG / ML의 단백질 농도에서 -70 ° C에 저장됩니다. </li></ol> 2. MalFGK이 단지의 작성 <ol><li> MalFGK이 단지는 MalK의 C-말단에 자신의 태그, E.의 플라스미드 pBAD22 - FGK에서 표현됩니다 대장균 BL21 (DE3)와 37 3 시간에 0.2 % L-arabinose와 OD 600에서 ~ 0.5 유도 ° C. </li><li> 단계 1.3에서와 같이 세포 용해 및 원심 분리 후, 막 펠릿은 5 MG / ML의 최종 농도에 TSG20 버퍼에 resuspended 있습니다. 자료는 부드러운 진동과 4에 3 시간에 1 % W / V N-dodecyl-β-maltopyranoside (DDM) ° C로 solubilized 있습니다. </li><li> 불용성 물질은 단계 1.3에서와 같이 초 원심 분리에 의해 제거하고 표면에 뜨는는 solubilized을 포함하고 있습니다 MalFGK이 단지는 수집 단계 1.4에서와 같이 정화하지만, 투석하지 않고 있습니다. </li><li> FurtheR 정화는 0.5 ML / 분의 유량에서 Superdex 200 HR 3백분의 10 열 TSGD 버퍼에 겔 여과 크로마토 그래피에 의해 달성된다. </li></ol> 3. Phospholipids의 작성 <ol><li> E. 대장균 총 지방질은 클로로포름에 용해 추출하는 것은 나사 캡 microfuge 튜브 1,000 nmol aliquots로 구분됩니다. 용매는 질소의 완만 한 흐름에 따라 증발 진공 건조기에서 추가 하룻밤 건조합니다. </li><li> 지질 필름은 5 nm의 최종 농도에서 TS 버퍼에 용해하고 힘차게 vortexed와 sonicated 수 있습니다. 용해 지질 인해 수성 TS 버퍼에서의 일반 불용성으로 약간 불투명 나타납니다,하지만 그들은 정지에 남아 있어야합니다. DDM은 해결책이 분명해진다되는 0.5 % (~ 10 ㎜)의 최종 농도에 추가됩니다. </li><li> 지질 혼합물은 물 목욕에 배치 및 펄스는 ~ 5 초 동안 5 회에 sonicated 수 있습니다. 지질 혼합물은 1 꼬마의 최대 4 ° C에 저장됩니다K. </li></ol> 4. 바이오 비즈의 작성 <ol><li> 약 10-15 ML은 (드라이 볼륨) 바이오 비즈는 50 ML 튜브에 배치됩니다. </li><li> 구슬이 연속 100 % 메탄올, 95 % 에탄올, milliQ H 2 O, 그리고 마지막으로 TS 버퍼 (두 번 각)의 50 ML에 세척되어 있습니다. </li><li> 세척 구슬은 4에 저장됩니다 ° C ~ 10 ML TS 버퍼 인치 </li></ol> 5. Nanodisc의 Reconstitution <ol><li> MSP는 ~ 7 MG / ML (~ 0.3 ㎜)의 최종 농도에 TSGD 버퍼에 희석되어 있습니다. </li><li> MSP : TSGD 버퍼에 1:3:60 또는 1:3:400의 지질 비율 정화 MalFGK이 복합 ~ 2 nmol은 단백질에 혼합되어 있습니다. 최종 농도는 6 μM MalFGK 2, 18 μM의 MSP와 360 μM의 지질 (1:3:60) 또는 2.4 밀리미터 지질 (1:3:400)입니다. 최종 볼륨은 300 μl입니다. 최종 DDM 농도는 0.08 % (~ 1.6 ㎜)이다. 글리세롤의 마지막 농도가 지질의 양에 따라 달라집니다 추가 주변을 5~10% V / 대 유지 </lI&gt; <li> ~ 바이오 비드 정지의 50 μl는 튜브에 추가되고 혼합은 4 ° C.에 흔들 테이블에 하룻밤 incubated 수 있습니다 </li><li> 구슬이 중력에 의해 sedimented되며 솔루션은 가능한 한 많은 바이오 비즈를 피하기 위해 좁은 팁을 통해 pipetted 있습니다. </li><li> 침전물 대형은 20 분에 100,000 XG에 초 원심 분리에 의해 제거됩니다. 디스크는 TSG10 버퍼에 단계 2.4에서와 같이 겔 여과 크로마토 그래피에 의해 정화되어 있습니다. 디스크를 포함하는 분수는 풀링하고 나누어지는이 준비의 안정성을 테스트하기 위해 동일한 겔 여과 칼럼에 다시 주입해야합니다. </li><li> 정화 디스크는 오랜 기간 동안 -70 ° C에 저장 할 수 있습니다. 얼음에 해동 후, 디스크는 가능성이 침전물 제거하는 단계 5.5에서와 같이 초 원심 분리를 받게해야합니다. 나누어지는이 중요한 집계 나 강수량은 해동하는 동안 발생하지 않았 음을 보장하기 위해 겔 여과 크로마토 그래피에 의해 분석되어야한다과정입니다. </li></ol> 6. 기본 젤 전기 영동 <ol><li> nanodiscs 1 μM (~ 0.2 MG / ML)은 reconstitution (그림 3A)의 품질을 평가하는 기본 PAGE 6, 7 (트리스 - HCL 산도 8.8, 4-12 %)에 의해 분석됩니다. </li><li> 2 단지 MalFGK 남성과의 바인딩 (1 μM)가 nanodiscs에서 재구성은 기본 페이지 (그림 3A)에 의해 평가된다. </li><li> 전기 영동 후, 젤은 10 분에 Coomassie 파란색으로 물들어있는 것, 그리고 ~ 1 시간에 destained. </li></ol> 7. 동적 광 분산 (DL을) <ol><li> Nanodiscs는 0.1 ML / 분의 유량에서 Superdex 200 HR 300분의 10 열을 사용하여 TSG10 버퍼에 단계 2.4에서와 같이 겔 여과 크로마토 그래피에 의해 정화되어 있습니다. nanodiscs를 포함하는 분수는 풀링과 Amicon 원심 필터 ~ 10 MG / ML에 집중되어있다. </li><li> 샘플을 사용하여 DL을 분석하기 전에 (0.22 μm 필터) 두 번 필터링1 μl 내부 볼륨 석영 큐벳에서 DynaPro nanostar 악기 (와이어트 기술). 데이터는 직경과 입자의 분자량을 추정하기 위해 역학 소프트웨어 (와이어트 기술)를 사용하여이 마련되어 있습니다. </li></ol> 8. ATPase 측정 <ol><li> MalFGK 2 재구성 nanodiscs의 ATPase 활동이 colorimetric 분석 8을 사용하여 결정하고 있습니다. </li><li> 정화 디스크와 1 ㎜ ATP의 1 μM는 20 분에 대한 남성과 37 incubated ° C의 증가 금액과 함께 혼합되어 있습니다. 무기 인산염의 릴리스는 660 nm의에서 측정된다. </li><li> 출시 인산염의 금액은 인 표준 솔루션으로 생성 된 표준 곡선과 비교됩니다. </li></ol> 9. 대표 결과 nanodiscs는 겔 여과 크로마토 그래피 (그림 2A, 왼쪽)에 의해 정화되어 있습니다. 크로마토 그램은 보여줍니다 재구성 D의 대부분iscs (검은 색 추적) 하나의 피크로 elute, 반면에 과잉 지질 (빨간색 추적) 무효 볼륨의 elute로하고 폭 넓은 봉우리의 연속으로 만들어 디스크. nanodiscs의 품질은 더욱 네이티브 겔 전기 영동 및 동적 광 산란 분광법 (DL을)에 의해 분석됩니다. 지질의 과잉의 존재의 재구성 사람들은 비방 (그림 2A, 오른쪽)으로 마이그레이션 반면에 적절히 재구성 디스크는 젤에 날카로운 밴드로 마이그레이션됩니다. DL을하여 분석 디스크 인구가 11.4 nm의 (그림 2B)의 평균 직경이 균일 한 것을 보여줍니다. 재구성 디스크 DL을의 근사치에 따라 215 kDa의 명백한 분자량 있습니다. 초과 지질의 면전에서 재구성 샘플은 널리 비 균일 한 샘플에 대한 일반적인입니다, 100 nm의 주위 반경을 배포 표시됩니다. MalFGK이 단지의 품질은 ATPase의 기본 - 겔 전기 영동과 그 활동에 의해 평가된다측정 (그림 3). 말토오스 결합 단백질 남자는 MalFGK이 전송 9, 10에 높은 친 화성을 ​​바인딩합니다. 사용하지 않는 denaturing 겔 전기 영동,이 남성과 MalFGK 2 (그림 3A) 사이에 복잡한을 감지 할 수 있습니다. 수컷이 MalK이 ATPase 활동의 자극은 그림 3B에 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/3910/3910fig1.jpg" alt="그림 1"/> 1 그림. reconstitution 프로토콜에 대한 일반적인 흐름도. <img src="/files/ftp_upload/3910/3910fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. nanodisc 준비. A. 품질 관리 또는 높은 지질 비율 (1/3/400, 붉은 색 추적), nanodiscs의 젤 여과 분석 (Superdex 200 HR 3백분의 10 열)은 낮은 지질 비율 (검은 색 추적 1/3/60)에서 재구성. 동일한 디스크 준비 기본 겔 전기 영동. 몰kDa의 ecular 중량 표시가 표시됩니다. 동일한 디스크 준비 B. 동적 광 산란 분석. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3910/3910fig2large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img src="/files/ftp_upload/3910/3910fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. MalFGK 2 nanodisc 입자의 분석. A. 남성의 젤 이동 분석은 MalFGK 2 nanodisc 입자의 증가 금액과 incubated. MalFGK의 B. ATPase 활동 2 nanodisc 남성 농도의 함수로 입자.

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	<li>Denisov, I. G., Ginkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+self-assembly+of+monodisperse+phospholipid+bilayer+Nanodiscs+with+controlled+size.">Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 3477-3487 (2004).</li><li>Boldog, T., Grimme, S., Li, M., Sligar, S. G., Hazelbauer, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+separate+chemoreceptor+oligomeric+states+and+reveal+their+signaling+properties.">Nanodiscs separate chemoreceptor oligomeric states and reveal their signaling properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 11509-11514 (2006).</li><li>Bass, B. J., Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homotropic+cooperativity+of+monomeric+cytochrome+P450+3A4+in+a+nanoscale+native+bilayer+environment.">Homotropic cooperativity of monomeric cytochrome P450 3A4 in a nanoscale native bilayer environment.</a> J. Biol. Chem. 282, 7066-7076 (2007).</li><li>Alami, M., Dalal, K., Lelj-Garolla, B., Sligar, S. G., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+unravel+the+interaction+between+the+SecYEG+channel+and+its+cytosolic+partner+SecA.">Nanodiscs unravel the interaction between the SecYEG channel and its cytosolic partner SecA.</a> EMBO J. 26, 1995-2004 (2007).</li><li>Mi, L. -. Z., Grey, M. J., Nishida, N., Walz, T., Lu, C., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+structural+stability+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+in+detergent+micelles+and+phospholipid+nanodiscs.">Functional and structural stability of the epidermal growth factor receptor in detergent micelles and phospholipid nanodiscs.</a> Biochemistry. 47, 10314-10323 (2008).</li><li>Sch&#228;gger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis.">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal. Biochem. 217, 220-230 (1994).</li><li>Dalal, K., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+SecY+translocon+in+Nanodiscs.">Reconstitution of the SecY translocon in Nanodiscs.</a> Methods Mol. Biol. 619, 145-156 (2010).</li><li>Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+assay+for+nanomole+amounts+of+inorganic+phosphate.">An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate.</a> Anal. Biochem. 100, 95-97 (1979).</li><li>Davidson, A. L., Dassa, E., Orelle, C., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+evolution+of+bacterial+ATP-binding+cassette+systems.">Structure, function and evolution of bacterial ATP-binding cassette systems.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 72, 317-364 (2008).</li><li>Bordignon, E., Grote, M., Schneider, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maltose+ATP-binding+cassette+transporter+in+the+21st+century-towards+a+structural+dynamic+perspective+on+its+mode+of+action.">The maltose ATP-binding cassette transporter in the 21st century-towards a structural dynamic perspective on its mode of action.</a> Mol. Microbiol. 77, 1354-1366 (2010).</li><li>Alvarez, F. J., Orelle, C., Davidson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+reconstitution+of+an+ABC+transporter+for+use+in+electron+paramagnetic+resonance+spectroscopy.">Functional reconstitution of an ABC transporter for use in electron paramagnetic resonance spectroscopy.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 9513-9515 (2010).</li><li>Ritchie, T. K., Grinkova, Y. V., Bayburt, T. H., Denisov, I. G., Zolnerciks, J. K., Atkins, W. M., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+in+phospholipid+bilayer+Nanodiscs.">Reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayer Nanodiscs.</a> Methods Enzymol. 464, 211-231 (2009).</li><li>Gl&#252;ck, J. M., Koenig, B. W., Willbold, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+allow+the+use+of+integral+membrane+proteins+as+analytes+in+surface+plasmon+resonance+studies.">Nanodiscs allow the use of integral membrane proteins as analytes in surface plasmon resonance studies.</a> Anal. Biochem. 408, 46-52 (2011).</li><li>Wan, C. -. P. L., Chiu, M. H., Wu, X., Lee, S. K., Prenner, E. J., Weers, P. M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein-induced+conversion+of+phosphatidylcholine+bilayer+vesicles+into+nanodisks.">Apolipoprotein-induced conversion of phosphatidylcholine bilayer vesicles into nanodisks.</a> Biochim. Biophys. Acta (BBA). 1808, 606-613 (2011).</li><li>Nath, A., Trexler, A. J., Koo, P. K., Miranker, A. D., Atkins, W. M., Rhoades, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+fluorescence+spectroscopy+using+phospholipid+bilayer+Nanodiscs.">Single-molecule fluorescence spectroscopy using phospholipid bilayer Nanodiscs.</a> Methods Enzymol. 472, 89-117 (2010).</li><li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochromes+P450+in+Nanodiscs.">Cytochromes P450 in Nanodiscs.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1814, 223-229 (2011).</li><li>Zhang, X. X., Chan, C. S., Bao, H., Fang, Y., Foster, L. J., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+and+SILAC-based+mass+spectrometry+to+identify+a+membrane+protein+interactome.">Nanodiscs and SILAC-based mass spectrometry to identify a membrane protein interactome.</a> J. Proteome Res. , (2011).</li></ol>

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우리는 nanodiscs에 말토오스 수송의 reconstitution에 대한 간단한 절차를 설명합니다. 전송은 ATPase 활성 상태이며 수용성 바인딩 파트너 남성과의 상호 작용은 (그림 3) 재현 할 수 있습니다. nanodiscs에 전송의 성공 reconstitution 추가 biophysical 및 생화학 분석 방법을 엽니 다. 특히 관심 MalK ATPase 및 세제의 말토오스 수송 활동, 리포좀과 nanodiscs 체계적인 분석됩니다. ABC의 이동 장치는 전송 사?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> Amicon 울트라-4 50K 원심 필터 </td><td> Millipore </td><td> UFC805008 </td><td> 적절한 사용을 위해 제조업체의 규정을 따르 </td></tr><tr><td> 바이오 비즈 SM-2 흡착제 </td><td> 바이오 RAD </td><td> 152-3920 </td><td></td></tr><tr><td> 대장균 총 지질 </td><td> 벤티 폴라 지질 </td><td> 100500C </td><td> 클로로포름에 용해, 유기 용매에 따라 처리 </td></tr><tr><td> 니켈 세 파로스 HP 수지 </td><td> GE 헬스 케어 </td><td> 17-5268-01 </td><td></td></tr><tr><td> 인 표준 솔루션 </td><td>시그마 - 알드리치 </td><td> P3869 </td><td></td></tr><tr><td> pMSP1D1 </td><td> Addgene </td><td> 20,061 </td><td></td></tr><tr><td> Superdex 200 HR 3백분의 10 </td><td> GE 헬스 케어 </td><td> 17-5172-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 표 I. 특정 시약. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 구성 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> DDM 주식 </td><td> 10% w / V DDM </td><td> -20 ° C에서 milliQ 물과 저장소에 Resuspend </td></tr><tr><td> MalFGK이 주식 </td><td> 1-2 MG / ML 50 MM 트리스 - HCL, pH7.9 100 MM NaCl 10% 브이 / v 글리세롤 0.03 % w / V DDM </td><td> -70에서 저장 ° C 정화 후 </td></tr><tr><td> MSP 주식 </td><td> 10-15 MG / ML 50 MM 트리스 - HCL, pH7.9 100 MM NaCl 10% 브이 / v 글리세롤 </td><td> -70에서 저장 ° C &lt;1 ML의 aliquots에서 정화 이후 과도한 동결 / 해동 사이클을 방지 </td></tr><tr><td> 인지질 재고 </td><td> 5 NM E. 대장균은 지질를 집계 0.5 % w / V (10 ㎜) DDM 50 MM 트리스 - HCL, pH를 7.9 50 MM NaCl </td><td> 일주 4 ° C에서 저장 </td></tr><tr><td> TS 버퍼 </td><td> 50 MM 트리스 - HCL, pH를 7.9 50 MM NaCl </td><td> 4에 저장 ° C </td></tr><tr><td> TSG10 버퍼 </td><td> 50 MM 트리스 - HCL, pH7.9 100 MM NaCl 10% 브이 / v 글리세롤 </td><td> 4에 저장 ° C </td></tr><tr><td> TSG20 버퍼 </td><td> 50 MM 트리스 - HCL, pH8 100 MM NaCl 20% 브이 / v 글리세롤 </td><td> 4에 저장 ° C </td></tr><tr><td> TSGD 버퍼 </td><td> 50 MM 트리스 - HCL, pH7.9 100 MM NaCl 10% 브이 / v 글리세롤 0.03 % w / V DDM </td><td> 4 ° C에서 저장 불과 사용하기 전에 DDM을 추가 </td></tr><tr><td colspan="3"> 표 II. 솔루션 요리. </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

a step-by-step method for the reconstitution of an abc transporter into nanodisc lipid particles

nanodisc는 discoidal 입자 (~ 10-12 nm의 넓은)는 트랩 막 단백질 인지질 이중층의 작은 패치로.입니다 nanodisc 특히 리간드 - 수용체 상호 작용의 맥락에서, 막 단백질을 공부에 특히 매력적인 옵션입니다. 방법은 Sligar에 의해 개척 및 동료는 apolipoprotein A1에서 파생 설계 높은 - 나선형 비계 단백질의 amphipathic 특성에 기반을두고 있습니다. 극지방의 수성 환경에 직면 반면 비계 단백질의 소수성 얼굴은 지질 이중층의 지방산 아실 사이드 체인과 상호 작용할 수 있습니다. 입자가 작은 균질하고 수용성이기 때문에 nanodiscs의 막 단백질의 분석은 리포좀에 비해 상당한 장점이 있습니다. 또한, 일반적으로 수용성 단백질에 예약 생​​화학 및 biophysical 방법이 적용하고 막 양쪽에서 할 수 있습니다. 이 시각 프로토콜에서, 우리는 잘 charac의 단계별로 reconstitution을 제시terized 세균 ABC의 전송, 남성 MalFGK이 복잡. 디스크의 형성은 세제의 진보적 인 제거에있어 소수성 상호 작용에 따라 자기 조립 과정입니다. 우리는 필수적인 단계를 설명하고 우리는 집계 및 큰 polydisperse 리포좀과 같은 입자의 형성을 제한하기 위해 올바른 단백질 - 투 - 지질의 비율을 선택의 중요성을 강조 표시합니다. 간단한 품질은 디스크가 올바르게 재구성되었는지 확인 겔 여과 크로마토 그래피, 기본 겔 전기 영동 및 동적 광 산란 분광법으로 제어합니다.

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A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles

Nanodiscs는 인지질 이중층의 작은 패치로 막 단백질을 포함 작은 원반 모양의 입자입니다. 우리는 디스크에 MalFGK2 수송의 단계별 설립을 보여줍니다 시각적 프로토콜을 제공합니다.

Nanodisc 지질 입자로 ABC의 전송의 Reconstitution을위한 단계별 방법

The nanodisc is a discoidal particle (~ 10-12 nm large) that trap membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. The nanodisc is a ...

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25.4K 조회수.  University of British Columbia. Nanodiscs는 인지질 이중층의 작은 패치로 막 단백질을 포함 작은 원반 모양의 입자입니다. 우리는 디스크에 MalFGK2 수송의 단계별 설립을 보여줍니다 시각적 프로토콜을 제공합니다.

비디오: A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

방법은 시각화 및 투과 전자 현미경에 의해 막 상호 작용하는 단백질을 분석하는

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

연구

생화학

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial membrane is a challenging environment to distinguish regulatory factors. Experimental control of protein and lipid components can help answer specific questions of regulation. Yet, quantitative manipulation of these factors is challenging in cellular assays. To investigate the molecular mechanism of mitochondria inner-membrane fusion, we introduced an in vitro reconstitution platform that mimics the lipid environment of the mitochondrial inner-membrane. Here we describe detailed steps for preparing lipid bilayers and reconstituting mitochondrial membrane proteins. The platform allowed analysis of intermediates in mitochondrial inner-membrane fusion, and the kinetics for individual transitions, in a quantitative manner. This protocol describes the fabrication of bilayers with asymmetric lipid composition and describes general considerations for reconstituting transmembrane proteins into a cushioned bilayer. The method may be applied to study other membrane systems.

Mitochondrial fusion is an important homeostatic reaction underlying mitochondrial dynamics. Described here is an in vitro reconstitution system to study mitochondrial inner-membrane fusion that can resolve membrane tethering, docking, hemifusion, and pore opening. The versatility of this approach in exploring cell membrane systems is discussed.

미토콘드리아 멤브레인 역학 을 재구성하기위한 모델 멤브레인 플랫폼

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...

Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs

Cell-free expression systems allow the tailored design of reaction environments to support the functional folding of even complex proteins such as membrane proteins. The experimental procedures for the co-translational insertion and folding of membrane proteins into preformed and defined membranes supplied as nanodiscs are demonstrated. The protocol is completely detergent-free and can generate milligrams of purified samples within one day. The resulting membrane protein/nanodisc samples can be used for a variety of functional studies and structural applications such as crystallization, nuclear magnetic resonance, or electron microscopy. The preparation of basic key components such as cell-free lysates, nanodiscs with designed membranes, critical stock solutions as well as the assembly of two-compartment cell-free expression reactions is described. Since folding requirements of membrane proteins can be highly diverse, a major focus of this protocol is the modulation of parameters and reaction steps important for sample quality such as critical basic reaction compounds, membrane composition of nanodiscs, redox and chaperone environment, or DNA template design. The whole process is demonstrated with the synthesis of proteorhodopsin and a G-protein coupled receptor.

Co-translational insertion into pre-formed nanodiscs makes it possible to study cell-free synthesized membrane proteins in defined lipid environments without contact with detergents. This protocol describes the preparation of essential system components and the critical parameters for improving expression efficiency and sample quality.

막 단백질을 미리 형성된 나노디스크에 공동 번역 삽입

Cell-free expression systems allow the tailored design of reaction environments to support the functional folding of even complex proteins such as ...

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane (SSM)-Based Electrophysiology

Single domain antibodies (nanobodies) have been extensively used in mechanistic and structural studies of proteins and they pose an enormous potential as tools for developing clinical therapies, many of which depend on the inhibition of membrane proteins such as transporters. However, most of the methods used to determine the inhibition of transport activity are difficult to perform in high-throughput routines and depend on labeled substrates availability thereby complicating the screening of large nanobody libraries. Solid-supported membrane (SSM) electrophysiology is a high-throughput method, used for characterizing electrogenic transporters and measuring their transport kinetics and inhibition. Here we show the implementation of SSM-based electrophysiology to select inhibitory and non-inhibitory nanobodies targeting an electrogenic secondary transporter and to calculate nanobodies inhibitory constants. This technique may be especially useful for selecting inhibitory nanobodies targeting transporters for which labeled substrates are not available.

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane SSM-Based Electrophysiology

Nanobodies are important tools in structural biology and pose a great potential for the development of therapies. However, the selection of nanobodies with inhibitory properties can be challenging. Here we demonstrate the use of solid-supported-membrane (SSM)-based electrophysiology for the classification of inhibitory and non-inhibitory nanobodies targeting electrogenic membrane transporters.

고체 지원 멤브레인(SSM) 기반 전기생리학에 의한 수송기 표적 억제 나노체 선택

Single domain antibodies (nanobodies) have been extensively used in mechanistic and structural studies of proteins and they pose an enormous potential as ...

Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks

The term nanodisk refers to a discrete type of nanoparticle comprised of a bilayer forming lipid, a scaffold protein, and an integrated bioactive agent. Nanodisks are organized as a disk-shaped lipid bilayer whose perimeter is circumscribed by the scaffold protein, usually a member of the exchangeable apolipoprotein family. Numerous hydrophobic bioactive agents have been efficiently solubilized in nanodisks by their integration into the hydrophobic milieu of the particle&#39;s lipid bilayer, yielding a largely homogenous population of particles in the range of 10-20 nm in diameter. The formulation of nanodisks requires a precise ratio of individual components, an appropriate sequential addition of each component, followed by bath sonication of the formulation mixture. The amphipathic scaffold protein spontaneously contacts and reorganizes the dispersed bilayer forming lipid/bioactive agent mixture to form a discrete, homogeneous population of nanodisk&#160;particles. During this process, the reaction mixture transitions from an opaque, turbid appearance to a clarified sample that, when fully optimized, yields no precipitate upon centrifugation. Characterization studies involve the determination of bioactive agent solubilization efficiency, electron microscopy, gel filtration chromatography, ultraviolet visible (UV/Vis) absorbance spectroscopy, and/or fluorescence spectroscopy. This is normally followed by an investigation of biological activity using cultured cells or mice. In the case of nanodisks harboring an antibiotic (i.e., the macrolide polyene antibiotic amphotericin B), their ability to inhibit the growth of yeast or fungi as a function of concentration or time can be measured. The relative ease of formulation, versatility with respect to component parts, nanoscale particle size, inherent stability, and aqueous solubility permits myriad in vitro and in vivo applications of nanodisk technology. In the present article, we describe a general methodology to formulate and characterize nanodisks containing amphotericin&#160;B as the hydrophobic bioactive agent.

Here, we describe the production and characterization of bioactive agents containing nanodisks. Amphotericin B nanodisks are taken as an example to describe the protocol in a stepwise manner.

나노디스크를 함유하는 생리활성제의 제형 및 특성화

The term nanodisk refers to a discrete type of nanoparticle comprised of a bilayer forming lipid, a scaffold protein, and an integrated bioactive agent. ...

Lipidic Bicelles에서 ABC Transporter Membrane Proteins의 결정화

ABCG5/G8 Crystallization in a Lipidic Bicelle Environment for X-Ray Crystallography

ATP-binding cassette (ABC) transporters constitute lipid-embedded membrane proteins. Extracting these membrane proteins from the lipid bilayer to an aqueous environment is typically achieved by employing detergents. These detergents disintegrate the lipid bilayer and solubilize the proteins. The intrinsic habitat of membrane proteins within the lipid bilayer poses a challenge in maintaining their stability and uniformity in solution for structural characterization. Bicelles, which comprise a blend of long and short-chain phospholipids and detergents, replicate the natural lipid structure. The utilization of lipid bicelles and detergents serves as a suitable model system for obtaining high-quality diffraction crystals, specifically to determine the high-resolution structure of membrane proteins. Through these synthetic microenvironments, membrane proteins preserve their native conformation and functionality, facilitating the formation of three-dimensional crystals. In this approach, the detergent-solubilized heterodimeric ABCG5/G8 was reintegrated into DMPC/CHAPSO bicelles, supplemented with cholesterol. This setup was employed in the vapor diffusion experimental procedure for protein crystallization.

저자 스포트라이트: 약물 개발을 촉진하기 위한 ABC 수송체 막 단백질의 이중세포 결정화 설정 

This protocol describes a setup for the crystallization of the sterol transporter ABCG5/G8. ABCG5/G8 is reconstituted into bicelles for hanging-drop crystallization. The protocol does not require specialized materials or substrates, making it accessible and easy to adapt in any laboratory for determining the protein structure through X-ray crystallography.

X선 결정학을 위한 지질 이중세포 환경에서의 ABCG5/G8 결정화

ATP-binding cassette (ABC) transporters constitute lipid-embedded membrane proteins. Extracting these membrane proteins from the lipid bilayer to an ...

복잡한 단백질 네트워크를 위한 지질 소포 캡슐화 프로토콜

Construction of Out&#45;of&#45;Equilibrium Metabolic Networks in Nano&#45; and Micrometer&#45;Sized Vesicles

We present a method to incorporate into vesicles complex protein networks, involving integral membrane proteins, enzymes, and fluorescence-based sensors, using purified components. This method is relevant for the design and construction of bioreactors and the study of complex out-of-equilibrium metabolic reaction networks. We start by reconstituting (multiple) membrane proteins into large unilamellar vesicles (LUVs) according to a previously developed protocol. We then encapsulate a mixture of purified enzymes, metabolites, and fluorescence-based sensors (fluorescent proteins or dyes) via freeze-thaw-extrusion and remove non-incorporated components by centrifugation and/or size-exclusion chromatography. The performance of the metabolic networks is measured in real time by monitoring the ATP/ADP ratio, metabolite concentration, internal pH, or other parameters by fluorescence readout. Our membrane protein-containing vesicles of 100-400 nm diameter can be converted into giant-unilamellar vesicles (GUVs), using existing but optimized procedures. The approach enables the inclusion of soluble components (enzymes, metabolites, sensors) into micrometer-size vesicles, thus upscaling the volume of the bioreactors by orders of magnitude. The metabolic network containing GUVs are&#160;trapped in microfluidic devices for analysis by optical microscopy.

저자 스포트라이트: 합성 세포 공학의 과제 해결

We present a protocol for reconstituting membrane proteins and encapsulating enzymes and other water-soluble components in lipid vesicles of sub-micrometer and micrometer size.

나노미터 및 마이크로미터 크기의 소포에서 평형을 벗어난 대사 네트워크 구축

We present a method to incorporate into vesicles complex protein networks, involving integral membrane proteins, enzymes, and fluorescence-based sensors, ...

Nanodisc 지질 입자로 ABC의 전송의 Reconstitution을위한 단계별 방법

요약

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방법은 시각화 및 투과 전자 현미경에 의해 막 상호 작용하는 단백질을 분석하는

미토콘드리아 멤브레인 역학 을 재구성하기위한 모델 멤브레인 플랫폼

막 단백질을 미리 형성된 나노디스크에 공동 번역 삽입

고체 지원 멤브레인(SSM) 기반 전기생리학에 의한 수송기 표적 억제 나노체 선택

나노디스크를 함유하는 생리활성제의 제형 및 특성화

X선 결정학을 위한 지질 이중세포 환경에서의 ABCG5/G8 결정화

X선 결정학을 위한 지질 이중세포 환경에서의 ABCG5/G8 결정화

X선 결정학을 위한 지질 이중세포 환경에서의 ABCG5/G8 결정화

나노미터 및 마이크로미터 크기의 소포에서 평형을 벗어난 대사 네트워크 구축

나노미터 및 마이크로미터 크기의 소포에서 평형을 벗어난 대사 네트워크 구축